扩增SRY基因鉴定牛、羊胚胎性别的初步研究

本研究利用本试验室设计的SRY基因3对常规PCR引物扩增牛SRY基因和羊的SRY基因,结果表明：第2对引物扩增出公牛和公羊基因组的DNA 750 bp左右清晰条带,而母牛、母羊基因组DNA元此扩增条带,说明第2对引物可以应用于牛和羊的早期胚胎性别鉴定;     

扩增SRY基因鉴定牛、羊胚胎性别的初步研究

本研究利用本试验室设计的SRY基因3对常规PCR引物扩增牛SRY基因和羊的SRY基因,结果表明:第2对引物扩增出公牛和公羊基因组的DNA 750 bp左右清晰条带,而母牛、母羊基因组DNA无此扩增条带,说明第2对引物可以应用于牛和羊的早期胚胎性别鉴定;     

奶牛性别鉴定的研究与应用

选取牛雄性性别决定基因SRY (sex region of Y chromosome),根据基因序列设计特异引物,应用PCR技术对5头荷斯坦奶牛DNA样品进行扩增,鉴定其性别;并对设计的引物灵敏度进行检测;对已有的公、母各20头荷斯坦奶牛DNA样品进行PCR盲检,获取奶牛高灵敏度特异性引物,用于奶牛性别鉴定。结果表明,4头公牛DNA样品可以扩增出目标条带(66 bp),1头母牛DNA样品无法扩增出条带,阴性对照扩增无条带;最佳引物灵敏度为1.6 pg/μL,可以很好地满足性别鉴定需要。40头个体中,20头个体DNA样品可以扩增出条带,其余20头个体DNA样品无法扩增出条带,检测结果与实际性别对比准确率为100%。试验结果表明,设计的引物灵敏度比较好,能够满足奶牛性别鉴定的需要。     

牛早期胚胎性别鉴定PCR反应体系的优化研究

根据牛SRY基因序列设计合成2对巢式PCR引物作为性别鉴定引物，根据牛酪蛋白基因序列设计了一对引物作为内标引物建立了牛胚胎性别鉴定的PCR反应体系。同时对常规PCR和巢式PCR在牛早期胚胎性别鉴定中的实用性进行比较。15头公牛、13头母牛的DNA样品检测结果表明：使用巢式PCR公牛可以扩增出205bp的SRY基因片段和403bp的酪蛋白基因片段，母牛只能扩增出403bp的酪蛋白基因片段；而使用常规PCR时公牛扩增出255bp的SRY基因片段和403bp的酪蛋白基因片段，母牛只能扩增出403bp的酪蛋白基因片段，其性别鉴定结果和实际完全一致。由于巢式PCR只需10个细胞就可以在紫外透射分析仪下看到扩增结果，而常规PCR则需要20～30个细胞，所以胚胎性别鉴定时使用巢式PCR效果更好。试验采用巢式PCR鉴定了10个奶牛胚胎的性别，同时还对血清是否会对试验结果产生影响进行了研究。     

PCR扩增牙釉基因X和Y染色体不同序列鉴定牛早期胚胎性别

本实验利用牛牙釉基因特异性引物扩增牛血液、成纤维细胞和胚胎DNA,旨在优化牛早期胚胎性别鉴定的方法。结果表明:实验利用两温度PCR扩增母牛DNA样品获得1条来自X染色体458 bp产物,PCR扩增公牛DNA样品获得2条产物,其中395 bp扩增产物来自Y染色体,458 bp扩增产物来自X染色体,60头已知性别牛样品鉴定的准确率为100%。实验优化了一种两温度PCR快速鉴别奶牛及其早期胚胎性别的方法。     

牙釉质基因巢式扩增鉴定牛早期胚胎性别的研究

根据牙釉质基因在牛X染色体和Y染色体上存在的差异设计巢式引物,对牛静脉血基因组DNA样本以及10枚牛早期胚胎DNA样本进行巢式扩增和电泳分析,以鉴定性别。结果表明:利用此方法能够对牛10 pg量血液基因组DNA进行扩增鉴定性别,雌性产生1条片段长度为311 bp的源于X染色体的条带,雄性产生1条源于X染色体的条带(311 bp)和1条片段长度为251 bp的源于Y染色体的条带,对10枚胚胎进行鉴定,6枚为雄性,4枚为雌性。说明牙釉质基因巢式PCR扩增鉴定牛早期胚胎性别方法可靠,准确性和敏感性较高。     

