亚洲璃眼蜱成蜱不同发育期miR-451与MIF表达谱的动态分析

【目的】microRNA （miRNA）作为一类内源性的非编码RNA,仅有18-25 nt,其广泛存在于动植物细胞中,可诱导生物基因沉默,参与细胞生长、发育、基因转录和翻译等诸多生命活动的调控过程。以亚洲璃眼蜱为研究对象,对miR-451及其靶基因（巨噬细胞游走因子, MIF）在相互作用关系进行分析。【方法】参考miR-451成熟体序列（AAA CCG UUA CCA UUA CUG AGU UU）来自研究单元亚洲璃眼蜱高通量测序所获得的结果。根据该成熟体序列设计stem-loop及PCR引物,RT-PCR扩增获得蜱源性miR-451序列;并对不同物种来源的miR-451序列特征进行分析。基因合成方法获得抑制miR-451的dsRNA序列,用于亚洲璃眼蜱饥饿成蜱体内注射。参考美洲钝眼蜱MIF基因（登录号：AF289543.2）,设计亚洲璃眼蜱的特异性实时荧光定量引物,以β-actin作为内参基因,采用SYBR Green real-time RT-PCR方法检测注射dsRNA后亚洲璃眼蜱饥饿成蜱不同发育时间点MIF基因的表达水平,以及miR-451的表达谱特征。【结果】琼脂糖凝胶电泳检测miR-451的PCR产物条带与预期大小一致,为72 nt。不同物种来源的miR-451具有较高的保守性,特别是种子序列极度保守,仅在短尾负鼠miR-451成熟体的19位点处存在A→U的突变。miR-451的RNA干扰实验证实,0-30 h miR-451表达逐渐上调,6 h达到最高值,其拷贝数为1.0×108。随后表达丰度逐渐降低。30 h其表达水平与PBS对照组相同。48-60 h miR-451再次出现一个表达上调微小变化过程。而miR-451抑制后的MIF直到30 h才有表达的上调,42 h达到峰值（拷贝量仅为9.0×103）,此后其表达规模受到抑制,48 h时与PBS对照组水平一致。84 h后表达才逐渐上调,直到90 h达到峰值,并呈现正态分布趋势。【结论】利用RT-PCR获得亚洲璃眼蜱成蜱阶段miR-451序列,生物信息学方法分析了miR-451序列在不同物种间具有较高保守性。miRNA的保守性决定其靶标基因的特异性,因此,以上结果提示miR-451在动物细胞中可能扮演重要的生物学功能,是MIF功能发挥的一个重要调控因子。MIF作为miR-451靶标基因,其功能的实现可能受该miRNA的调控。基于此类推测qPCR及RNA干扰分析表明,miR-451参与了MIF的表达调控。且是一种负调控作用。当miR-451表达量升高时,MIF表达量明显下调。此研究首次证实miR-451在亚洲璃眼蜱成蜱发育阶段的表达是一种普遍现象,且对MIF存在负调控作用。这一研究为后期miR-451参与蜱的免疫应答及miR-451与靶标基因的相互作用机制提供了参考。同时证明,miRNA参与基因功能的调控具有一定的特异性和时序性。     

小亚璃眼蜱的鉴定及其生物学特性研究

经过一循环的饲蜱试验观察和形态学鉴定：蜱种为小亚璃眼蜱,在22-28℃,60％-85％相对湿度下室内人工饲养,证明该种蜱为三宿主蜱,完成一代需要138d,成蜱吸血期、产卵前期、产卵期分别为8.5,10.5,27.5d;卵孵化期为31.5d,孵化率为80％;幼虫吸血前期、吸血期、蜕化期分别为3.0,5.5,18.5d;若虫吸血前期、吸血期、蜕化期分别为4,10,19d;成蜱在4℃冰箱、室外模拟鼠洞保种试验成活率为80％。小亚璃眼蜱完全可以在实验室条件下大量繁殖和4℃冰箱保存。     

