兔支气管败血波氏杆菌的分离与16SrRNA鉴定

雅安市某兔场饲养的部分种兔发生一种以打喷嚏、流鼻涕、精神不振、呼吸困难、鼻孔出现粘液性或脓性分泌物为主要特征的传染病。通过对送检病兔病原的分离培养、形态染色观察、生化鉴定和半套式PCR反应确诊为兔支气管败血波氏杆菌感染,通过药物敏感实验筛选出了敏感药物。同时建立了快速鉴定兔支气管败血波氏杆菌的方法。     

副猪嗜血杆菌的分离及实验室检测方法

副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPs)引起猪的多发性浆膜炎与关节炎,以纤维素性多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎为特征。近年来该病的发生,给养殖业造成巨大的经济损失。文章介绍了副猪嗜血杆菌的临床症状、解剖变化、细菌分离并综述相关的实验室检测方法。为防治该病提供参考。     

副猪嗜血杆菌分型方法的研究

副猪嗜血杆菌是存在于猪上呼吸道的正常菌,在特定条件下会引发猪的副猪嗜血杆菌病,该病以多发性浆膜炎、关节炎及高死亡率为特征,给养猪业带来了巨大经济损失。传统的血清分型法只能将副猪嗜血杆菌分为15个血清型,但还有20以上的分离株不能进行分型。随着分子生物学技术的不断应用,副猪嗜血杆菌的鉴定、分型的研究已取得了一些进展,文章综述了近年来副猪嗜血杆菌的分型研究状况供相关技术人员参考。     

杀鲑气单胞菌杀鲑亚种和杀日本鲑亚种PCR检测方法的建立

杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)是一种重要的鱼类致病菌,可以感染多种海淡水鱼类。杀鲑气单胞菌包括5个亚种,目前常用的生理生化特征和16S rDNA序列分析方法很难实现亚种的快速精确区分。为实现杀鲑气单胞菌亚种的快速鉴定和检测,针对我国常见的杀鲑气单胞菌杀鲑亚种(A. salmonicida subsp. salmonicida)和杀日本鲑亚种(A. salmonicida subsp. masoucida),本研究开发了其特异性的PCR检测方法。根据Gene Bank已公布的杀鲑气单胞菌基因组信息,选择杀鲑亚种phoB基因和杀日本鲑亚种LOC111476736基因作为目标基因,根据其序列设计特异性引物,进一步对PCR反应的退火温度、引物浓度、dNTPs浓度、Mg2+浓度和酶浓度5个方面进行了优化,并测试了该方法的特异性、敏感性和应用效果。结果显示,2对引物分别可以扩增出杀鲑气单胞菌杀鲑亚种522 bp的phoB特异性基因片段和杀日本鲑亚种515 bp的LOC111476736特异性基因片段。杀鲑亚种特异性引物最适退火温度为64 ℃,10 µmol/L引物、2 mmol/L dNTPs、25 mmol/L MgSO4和1 U/µL KOD酶的最适添加量分别为1.5、2、1.5和0.5 µL。杀日本鲑亚种特异性引物最适退火温度为64 ℃,10 µmol/L引物、2 mmol/L dNTPs、25 mmol/L MgSO4和1 U/µL KOD酶的最适添加量分别为0.75、1、1.5和0.5 µL。以鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、美人鱼发光杆菌(Photobacterium damselae)、杀鱼爱德华氏菌(Edwardsiella piscicida)、杀鲑气单胞菌其他亚种等14种其他水产病原菌或常见环境菌为模板进行PCR检测,均无特异性条带。该方法对杀鲑气单胞菌杀鲑亚种的检测灵敏度为12.8 CFU/反应(菌体)或17.6 fg/反应(DNA),对杀鲑气单胞菌杀日本鲑亚种的检测灵敏度为23.8 CFU/反应(菌体)或27.2 fg/反应(DNA)。利用杀鲑气单胞菌杀鲑亚种和杀日本鲑亚种分别对大菱鲆(Scophthalmus maximus)进行人工感染实验,感染后取病鱼组织进行PCR检测,结果显示,本方法可以从感染后的大菱鲆中分别检测到相应病原。综上所述,本研究建立了杀鲑气单胞菌杀鲑亚种和杀日本鲑亚种的特异性PCR检     

杀鲑气单胞菌的实时定量PCR检测方法的建立和应用

选取杀鲑气单胞菌A层A蛋白(VapA)保守序列,利用Primer Express2.0软件设计引物和探针.以ATCC标准株10倍系列稀释,通过血球计数板计数后进行实时定量PCR,制作标准曲线.通过SDS软件获得细菌数量(X)与Ct值的关系为:Ct＝-3.1574lgX 43.6841(相关系数R2=0.992).实时定量PCR的检测限为6个细菌.建立的方法对杀鲑气单胞菌典型株和非典型株具有较好的特异性,与其他细菌没有交叉反应.杀鲑气单胞菌实时定量PCR方法的建立,对于快速口岸检疫、临床诊断和疫病监测具有重要的应用价值.     

