山羊表皮干细胞分离纯化的研究

表皮干细胞（epidermal stem cells,ESCs）干细胞特性的维持是干细胞内在属性和微环境共同作用的结果,体外长期培养ESC的关键是维稳定的微环境。实验将组织块脱出的细胞经分次消化和IV型胶原快速贴附分离出表皮干细胞,在含20%条件培养基的无血清培养液进行培养。原代细胞表现K19阳性,并且能形成PGC集落样细胞团。从表皮和真皮组织中均可得到上皮样细胞,经纯化后均表现出明显的表皮干细胞特性：呈片状生长,铺路石样形态。将两类细胞分别传至5代和8代,后代细胞β1整合素染色呈阳性。对5代和8代细胞分别进行克隆分析实验,其克隆形成率分别为18.5%和8.5%。实验证明组织块法能够得到较好的维持ESC的微环境,所分离的ESC具有干细胞特性并能稳定传代。     

辣椒WRKY转录因子候选基因的瞬间表达分析

从辣椒cDNA文库中克隆获得一个推定的WRKY（CaWRKY）转录因子,为分析其功能,分别构建启动子区含有双倍W（2W）盒的报告载体和WRKY置于2x35S启动子控制下的超表达载体,通过基因枪瞬间转化技术将两种载体共转化洋葱表皮。检测共转化细胞中GUS基因的表达情况来分析转录因子与特定顺式作用元件的结合及对其转录的激活效应。结果表明CaWRKY能与W盒结合,表明该基因是WRKY转录因子的编码基因。     

橡胶树原生质体的分离及红色荧光蛋白的瞬时表达研究

目的：分离巴西橡胶树松散愈伤组织原生质体,建立目标基因在橡胶原生质体的瞬时表达系统。方法：以巴西橡胶树松散愈伤组织为材料,酶解分离原生质体,通过电击介导的转化方法,将编码红色荧光蛋白（RFP）的植物表达载体转入原生质体中,用激光扫描共聚焦显微镜检测原生质体中RFP的表达情况。结果：分离出大量高纯度的橡胶原生质体,成功获得转基因原生质体细胞,RFP在原生质体中得到成功表达。初步建立了橡胶原生质体瞬时表达系统。     

纳豆激酶的保健功能及分离提取技术研究

纳豆激酶来源于传统食品纳豆中,有很强的溶血栓能力。纳豆激酶的保健功能与其生化特性和酶的活性、功能机理有关。与传统的一些溶栓药物相比,纳豆激酶具有安全性好、成本低及可以口服等优点。良好的分离纯化技术是开发纳豆激酶保健品的关键。     

小麦转录因子基因TaMYB70的分离和表达分析

为了探究小麦MYB转录因子基因TaMYB70的功能,采用同源克隆方法分离TaMYB70（MK024291）基因cDNA序列,运用生物信息学手段分析该基因序列特征,采用实时荧光定量反转录PCR（qRT-PCR）检测其在不同逆境胁迫下的表达模式。结果表明,分离得到的TaMYB70部分序列长度为1 272bp,包含一个长度为1 008bp的开放阅读框,编码335个氨基酸残基。TaMYB70蛋白含有2个螺旋-转角-螺旋结构的Myb-type HTH DNA结合结构域。TaMYB70氨基酸序列与粗山羊草、二穗短柄草等植物MYB44同源性较高,与拟南芥R2R3-MYB转录因子第22亚族成员属于同一分支。qRT-PCR分析表明,TaMYB70在脱落酸胁迫下表达量升高,在PEG和NaCl胁迫下表达量下降,该转录因子可能参与小麦逆境胁迫应答。     

茶树功能基因分离克隆研究进展

茶叶是世界上最流行的无酒精饮品之一,具有许多生理保健作用。在包括中国在内的许多国家,茶树是重要的木本经济作物之一,它含有许多有价值的次生代谢产物。最近十多年来,茶树分子生物学研究是茶叶科学中最活跃和进展最快的一个领域。分离和克隆重要的茶树功能基因,对揭示茶树优质、高产和抗逆的分子机理,对采用基因工程技术进行茶树遗传调控等都有重要意义。本文介绍了茶树功能基因分离克隆的研究进展,并对今后茶树功能基因的研究提出了展望。     