牛(牦牛)内寄生虫感染情况的调查及亚东璃眼蜱生活习性的观察

[目的]调查新疆疫区感染牛(牦牛)的体外寄生虫璃眼蜱优势分布种的生物学特性以及体内寄生虫的种类、感染率及危害.[方法]采用人工饲养蜱虫、寄生虫病病原(粪便)常规检查技术,进行疫区璃眼蜱优势分布种生活习性及牛(牦牛)体内寄生虫病调查.[结果]经过一循环的饲蜱试验观察和形态学鉴定:疫区璃眼蜱的优势分布种为亚东璃眼蜱,经实验室人工饲养,发现其生活史改变,74;(88/119)的幼蜱饱血后未脱落,而是蜕变为若蜱后继续吸血,由三宿主蜱变为了二宿主蜱,以上饱血若蜱蜕变期、蜕变率分别为23～33d(平均26 d)、100;;26; (31/119)的幼蜱正常饱血脱落,吸血期、蜕变期、蜕变率分别为3～9 d(平均5 d)、7～12 d(平均10 d)、83.9;(26/31).若蜱吸血期、蜕变期、蜕变率分别为6～8d(平均7 d)、25～33 d(平均29d)、88.5; (23/26);成蜱吸血期、产卵前期、产卵期、孵化期分别为4、26、20和11d.室内病原学检查结果显示:和静县巴仑台和巴音布鲁克高山草原牦牛体内寄生虫感染率分别为69.05;(29/42)、85.14;(63/74),总感染率为79.31; (92/116),且大多为混合感染,线虫感染率均高于其它寄生虫.[结论]亚东璃眼蜱是新疆优势种,可以根据其生物学习性制定相关防治措施,同时发现被检区牦牛体内寄生虫感染比较严重,急需制定切实可行的防治措施.     

绵羊胚胎不同发育阶段及其组织中MicroRNA-483-5p表达分析

[目的]研究MicroRNA(miR)483-5p在中国美利奴羊胚胎不同发育阶段肾脏和脐带组织中的表达变化,以了解其在绵羊胚胎发育中的重要作用.[方法]选择中国美利奴羊胚胎不同发育时期(45、85、115和135 d 4个时期)肾脏和脐带组织为研究材料,采用半定量RT-PCR检测第45d绵羊胚胎不同组织中miR483-5p的表达;同时利用实时荧光定量PCR对miR-483-5p在绵羊胚胎不同发育阶段肾脏和脐带组织的表达变化进行实时检测.[结果]miR-483-5p在所检测的绵羊45 d胚胎各组织中广泛表达,其中以肌肉、心脏和肺脏组织表达丰度最高.实时荧光定量PCR结果显示,不同发育阶段绵羊胚胎肾脏和脐带组织miR -483-5p的表达具有明显的时空选择性.脐带组织miR-483-5p随着胚胎发育其表达量呈逐渐下降的趋势;肾脏组织miR-483-5p则是随着胚胎发育在第85 d其表达量下降到最低,其后在115和135 d其表达量又逐渐上升.不同发育阶段胚胎肾脏、脐带组织miR-483-5p的表达量呈显著性差异(P＜0.05).[结论]miR-483-5p在绵羊胚胎不同发育阶段肾脏或脐带组织中表达明显不同,表明其表达具有选择性;依据miR -483-5p表达的差异性及其涉及的生物学功能,推测miR-483-5p在绵羊脐带和肾脏组织中具有一定的调控作用.研究为进一步了解miR-483-5p在胚胎肾脏和脐带发育中的作用机制提供一定的理论依据.     

新疆南疆部分地区3种璃眼蜱的分子生物学鉴定

旨在对新疆南疆部分地区璃眼蜱属的蜱进行分子生物学鉴定,了解其分布情况。采集新疆南疆部分地区蜱,通过形态学鉴定将璃眼蜱属蜱作为样本,通过12SrDNA和16SrDNA基因扩增、测序及序列分析进行蜱种类鉴定。13个采样点共559只璃眼蜱属蜱,鉴定为3种,分别为小亚璃眼蜱、亚洲璃眼蜱和残缘璃眼蜱。     

小鼠IL-10基因的克隆及其原核表达

从ConA活化的昆明小鼠脾细胞中提取总RNA,利用RT-PCR方法扩增得到小鼠的IL-10基因.编码序列经测序验证后,将其克隆入表达载体pET-28a,构建IL-10基因的重组原核表达载体,在大肠杆菌(DE3)中诱导表达目的蛋白.SDS-PAGE结果表明,该表达产物的分子量与预期值相符,Western blot结果说明小鼠IL-10基因得到了表达.     