建立全套式PCR对牛胚胎性别鉴定的方法

选择公牛Y染色体上的特异DNA序列和公母牛共有的DNA序列片段设计并合成引物，通过全套式PCR反应对公、母牛静脉血及牛胚胎进行特异性条带鉴定。结果表明，公牛出现322bp的性控条带和584bp的质控条带，而母牛仅出现584bp的质控条带。静脉血样与实际性别相符率为100％，显微切割下的5～8个胚胎细胞亦出现与静脉血样相同的特异性条带。这表明该种全套式PCR的鉴定方法准确、严谨、简便，具有很高的灵敏性和稳定性。     

鉴别牛早期胚胎性别PCR方法引物的设计与筛选

根据牛Y-染色体特异重复序列、睾丸特异蛋白基因以及性别决定基因序列设计合成5对公牛Y-染色体特异引物，依据牛骨胳肌α肌动蛋白前体基因和微卫星DNA序列设计合成4对牛DNA特异引物(内标引物)。单重PcR扩增牛基因组DNA，筛选出4对牛Y-染色体特异引物和1对牛DNA特异内标引物。将不同的Y-染色体特异引物与内标引物组合，多重PCR扩增牛基因组DNA、已知性别的牛成纤维细胞和克隆胚胎，筛选出2个可用于牛早期胚胎性别鉴别的PCR引物组合：B34／A12和B78／A12。     

不同PCR法对牛性别鉴定的影响研究

为建立一种有效的牛早期胚胎PCR性别鉴定方法,试验以12头已知性别的牛全血为试验材料,提取基因组DNA,分别运用常规PCR法、多重PCR法和巢式PCR法进行牛性别鉴定研究,用2对SRY(Y染色体性别决定区)引物和1对牛特异性引物扩增牛核基因组DNA进行牛性别鉴定,建立3种牛性别鉴定的PCR反应体系。结果表明,3种方法准确率均为100%,其中巢式PCR法检测灵敏度可达13pg,多重PCR法整个鉴定过程约需3h。     

利用TSPY基因鉴定奶牛早期胚胎性别的研究

TSPY(testis-specific protein)是Y染色体上特异的基因。公牛Y染色体上的TSPY基因的拷贝数达200个。本研究主要探讨利用TPSY基因鉴定胚胎性别的可能性。利用TSPY特异引物,通过PCR技术扩增牛血样DNA的结果为公牛血样均为阳性,母牛为阴性。结果表明,TSPY基因是一个很好的雄性特异标记。PCR扩增TSPY特异序列鉴定牛性别的灵敏度试验表明,DNA的最低需要量为20 pg/μL,提示,TSPY特异基因具有鉴定牛早期胚胎性别的可能。     

牛早期胚胎性别鉴定PCR反应体系优化的研究

根据牛SRY基因序列设计合成2对巢式PCR引物作为性别鉴定引物,根据牛-珠蛋白基因序列设计了一对引物作为内标引物建立了牛胚胎性别鉴定的PCR反应体系。公牛可以扩增出187bp的SRY基因片段和255 bp的-珠蛋白基因片段,母牛只能扩增出255 bp的-珠蛋白基因片段。由于巢式PCR只需3～8个细胞就可以在紫外灯下看到扩增结果,而常规PCR则需要较多的细胞,所以胚胎性别鉴定时使用巢式PCR效果更好。     

Sex determination by simultaneous amplification of equine SRY and amelogenin genes

A quick method for sex determination of horses was developed. Simultaneous amplification of the equine sex-determining region of the Y chromosome gene (SRY) and amelogenin gene (AMEL) accomplished the determination of the presence of both the Y chromosome and SRY gene. In agarose gel electrophoresis, a normal stallion showed 1 SRY band and 3 AMEL (AMELX, AMELY, and AMELX/AMELY heteroduplex) bands, and a normal mare showed a single AMELX band. In XY-mares, 3 AMEL bands were detected as in a normal stallion, but no SRY band. The present method enables a quick diagnosis for XY-mare prior to cytogenetic analysis.     