野生大豆转录因子GsNAC20基因的分离及胁迫耐性分析

NAC (NAM, ATAF1/2, CUC2)转录因子作为一类新型转录因子已成为非生物胁迫基因工程领域的研究热点。本研究以野生大豆(Glycine soja)为材料,利用酵母单杂交的方法筛选到一个能够与MYB1AT元件(核心序列为AAACCA)结合的转录因子基因,该基因与大豆NAC20 (EU440353.1)基因具有99%的相似性,命名为GsNAC20。GsNAC20蛋白含有典型的NAC结构域和转录激活区。酵母试验表明,GsNAC20转录因子能够与耐逆相关顺式元件MYB1AT特异结合,但不具有自激活功能。细胞定位分析证明该基因位于细胞核中,符合转录因子的特征。GsNAC20能够响应高盐、干旱和低温胁迫,并且在根和叶中具有不同的表达模式。超量表达GsNAC20基因的拟南芥对盐胁迫的敏感性提高。以上结果表明GsNAC20参与植物非生物胁迫反应过程,该基因在非生物胁迫基因工程研究领域具有良好的理论研究和实际应用价值。     

拟南芥转录因子AtOFP19功能的初步研究

AtOFP19是植物中特有的蛋白质,是拟南芥卵形家族蛋白(AtOFPs)新发现的成员之一.为确定AtOFP19在植物体中的特定作用,采取PCR克隆方法,获得了AtOFP19基因,并利用生物信息学的方法对AtOFP19基因进行分析.采取农杆菌介导法浸染野生型拟南芥,获得35S:HA-AtOFP19转基因植株.对比35S:...     

大麦气孔发育转录因子基因HvMUTE的克隆及生物学功能初步鉴定

为了对大麦气孔发育转录因子基因HvMUTE的功能进行初步鉴定,并对其生物学特性及表达模式进行分析,通过生物信息学分析、PCR扩增及qRT-PCR等方法来对大麦气孔发育转录因子基因HvMUTE进行研究。由于大麦G1614为大麦MOREX品种的姊妹系,且大麦MOREX品种公布了参考基因组数据,所以通过将短穗二柄草BdMUTE基因同大麦G1614基因组进行序列同源比对,得到大麦HvMUTE基因序列。从大麦材料G1614幼芽中的第1片叶片中取样,克隆得到大麦HvMUTE基因651 bp的编码区。生物信息学分析结果表明,HvMUTE蛋白是位于细胞核中的无明显亲水疏水性的不稳定蛋白质,并且其蛋白质三维结构含有螺旋-环-螺旋(HLH)结构。系统进化树分析结果表明,HvMUTE蛋白同小麦和山羊草的MUTE-Like蛋白亲缘关系较近。qRT-PCR结果显示,在干旱条件下,HvMUTE基因表达量无明显变化,这一结果同前人研究有所不同,猜测与大麦为单子叶植物,气孔结构中存在副卫细胞同双子叶植物气孔结构形态不同有关。     

拟南芥硫代葡糖苷酶基因TGG1的克隆、表达和酶学特性

本研究克隆拟南芥硫代葡糖苷酶基因TGG1,利用毕氏酵母表达。重组蛋白用镍亲和柱纯化,获得高纯度芥子酶。重组蛋白分子量78 kD,与天然TGG1分子量接近,为糖基化蛋白。TGG1信号肽在酵母中具有分泌功能,约25%芥子酶分泌到培养基中。TGG1重组蛋白具有广泛的pH适应性,最适反应温度40℃左右。其活性被低浓度维生素C激活,被高浓度维生素C抑制。用Hanes plot方法计算TGG1重组蛋白以Sinigrin为底物时,Km为65μmol/L,最大反应速率Vmax=3.28μmol.min-1.mg-1。     