猪繁殖候选基因HoxA10的克隆及表达分析

同源异形盒A10基因(Homeobox 10 gene,HoxA10)是Hox基因家族中重要一员,与子宫形态的发生,生育期子宫内膜的周期性形态发育密切相关,是与猪繁殖性状相关的重要候选基因.以长白猪为材料,采用RT-PCR方法,克隆了猪HoxA10基因,并用Real-Time PCR测定该基因在猪各组织器官中的表达.结果表明,从猪子宫组织中克隆获得HoxA10基因cDNA长538 bp,包括1个285 bp的开放阅读框,编码合成94个氨基酸残基,与人和小鼠的HoxA序列同源性分别为98.9%和97.9%;在猪各组织中,前肌是HoxA10基因表达量最高的组织,其次为肾、子宫、后肌、输卵管、大肠、腹脂等组织,在垂体、大脑、小脑、丘脑、卵巢、肺、胃、小肠、背肌、背膘中,HoxA10的表达很低或基本无表达.     

纤维亚麻LuNAC10基因克隆及表达分析

NAC作为植物特有转录因子,调控植物细胞次生壁合成。研究从高纤亚麻“Diana”中克隆得到Lu NAC10(Lus10013967)基因。通过序列分析发现,基因Lu NAC10开放阅读框总长度为978 bp,共编码325个氨基酸,蛋白分子质量为35.53 ku,其中蛋白疏水系数-0.787,为亲水性蛋白,不稳定系数38.10,属不稳定蛋白,无跨膜结构,具有单个典型NAM结构域,通过PSORT分析推测Lu NAC10蛋白定位于细胞核中。通过同源比对和聚类分析发现,亚麻Lu NAC10与拟南芥SND3蛋白（AT1G28470）进化关系最近。q RT-PCR结果表明,Lu NAC10基因表达量高峰出现在亚麻茎下部1/3处,亚麻根部及茎中部次之,叶片中表达量最低;从苗期到工艺成熟期,该基因表达量总体呈先升后降趋势,并在亚麻快速生长期表达量达到最高。该基因与参与次生壁合成的纤维素合酶基因Lu Ces A4、Lu Ces A8A表达量呈极显著正相关（P<0.01）,相关系数分别为0.989和0.987。同时,Lu NAC10基因表达量与纤维素含量呈极显著正相关（P<0.01）,相关系数...     

黄条鰤 PTEN 基因克隆、组织分布及早期发育阶段的表达分析

为探究PTEN在黄条鰤Seriola aureovittata生长发育过程中的分子作用机制,采用同源克隆和cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆了黄条鰤生长调控因子PTEN的cDNA全长序列,并采用实时荧光定量PCR(qPCR)技术分析了PTEN mRNA的时空表达特征。结果表明:黄条鰤PTEN cDNA序列全长为1575 bp,开放阅读框为1287 bp,编码428个氨基酸,PTEN编码的蛋白具有脊椎动物PTEN的共同特征,含有PTP(PTPc基序)和PTEN-C2结构域;序列比对分析发现,黄条鰤与高体鰤Seriola dumerili同源性较高,一致性达到了95%;通过系统进化树分析表明,黄条鰤与鲈形目及鲽形目鱼类聚为一支;经qPCR分析发现,黄条鰤PTEN mRNA在心脏中的相对表达量最高(P0.05),其次在脾脏、头肾、肾脏、胃、肠、鳃中表达量较高,PTEN mRNA在多种组织中的广泛表达,暗示着其可能参与多种生理过程的调控;同时分析了PTEN mRNA在黄条鰤早期发育阶段(胚胎期、仔稚幼鱼期)中的时序表达特征,发现PTEN在早期胚胎发育中持续表达,从低囊胚时期(38 hpf)表达量显著升高(P0.05),初孵仔鱼时期相对表达量最高(P0.05);在仔稚幼鱼时期,PTEN mRNA相对表达水平逐渐降低,35日龄表达量显著下降(P0.05)并保持较低表达水平。研究表明,PTEN在胚胎及仔稚幼鱼发育过程中具有重要调节作用,本研究结果可为黄条鰤早期生长发育过程的调控机制研究及苗种培育提供数据资料。     

海岛棉GbHCT10基因的克隆与表达分析

[目的]研究海岛棉(Gossypium barbadense)GbHCT10基因在棉纤维发育中的作用.[方法]以海岛棉品种新海21号纤维发育第5 d的样本作为材料,根据海岛棉GbHCT10基因序列设计一对引物,利用RT-PCR技术从中克隆GbHCT10核苷酸序列.利用生物信息学方法分析GbHCT10基因序列.[结果]采...     