猪圆环病毒2型PCR检测方法的建立

根据猪圆环病毒2型(PCV2)的基因序列,设计一对能特异性扩增PCV2ORF2基因的引物,通过对PCR方法的优化,建立了快速的PCR检测方法用于病料中PCV2感染的检测。用本方法对猪瘟病毒(HCV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病毒(PRV)进行了扩增,均未有条带出现,表明该方法具有良好的特异性;敏感性试验表明,该方法能够检测到的最低DNA模板浓度为1.0×10-5ng/μL;重复性试验表明,该方法具有良好的稳定性。     

同时检测两种对虾病毒和4种弧菌的同步PCR方法的建立

通过检索、多重比对、分析和筛选GenBank中对虾白斑综合征病毒(WSSV)、传染性皮下和造血器官坏死病毒(IHHNV)、副溶血孤菌、创伤弧菌、哈维氏弧菌和溶藻胶弧菌的基因序列,设计了10对特异性引物,以已知毒株和菌株的DNA为模板进行PCR,均能扩增出与实验设计相符合的DNA片段,对PCR扩增条件进行优化,建立了可同时检测鉴别WSSV、IHHNV、副溶血弧菌、创伤弧菌、哈维氏弧菌和溶藻胶弧菌,并且能同时区分WSSV不同地理毒株的同步PCR方法.研究结果表明,该方法检测特异性好,检测通量大,适合于对虾多种病原的同时检测.     

多杀性巴氏杆菌体内表达基因的研究进展

多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)是引起多种畜禽巴氏杆菌病的致病菌。近年来,多杀性巴氏杆菌体内表达基因的筛选研究已经成为国内外研究的热点之一。本文就多杀性巴氏杆菌体内表达基因的研究进展进行了简要的阐述。     

龟致病性维氏气单胞菌和鲍曼不动杆菌双重PCR检测方法的建立

应用2对特异性引物,通过对反应条件和体系的优化,成功建立了能快速检测维氏气单胞菌和鲍曼不动杆菌两种病原的双重PCR方法。研究结果表明,该方法特异性强,仅对龟鳖维氏气单胞菌和鲍曼不动杆菌有扩增,而对其他龟鳖常见病原无扩增;该方法对维氏气单胞菌最低检测核酸质量浓度为1.75×10-3 ng/μL,对鲍曼不动杆菌最低检测核酸质量浓度为3.96×10-3 ng/μL,检出率较传统检测方法高。该研究所建立的双重PCR方法灵敏度高、特异性好,可为临床龟鳖维氏气单胞菌和鲍曼不动杆菌感染的诊断和流行病学调查等提供帮助。     

食品中牛源性成分荧光PCR检测方法的建立

目的:建立荧光PCR方法检测食品中牛源性成分。方法:本研究以牛线粒体保守基因序列设计特异性引物和探针,建立牛源性成分荧光PCR检测方法;并对方法特异性、灵敏度和稳定性进行评估。结果:该方法能够有效对牛源性成分进行快速检测,具有较的特异性强,灵敏度较高(检出限为0.0001%)。结论:该方法特异性强,灵敏度高,可以快速、准确检测畜肉食品中含有的牛源性成分。     

大鲵虹彩病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

利用PCR技术扩增出大鲵虹彩病毒(giant salamander iridovirus, GSIV)主要衣壳蛋白(MCP)编码区长度为1 392 bp 的片段, 克隆到 pMD19-T载体上, 构建重组质粒 pMD19-T-MCP。经PCR鉴定确认正确后, 以10倍梯度稀释 pMD19-T-MCP重组质粒, 作为标准模板进行 TaqMan实时荧光定量PCR扩增, 制作标准曲线, 建立了大鲵虹彩病毒的 TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。制作的标准曲线有极好的线性关系, 且线性范围宽, 相关系数为0.990 19。组内重复试验的CT值标准偏差为0.52%。检测结果显示, 该方法对大鲵虹彩病毒的检测有高度的特异性, 与锦鲤疱疹病毒、弗氏柠檬酸杆菌、嗜水气单胞菌以及鲤上皮瘤细胞基因组DNA之间均无交叉反应, 特异性好, 检测总DNA灵敏度为10个病毒核酸分子拷贝数, 约1.1×10-3 pg/μL病毒核酸, 较之常规PCR的敏感度高出约1 000倍。研究建立的大鲵虹彩病毒TaqMan实时荧光定量PCR方法灵敏度高、特异性强, 对大鲵虹彩病毒病的快速诊断与病毒病原定量检测有重要意义。     