拟南芥尿黑酸叶绿醇转移酶(HPT)基因启动子的分离及表达特性分析

尿黑酸叶绿醇转移酶（HPT）是催化生育酚生物合成分支途径中的关键酶,催化叶绿醇焦磷酸（phytyl-PP）与尿黑酸（HGA）缩合生成生育酚的前体。从拟南芥中分离HPT基因的启动子序列946 bp,构建了该启动子与GUS嵌合的重组载体,通过农杆菌介导转化拟南芥,取正常生长条件下的拟南芥转基因植株进行GUS组织化学染色,结果表明,在HPT启动子的驱动下,GUS基因主要在转基因拟南芥的根中高表达,在成熟叶片、花丝、雌蕊中也有一些表达,而在茎、根尖、花药、种荚及发育的种子中则未表达,可见该启动子为根优势表达启动子。     

Sexual transfer of Arabidopsis DNA to Brassica napus

Out of 400 reciprocal crosses made between Brassica napus and Arabidopsis thaliana, 200 maternal B. napus flowers produced 31 seeds and 10 seeds developed when A. thaliana was used as the female parent. Of the latter, three seeds successfully germinated but did not develop into mature plants. In contrast, plants from all 32 seeds generated from B. napus were established. DNA from these 31 plants was analysed by 18 probes mapped to the A. thaliana genome, two selectable marker genes and one A. thaliana species-specific repetitive probe. It was found that one plant had identical restriction fragments to A. thaliana with two of the 21 probes used. The gene flow within Brassicaceae is discussed in light of this result.     

油菜油体钙蛋白基因BnClol的克隆和表达

应用同源序列克隆法设计同源简并引物,结合RT-PCR和RACE-PCR技术.从甘蓝型油菜中分离克隆了编码28.1 kD油体钙蛋白(caleosin)的基因BnClol.其全长1 058 bp的BnClol mRNA(GenBank中序列号为AY966447)包含完整的开放阅读框和3'末端Poly(A)尾巴结构,染色体DNA结构上含6个外显子和5个内含子.Northern杂交结果表明,油菜中BnClol在种子形成中期开始丰富表达,在种子形成后期,即种子开始脱水成熟时期,高量稳定地表达.半定量PCR结果显示,BnClol在油菜种子吸水膨胀后前2d的茎中明显表达.证明在油菜种子发育期间,BnClol对mRNA的转录表达是由胚胎发育来调控的.具有显著的时空特性,并与油体的形成和积累密切有关.推测的caleosin蛋白为245个氨基酸残基(GenBank中序列号为AAY40837)组成的两性蛋白质,主要含3个结构域即由N末端1～16位氨基酸残基组成的a-螺旋和17-61位氨基酸残基组成的强亲水性的随机卷曲构成的N-末端亲水性结构域;由80-120位氨基酸残基组成的中间疏水性结构域和C-末端亲水性结构域.N-末端亲水性结构域包含一个潜在的结合Ca2 的EF-手结构.中间疏水性结构域包含一个潜在的脯氨酸-结(proline-knot)模体,在92～114位氨基酸残基组成的a-螺旋跨膜区域,推测在caleosin蛋白与单层磷脂层和油体锚定结合上及增加种子油体的稳定性上起着重要的作用.     

线粒体nad 6基因在油菜种子发育中的特异性表达

以油菜为材料,研究线粒体ｎａｄ６基因在种子发育中的表达。结果表明,ｎａｄ６基因在叶片中的表达很低,在种子发育过程中各阶段均有较高表达,并随种子发育进程而有加强的趋势。推测线粒体ｎａｄ６基因可能除与呼吸作用有关外还有其他功能     