中国麦洼牦牛、美国荷斯坦奶牛的性别鉴定

根据中国黑白花奶牛的ZFX、ZFY基因序列设计引物ZFY1、ZFX2、ZFY3，对中国麦洼牦牛、美国荷斯坦奶牛ZFX、ZFY基因片段进行PCR体外扩增和性别鉴定。结果显示：ZFY1、ZFX2引物对ZFX、ZFY都能扩增出一条652bp片段；ZFY基因特异性引物ZFX2、ZFY3只能对雄性扩增出一条359bp的片段；特异性引物ZFX2、ZFY3能对中国麦洼牦牛、美国荷斯坦奶牛进行性别鉴定。     

鉴定牛体外培养胚胎性别的一种新PCR方法及其应用

根据已知序列设计了2对引物,分别在体外扩增SRY基因及1个常染色体基因,能同时扩增出2个基因的胚胎为雄性,只能扩增出常染色体基因的胚胎为雌性。通过该方法对50个卵母细胞进行PCR验证,有49个扩增出1条常染色体基因,准确率为98％;鉴定了48枚用普通精液受精所得胚胎及57枚用经SRY抗体处理的精液受精所得胚胎的性别,雌性比例分别为56％和82％。     

A single blastomere sexing of caprine embryos by simultaneous amplification of sex chromosome-specific sequence of SRY and amelogenin genes

The primary objective of this study was to develop a simplified, rapid and authenticated protocol for sexing of caprine embryos. Polymerase chain reaction (PCR) is a powerful tool in preimplantation sex diagnosis, using embryo biopsy at the early developmental stage. Based on the amelogenin gene located on the conserved region of the sex chromosome, a primer pair was used and PCR was established to amplify a 262-bp fragment from the Xchromosome in female goat embryos and 262-bp fragments from the X chromosome and 202-bp fragments from the Y chromosome in male embryos. To validate the reliability of PCR, using the sex-determining region Y (SRY) gene located on the conserved region of Y chromosome, a primer pair was used and PCR was established to amplify a 122-bp fragment specific to the Y chromosome in male embryos. The in vitro-produced goat in vitro fertilisation (IVF)-embryos were made zona free by treating with pronase. The cell number in each embryo was counted before sexing. A single blastomere taken from these embryos was directly used as a template in PCR containing SRY and amelogenin gene-specific primers separately. Of 75 pronase-treated and 60 micromanipulated goat IVF embryos, 33 (44%) and 26 (43.33%) were confirmed as male and 42 (56%) and 34 (56.66%) as female, respectively. The sex-diagnosed embryos were kept in research vitro cleavage (RVCL) medium, and developed into 42.66% and 61.66% morulae and 13.33% and 23.33% blastocysts among pronase-treated and micromanipulated embryos, respectively. The AMELX gene-specific primer served as the internal control and did not interfere with amplification of the Y-specific sequence. In conclusion, a single blastomere sexing protocol based on the SRY and the amelogenin gene is simple, rapid, sensitive and efficient for sex determination in caprine early stage embryos.     

奶牛体外受精胚胎的性别控制研究

为加速母牛胚胎的生产,实现性控制胚胎产业化和体外扩繁优质品种的奶业工程发展,本研究在体外受精技术（in vitro fertilization,IVF）不断成熟和完善的基础上,通过对牛非性控IVF胚胎与常规人工受精体内胚胎移植的妊娠成功率及其两者出生后牛的性别比例进行比较分析,结果发现,两组妊娠成功率基本相同,且IVF胚胎出生的公牛比例高于体内胚;采用性控和非性控精液进行IVF试验,并对非性控IVF胚胎及性控IVF胚胎用牛Y染色体性别决定特异基因（SRY）核心序列进行分子生物学性别鉴定,结果显示,性控IVF胚胎的公牛比例显著低于普通IVF胚胎;此外,作者还比较了性控IVF与普通非性控IVF的囊胚发育率,结果显示两者并无显著差异。以上研究结果证明,体外扩繁优质良种母牛的奶业工程必须依靠性别控制体外授精技术来提高其效率和有效性。     

细菌通用引物在奶牛乳房炎病原菌检测中的作用研究

为了建立PCR直接检测奶牛乳房炎致病菌的方法,探索通用引物在奶牛乳房炎致病菌检测中的应用价值。利用16S rRNA基因的高度保守性,设计并合成细菌的通用引物,采用合成的引物扩增标准菌株及患有奶牛乳房炎的奶样。结果表明,通用引物扩增7 种标准菌株,370 bp处均可得到清晰的电泳条带;通用引物PCR 可检出250 ng/L的金黄色葡萄球菌标准菌株DNA;对患有奶牛乳房炎的奶样进行扩增,370 bp处也得到了清晰的电泳条带。建立在16S rRNA基础上的通用引物在奶牛乳房炎的检测中,初步显示具有特异、快速等优点,为进一步判断细菌的种类奠定了基础。