草鱼呼肠孤病毒Taq Man real-time PCR检测方法的建立

利用RT-PCR技术扩增出草鱼呼肠孤病毒(GCRV)VP6蛋白编码区长度为1 250 bp的片段,克隆到pEGFP-N1载体上,构建重组质粒pEGFP-N1-VP6。经PCR鉴定确认正确后,以10倍梯度稀释pEGFP-N1-VP6重组质粒,作为标准模板进行TaqMan real-time PCR扩增,制作标准曲线,建立了草鱼呼肠孤病毒的荧光定量PCR检测方法。检测结果显示,标准曲线的相关系数(R²)达到0.998 09,斜率为-3.373;对初始模板定量检测的范围为1×10¹～1×10⁶ copies/μL;特异性试验结果表明,该方法可特异性地检测出草鱼呼肠孤病毒,而对鲤春病毒血症病毒(SVCV)、传染性造血器官坏死症病毒(IHNV)无检测信号。本研究建立的草鱼呼肠孤病毒Taq Man real-time PCR方法灵敏度高、特异性强,可进行定量分析,对草鱼出血病快速诊断与病毒病原定量检测有重要意义。     

青虾源维氏气单胞菌双重PCR检测方法的建立

根据NCBI已发表的维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)促旋酶B亚单位基因gyrB和编码细菌RNA聚合酶σ70因子基因rpoD的保守序列设计引物,建立了一种快速检测青虾源维氏气单胞菌的双重PCR检测方法。结果显示:青虾源维氏气单胞菌gyrB和rpoD基因PCR扩增产物大小分别为815 bp、554 bp,而对嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)、哈维弧菌(Vibrio harveyi)、副溶血性弧菌(Vibrio parahemolyticus)、需钠弧菌(Vibrio natriegens)、非O1霍乱弧菌(non-O1 Vibrio cholerae)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)扩增结果皆为阴性;灵敏性试验结果显示该方法检测到的最低菌体DNA量为1.8×10^-2 ng/μL,且10份送检样本检测结果与传统细菌分离鉴定结果相一致。结果表明,双重PCR检测方法特异性好、灵敏性高,适用于...     

杂交鳢(斑鳢♀×乌鳢♂)弹状病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为了建立一种能在临床上快速、准确检测杂交鳢弹状病毒(HSHRV)的TaqMan实时荧光定量PCR方法,利用PCR技术扩增HSHRV-C1207 G蛋白的全长序列,构建重组质粒,作为荧光定量PCR的标准品,根据HSHRV-C1207 G蛋白的保守序列,设计合成了一对能特异性扩增143 bp片段的引物和TaqMan探针,以标准品为模板建立HSHRV的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,并对该方法的灵敏度、可重复性和特异性进行评价。结果显示:建立的荧光定量PCR检测方法标准曲线有较好的线性关系,相关系数(R2)为0.999,斜率为-3.290;荧光定量PCR最低可以检测到10个病毒核酸分子拷贝,而传统PCR方法最低可检测到1×103个拷贝;38个平行样品重复性实验组内变异系数为0.84%;对其他6种水产养殖常见病毒均无扩增反应。应用该方法对采集的21份患病鳢样品进行检测,其中18份为阳性,与细胞分离和电镜观察结果相同;以传统PCR方法检测同样的样品,仅13份为阳性。本研究建立的TaqMan实时荧光定量PCR方法灵敏度高、特异性强,能较好的用于临床HSHRV的检测,对病毒病原定量检测与杂交鳢弹状病毒病的快速诊断具有重要意义。     