油菜油体钙蛋白基因BnClo1的克隆和表达

应用同源序列克隆法设计同源简并引物,结合RT-PCR和RACE-PCR技术从甘蓝型油菜中分离克隆了编码28.1 kD油体钙蛋白( caleosin)的基因BnClo1。其全长1 058 bp的BnClo1 mRNA( GenBank中序列号为AY966447)包含完整的开放阅读框和3＇末端Poly( A)尾巴结构,染色体DNA结构上含6个外显子和5个内含子。Northern杂交结果表明油菜中BnClo1在种子形成中期开始丰富表达,在种子形成后期,即种子开始脱水成熟时期,高量稳定地表达。半定量PCR结果显示BnClo1在油菜种子吸水膨胀后前2 d的茎中明显表达。证明在油菜种子发育期间,BnClo1对mRNA的转录表达是由胚胎发育来调控的,具有显著的时空特性,并与油体的形成和积累密切有关。推测的caleosin蛋白为245个氨基酸残基( GenBank中序列号为AAY40837)组成的两性蛋白质,主要含3个结构域即由N末端1~16位氨基酸残基组成的α-螺旋和17~61位氨基酸残基组成的强亲水性的随机卷曲构成的N-末端亲水性结构域;由80~120位氨基酸残基组成的中间疏水性结构域和C-末端亲水性结构域。N-末端亲水性结构域包含一个潜在的结合Ca²⁺的EF-手结构。中间疏水性结构域包含一个潜在的脯氨酸-结( Proline-Knot)模体,在92~114位氨基酸残基组成的α-螺旋跨膜区域,推测在caleosin蛋白与单层磷脂层和油体锚定结合上及增加种子油体的稳定性上起着重要的作用。     

甘蓝型油菜防御素基因的克隆与生物信息学分析

为了研究甘蓝型油菜防御素基因的结构和功能,根据白菜防御素基因序列设计引物,采用RT-PCR方法从甘蓝型油菜中克隆到4个防御素基因,并对其序列进行了生物信息学分析。结果表明,甘蓝型油菜防御素基因cDNA全长325~335 bp,包含231~243 bp的开放阅读框,编码76~80个氨基酸;防御素基因在长期进化过程中产生了显著的差异,但防御素含有的8个保守半胱氨酸残基均稳定存在;Bndef1、Bndef2、Bndef3与萝卜Rs-AFP1、诸葛菜Omdef亲缘关系较近,Bndef4与豇豆Vudef亲缘关系较近;4个防御素蛋白均为稳定蛋白,具有信号肽结构,可能为分泌蛋白。     

甘蓝型油菜LPAT4基因的克隆与表达

植物溶血磷脂酸酰基转移酶(lysophospholipid acid actyltransferase, LPAT)是三酰甘油生物合成过程中的一个关键酶, 在脂质的合成、种子的发育以及生物膜的流动性等方面有重要作用。本研究采用同源克隆的方法, 获得LPAT4基因的2条全长CDS序列, 长度分别为1143 bp和1140 bp。生物信息学分析表明, 它们均具有LPLAT_LCLAT1样结构域, 同属于LPLAT超基因家族, 并分别被命名为BnLPAT4-1和BnLPAT4-2。时空表达分析表明, 它们均为组成型表达基因, 其中BnPAT4-1在叶中的表达量最高, 而BnPAT4-2在胚中的表达量最高。逆境分析表明, BnLPAT4-1和BnLPAT4-2在NaCl、PEG-4000、水渍、6BA和ABA的胁迫下呈现出不同的表达模式。极差分析显示, ABA对BnLPAT4-1的表达影响较大, 而BnLPAT4-2的表达却对PEG4000更敏感。为进一步研究油菜BnLPAT4基因功能奠定了基础。     

海岛棉DELLA蛋白编码基因GbGAI的克隆与功能初步分析

赤霉素在棉花纤维发育过程中起着重要作用。DELLA蛋白是赤霉素信号传导通路中的一类重要负调节因子。通过同源克隆的方法,克隆了新疆特有棉花栽培种海岛棉中DELLA蛋白的同源基因GbGAI。序列比对分析表明GbGAI编码的氨基酸序列具有DELLA蛋白的典型结构域。构建其过量表达载体,通过农杆菌侵染花序的方法转入野生型拟南芥中,观察表型。转基因株系表现出晚花,株高变矮等赤霉素不敏感突变体的表型。     

拟南芥逆境胁迫诱导表达基因rd29A启动子的克隆与序列分析

以拟南芥基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到逆境胁迫诱导表达基因rd29A的启动子片段,将其克隆到pUC19质粒中进行序列分析。结果表明,获得的启动子片段大小为937bp,与已报道的该启动子序列比较,其核苷酸序列同源性为99．8％。