地钱部分MYB家族基因在不同发育时期、部位以及激素处理下表达量差异分析

为了研究植物适应陆地生活的机制,以较原始的陆生植物地钱(Marchantia polymorpha L.)作为研究对象,分析其部分MYB(v-Myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog)家族基因在不同发育时期,不同部位以及不同激素处理下的表达量变化。构建系统进化树确认地钱与拟南芥(Arabidopsis thaliana)中MYB转录因子亚家族S14、S28和 AtCDC5 同源的基因,使用qRT-PCR对不同生长时期、组织以及激素处理下目的基因表达量进行分析。qRT-PCR分析结果表明, MpR2R3-MYB20在胞芽中表达量最高,胞芽杯中最低,且在0.1μmol/L IAA诱导下表达量显著上调; MpR2R3-MYB8在分生区高表达,激素处理下表达量变化较小;MpR2R3-MYB3和 MpCDC5在3周分生区高表达,IAA处理后下调; MpR2R3-MYB18主要在胞芽和胞芽杯中表达,且受ABA诱导大幅上调; MpR2R3-MYB16在全株中都有较高表达,在0.1μmol/L IAA处理下显著上调,在其他激素处理下显著下调。这些结果说明上述基因在地钱不同器官或组织中具有调节生长、发育和抗逆的重要功能。     

不同发育时期小鼠心肌MyoG基因的表达分析

肌细胞生成素MyoG基因一直是肌肉研究中的一个热点基因,其在肌肉中的表达水平对该肌肉的生长发育至关重要。试验通过HE染色、免疫组织化学和q PCR技术研究了不同发育阶段小鼠心肌中MyoG的表达差异。结果表明,MyoG在幼年、性成熟、体成熟和老年4个时期的小鼠心肌胞质中均有表达,且其随着年龄增长逐渐下降,尤其在老年鼠中表达显著降低。结果提示,MyoG基因在心脏中的表达与心肌生长发育密切相关。     

亲环素基因在烟草不同器官及叶片不同发育时期的表达规律研究

通过对烟草中3个亲环素家族基因(CyP1、CyP2、CyP40)表达模式的研究,结果显示:在不同发育时期中,CyP1在烟草移栽后40、50、60 d时表达量较高,CyP2则是在移栽后30、40、60 d表达量较高,而CyP40只在移栽后60 d表达量较高。在不同组织部位及器官的表达中,3个亲环素家族基因在中部叶和下部叶中表达均较强。在烟草根中主要表达CyP1和CyP40基因,CyP40还在花中表达较高,而CyP2基因的主要表达器官为叶片。     

亲环素基因在烟草不同器官及叶片不同发育时期的表达规律研究

通过对烟草中3个亲环素家族基因（CyPl、CyP2、CyP40）表达模式的研究,结果显示：在不同发育时期中,CyPI在烟草移栽后40、50、60d时表达量较高,CyP2则是在移栽后30、40、60d表达量较高,而CyP40只在移栽后60d表达量较高。在不同组织部位及器官的表达中,3个亲环素家族基因在中部叶和下部叶中表达均较强。在烟草根中主要表达CyPl和CyP40基因,CyP40还在花中表达较高,而CyP2基因的主要表达器官为叶片。     

山羊不同组织中IGFBP-5 mRNA的发育表达模式

[目的]探讨IGFBP-5基因在山羊出生后不同组织的发育性表达模式。[方法]采用荧光定量PCR,分析了出生后0、15、30、60、90和120d36只南江黄羊（公、母羔各18只）的心脏、肝脏、脾、肺、背最长肌、半膜肌、臂三头肌和股二头肌样品中IGFBP-5mRNA水平。[结果]母羔的IGFBP-5mRNA表达丰度显著高于公羔。各组织IGFBP-5mRNA表达量呈现肝脏〉肺〉脾（心脏）〉肌肉的趋势（P〈0.01）,脾与心脏间差异不显著（P〉0.01）,肌肉的表达值最低。随着日龄的增加,各组织中IGFBP-5mRNA丰度均呈现下降-上调-下降的发育性表达模式,而肝脏和肺中的表达模式具有明显的性别差异。[结论]IGFBP-5mRNA主要在内脏,尤其是肝脏中合成,但在各组织的发育性表达模式一致,性别是一个重要的影响因素。     