基因Ⅰ型草鱼呼肠孤病毒TaqMan Real-Time PCR检测方法的建立及应用

为了建立和应用可检测基因Ⅰ型草鱼呼肠孤病毒(GCRV)的荧光定量检测方法,实验根据基因Ⅰ型GCRV的S6保守序列,分别设计扩增目的条带661 bp普通引物(P1、P2)、扩增目的条带159 bp荧光定量引物(F1、F2)和一条探针;同时构建含有目的片段的PVAX1-S6作为标准质粒,10倍梯度稀释构建质粒拷贝数与Ct值的标准曲线(Y=-3.389X+38.076)。结果表明,此方法在3.9×107~3.9×101拷贝/μL之间相关性较好,R2为0.992,最小检测量为4拷贝/μL;且与基因Ⅱ型、Ⅲ型GCRV以及其他病原核酸无交叉反应。运用该方法检测16份草鱼出血病疑似样品,阳性结果为4份;而普通PCR检测仅2份显示阳性。本研究建立了针对基因Ⅰ型GCRV的荧光定量检测方法,具有高效、特异、灵敏、可重复性强的优点,适合于目前基因Ⅰ型GCRV的临床快速检测和病毒定量分析。     

养殖沉积环境中气单胞菌属细菌的实时荧光定量PCR检测方法的建立

利用GyrB基因的特异性引物建立沉积环境中气单胞菌属细菌的实时荧光定量PCR检测方法。将已知浓度的气单胞菌菌液加入灭菌的沉积物样品中,作为模拟沉积物样品。通过选择和优化沉积物DNA提取方法、特异性引物、标准曲线模板,建立沉积环境中气单胞菌属细菌准确检验的实时荧光定量PCR方法,同时验证该方法的特异性、灵敏性、重复性。结果表明,采用改进的溶菌酶-SDS温和裂解法提取沉积物DNA,以扩增GyrB基因片段的IAF和IAR为特异性引物,并直接以模拟沉积物样品DNA为标准品构建标准曲线,可以建立适用于定量检测沉积环境中气单胞菌属细菌的实时荧光定量PCR方法。该方法可灵敏、特异、准确地定量检测刺参养殖池塘底泥中气单胞菌属中不同种的细菌,检出效率可达103CFU/g。统计分析显示,变异系数为0.21%-0.80%,均小于5%,表明重复性良好。     

基于toxR基因的河流弧菌PCR快速检测方法的建立

基于河流弧菌的toxR基因设计了6对引物,分别为F1、F2、F3、F4、F5、F6.以标准河流弧菌HL01、HL02、HL03、HL04做梯度PCR检测.试验结果表明,仅F2和F4能获得分子量分别为332 bp和358 bp的目的条带.利用其他27株非河流弧菌进行PCR特异性检测,结果表明,引物F2和F4的特异性较强,但F2和F4这两对引物的灵敏度也有一定的差异,F2的灵敏为9.3×103 cfu/ml,F4的灵敏度为9.3×102cfu/ml.     

实时荧光定量 PCR 法快速检测赤潮环状异帽藻

以环状异帽藻(Heterocapsa circularisquama)ITS1区为靶序列设计了一对特异性引物,运用Real-time PCR方法,对环状异帽藻进行了定性定量检测。以其他9种赤潮微藻为对照验证其特异性。结果表明,仅含环状异帽藻DNA模板的样品有扩增,其他藻没有检测到扩增信号。以超声波破碎得到的藻液为标准品,所得标准曲线具有高度线性相关,相关系数R2为0.989,并且可以在30个循环内检测到0.5个细胞。对在不同培养条件下获得的环状异帽藻DNA样品进行检测,都能获得扩增信号。利用该方法建立的标准曲线对初步模拟现场样品进行定量检测,与显微镜计数结果基本一致。     

鲁氏耶尔森菌qPCR快速检测方法的建立和应用

鲁氏耶尔森菌(Yersinia ruckeri)是导致虹鳟(Oncorhynchus mykiss)肠炎红嘴病的病原。本研究以鲁氏耶尔森菌毒力因子rup A基因为靶标设计1对特异性引物,以含有rup A基因部分序列的重组质粒为标准品构建标准曲线,优化建立检测鲁氏耶尔森菌的SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法,并对腹腔注射鲁氏耶尔森菌菌悬液的虹鳟肝、肾、脾、血液样品进行检测。结果显示,设计的引物具有良好的种间特异性,标准曲线线性方程为y=–3.3766x+40.012(R~2=0.9958);最低检测限为57 copy/μL,较常规PCR的灵敏度高出约100倍。应用检测结果表明,本方法可准确检测被鲁氏耶尔森菌感染的虹鳟样品。研究表明,所建立的qPCR方法具有特异、灵敏、快速、定量的优点,可用于快速诊断虹鳟肠炎红嘴病早期病症及定量检测鲁氏耶尔森菌。