口蹄疫抗体免疫层析试纸的临床应用及性能评价

为评价前期研制的猪口蹄疫O型抗体检测试纸的临床应用效果,检测了162头份口蹄疫病毒(FMDV)多肽疫苗免疫猪血清和87头份灭活疫苗免疫猪血清,并与UBI FMDV抗体检测ELISA和美国BioXL FMDV抗体检测ELISA做平行对比试验。结果显示,试纸与2种ELISA方法的符合率分别为95.06%和96.55%。说明该试纸可以用于猪FMDV O型抗体的临床检测,为评价口蹄疫疫苗免疫效果提供了快速、简便的方法。     

猪O型FMDV主要抗原表位多肽的合成与鉴定

为筛选口蹄疫病毒表位抗原,使用Symphony 12通道多肽合成仪,采用Fmoc固相合成原理,合成5条O型FMDV抗原表位肽。Quattro Micro液-质联用仪分析多肽分子的结构特性,分析结果表明,在误差允许的范围内所检测的结果与理论值相符,5条多肽均通过质谱检测。通过SMCC双功能偶联剂将多肽偶联于BSA载体蛋白,以Dot-blot和间接ELISA法检测这5条与BSA偶联得多肽与O型FMDV阳性血清的结合能力,结果显示,中和表位Pep1、Pep2、Pep3能特异性结合O型FMDV感染血清和免疫血清,为抗FMDV中和表位单克隆抗体的制备和FMDV抗体检测试纸条方法的建立奠定基础。     

液相阻断ELISA在口蹄疫病毒抗体水平检测中的应用

分别利用口蹄疫病毒Asia-I型和O型液相阻断ELISA方法,对健康猪、牛、羊血清,O型、Asia-I型免疫血清,以及人工感染Asia-I型FMDV的猪、羊血清和人工感染O型FMDV牛血清进行了抗体水平检测,同时利用3ABC-I-ELISA对液相阻断ELISA方法所选的部分阴性血清进行了验证试验.结果显示:利用Asia-I型和O型液相阻断ELISA方法筛选的阴性动物,在免疫和攻毒后,血清抗体水平显著升高,表明该法可完全用于口蹄疫阴性动物筛选及口蹄疫病毒抗体水平的检测.     

某规模化牛场口蹄疫免疫抗体水平检测及分析

为了解某规模化牛场口蹄疫病毒(FMDV)的抗体水平及疫苗的免疫效果,本研究应用液相阻断ELISA检测技术对2012—2015年出生牛的380份血清进行A型FMDV和O型FMDV的抗体水平检测。结果表明,该牛场A型FMDV和O型FMDV的抗体阳性率分别为74.7%、85.5%,整体免疫水平偏低。     

抗O型口蹄疫病毒猪源单链抗体的筛选

为获得抗O型口蹄疫病毒(FMDV)高亲和力猪源单链抗体(scFv),建立抗原抗体(Ag-Ab)共表达细菌展示文库,抗原为FMDV结构蛋白VP1、抗体为高免猪抗体文库。采用细菌展示与流式细胞术结合方法,筛选出14株抗FMDV的scFv。将筛选获得scFv构建至pET28a载体中,经E. coli Rosetta表达,目的蛋白长度约为30ku,与scFv分子质量相符。Western blot结果表明,14株scFv均可与VP1特异性结合。ELISA结果表明,14株scFv均可与灭活O型FMDV特异性结合。应用共表达细菌展示技术,可避免抗原制备,简化操作流程,适用范围广泛;应用流式细胞仪筛选抗体库,可实现准确、快速、高通量筛选。抗FMDV猪源scFv研究可填补同源基因工程抗体空白,为进一步筛选中和抗体奠定基础。     

O型口蹄疫病毒间接免疫荧光检测方法的建立

为建立猪O型口蹄疫病毒(FMDV)间接免疫荧光(IFA)检测方法,以猪抗O型口蹄疫病毒阳性血清为一抗、异硫氰酸荧光素(FITC)标记的SPA蛋白(葡萄球菌蛋白A)为二抗,通过反应条件的优化,建立检测方法。结果表明,IFA最佳工作条件为,一抗最适稀释度为1∶50,FITC标记的二抗的最适稀释度为1∶800,最适孵育时间均为1h。特异性试验表明,用建立的IFA检测方法只能检测O型FMDV,而A型、AsiaⅠFMDV型和猪水疱病病毒(SVDV)检测结果均为阴性。建立的检测O型FMDV抗原的IFA检测方法具有特异、敏感、简便、快速等优点,可用于FMDV感染的实验室诊断及其在感染机体中的定位和动态分布研究。     