香稻不同发育时期香味物质的变化分析

【目的】掌握香稻整个生长发育过程中香味物质成分的变化特性,重点揭示特征香味物质 2- 乙酰 -1- 吡咯啉（2AP）在不同时期籽粒中的变化规律。【方法】采用顶空固相微萃取（HS-SPME）结合气相色谱 - 质 谱技术（GC-MS）,以美香占 2 号和象牙香占两个广东优质丝苗米为研究对象,分别采集拔节期叶片,孕穗期 颖花,孕穗期枝梗,花后 10、20、30 d 籽粒,花后 10、20、30 d 颖壳,糙米和精米等不同时期的 11 份样品进 行香味物质鉴定。【结果】两个香稻品种共鉴定出 7 类,63 种香味物质,多数样品中香味物质数量为 35~40 种, 其中 14 种化合物在所有样品中均被检出。两个品种在孕穗期香味物质种类最多、含量最丰富：美香占 2 号孕穗 期枝梗中含 43 种香味物质,其中 19 个化合物含量达峰值;象牙香占孕穗期颖花中含 42 种香味物质,其中 16 种化合物含量达峰值。花后 10 d 颖壳中含香味物质种类最少,分别为 28、27 种。2AP 在除颖壳外的其他组织中 均被检出,在叶片中含量最高,达 100~120 ng/g;随着籽粒成熟 2AP 含量呈下降趋势,美香占 2 号各时期籽粒 中 2AP 含量均低于象牙香占。糙米和精米中约含 40 种香味物质,烃类、醛类和醇类含量较高,精米中多数香味 物质含量低于糙米。1,2,4- 三甲基苯、异佛尔酮只在美香占 2 号精米中被检出,而苯乙醛、1- 辛烯 -3- 醇和 γ- 壬内酯在象牙香占精米中被特异检出,这些香味物质可能对两种米饭特征风味的塑造起重要作用。【结论】两 个香稻品种在生长过程中香味物质变化特性相似,孕穗期是香味物质积累的关键时期,随着籽粒成熟 2AP 含量 呈下降趋势,美香占 2 号各时期样品中 2AP 含量均低于象牙香占,但其精米中烃类、醛类、醇类、酮类和酯类 等多数化合物含量均高于象牙香占。     

Myogenin在不同发育阶段小鼠骨骼肌中的表达差异

Myogenin是骨骼肌生长发育过程中的重要调控因子之一。采用H.E.染色法观察小鼠骨骼肌组织不同发育阶段的形态特征,通过免疫组织化学法观察在不同发育阶段因子是否表达,并通过实时荧光定量PCR技术对Myogenin在不同发育时期的表达量进行分析,旨在研究不同发育阶段小鼠骨骼肌中Myogenin的表达差异。结果表明,Myogenin在不同发育阶段小鼠骨骼肌的表达位置均为细胞质,且在4个阶段的表达量间存在显著差异,幼年时期表达量最高。     

小鼠不同生长阶段骨骼肌组织中Myf5的表达

肌源性因子5(Myf5)是转录因子基本螺旋-环-螺旋家族的一员,它作为肌原性因子,对肌细胞的分化具有重要作用,在肌肉分化或肌细胞生成中也具有关键作用。试验分别选取幼年、性成熟、体成熟和老年期4个发育阶段的健康小鼠,采用HE染色、免疫组织化学、荧光定量PCR等方法主要研究Myf5在小鼠不同生长时期骨骼肌中的表达情况。结果显示,小鼠骨骼肌细胞核及肌纤维的生长在不同发育时期明显不同,其中,幼年小鼠的细胞核多位于细胞中央且排列较密,肌纤维的横切面近似圆形,性成熟、体成熟、老年的小鼠发育指标依次降低;Myf5主要在细胞核中表达,幼年期表达量高,老年期表达量最低;Myf5 m RNA在小鼠的不同发育阶段均有表达,但在不同阶段的表达量存在差异,其中,老年阶段的表达量最高,幼年、性成熟、体成熟阶段小鼠骨骼肌中Myf5表达水平极显著低于老年小鼠。Myf5的表达量与小鼠的生长发育阶段具有一定的相关性。