O型口蹄疫病毒VP1基因及其多表位基因的原核表达与纯化鉴定

[目的]通过原核表达并纯化获得O型口蹄疫病毒(FMDV)VP1基因及其多表位基因的重组蛋白,为建立O型FMDV抗体ELISA检测试剂盒及制备动物高免血清提供技术支持.[方法]以O型FMDV VP1全基因重组质粒pMD18-T-T-VP1及串联的ⅥP1多表位基因重组质粒pMD 18-T-O-VP1为模板,通过特异性引物扩增并回收目的基因,构建重组质粒pET-32a-VP1和pGEX-6p-1-VP1,然后转入大肠杆菌BL211 (DE3)中诱导表达,并以SDS-PAGE和Western blotting对融合蛋白进行分析鉴定.[结果]O型FMDV的VP1基因及其多表位基因在大肠杆菌BL21(DE3)中得到正确表达,表达的两种融合蛋白主要以包涵体形式存在,纯度较高,且均能与猪抗O型FMDV阳性血清发生特异性结合,具有良好的反应原性.[结论]表达获得的融合蛋白具有良好的反应原性,可作为包被抗原应用于O型FMDV抗体检测试剂盒研发.     

Pt-Pd合金纳米颗粒标记口蹄疫A型病毒抗体检测的免疫层析方法

【目的】为建立一种新型、高灵敏度,可直观与定量分析的快速检测方法,本研究创新使用具有氧化还原酶活性的合金纳米材料,将其作为标记物制备免疫层析试纸。待反应结束,使用TMB显色剂对免疫反应进行级联放大,可以显著提高检测的灵敏度,不仅可直观判断,也可精确定量分析,这为免疫层析技术标志物筛选与敏感性提高开拓了新的思路与方法。【方法】采用超声水浴法,通过抗坏血酸（AA）还原K₂Ptcl₄和Na₂Pdcl₄成功出制备Pt-Pd合金纳米颗粒,将其用于标记口蹄疫A型纯化抗原FMDV-146S,作为捕获抗原纳米标记物,再将纯化的A型表达抗原及其抗体（FMDV-146S-Ab）包被在硝酸纤维素膜（NC）上,分别作为检测线（T线）和质控线（C线）,经条件优化,建立口蹄疫A型病毒抗体Pt-Pd合金纳米颗粒试纸条检测方法。对该免疫层析检测技术进行方法学考核,检测结果定量分析并建立标准曲线,同时与LPB-ELISA进行结果比对。【结果】该试纸条可在10 min内完成定性和定量检测,定量检测灵敏度为1:2⁸/test,线性范围 1:2⁶/test—1:2⁹/test;检测A型FMDV阳性血清,敏感性为98%,检测FMDV阴性血清、O型和Asia 1型的FMDV阳性血清以及其他动物常见病毒病阳性血清,特异性为94.8%;该试纸条重复检测效果良好;与OIE推荐LPB-ELISA法比较,相关性好,相关系数为0.9112。【结论】本研究开拓采用Pt-Pd合金纳米颗粒为标记物建立免疫层析方法,并首次应用于口蹄疫病毒抗体检测,结果证实其具备较高灵敏度,相比胶体金灵敏度可提高2⁴倍,同时具备可操作性与重现性。该研究是快速免疫层析技术的新尝试,为合金类纳米材料应用提供新的思路,未来具有实践应用前景。     

基于免疫层析试纸的猪O型FMDV抗体水平监测

为了应用免疫层析试纸评价猪口蹄疫O型合成肽疫苗的免疫效果,对50头试验仔猪进行免疫注射,并在首次免疫后28 d及2次免疫后20 d采血,通过试纸定量测定结果来监测试验猪抗体水平变化,同时对比猪口蹄疫病毒VP1结构蛋白抗体酶联免疫吸附试验诊断试剂盒的检测结果.结果表明,猪口蹄疫O型合成肽疫苗能快速诱导产生高水平的抗体,首次免疫抗体阳性率达88%,2次免疫抗体阳性率高达100%.试纸定量测定结果表明,2次免疫后猪群免疫抗体水平整体显著提升,并保持在较高水平.与ELISA试剂盒比较二者具有相同的敏感性和特异性,符合率为100%.     

检测猪瘟病毒胶体金和量子点试纸条的初步研制

为建立快速、简便检测猪瘟病毒(CSFV)抗体的方法,本研究采用胶体金和量子点免疫层析技术,将纯化的重组CSFV E2蛋白作为捕捉抗原,以纯化的抗CSFV E2蛋白多克隆抗体和HRP兔抗猪IgG分别包被于硝酸纤维素膜上,作为质控线(C线)和检测线(T线),优化反应条件,制备免疫层析试纸条,用于临床检测。结果表明,制备的2种试纸条都可用于检测CSFV标准阳性血清,使用不同批次试纸条进行检测,结果无差异。2种试纸条与CSFV阳性血清反应呈阳性,与伪狂犬病毒(PRV)、猪乙型脑炎病毒(JEV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和圆环病毒2型(PCV2)反应呈阴性;胶体金试纸条在临床样品中阳性检出率为84.38%(81/96),与CSFV抗体检测ELISA试剂盒检测阳性符合率为92.05%(81/88);量子点试纸条阳性检出率为87.50%(84/96),与ELISA试剂盒检测阳性符合率为95.45%(84/88)。本研究制备的2种试纸条都具有较好的特异性、敏感性、重复性和稳定性。     

A型塞内卡病毒胶体金免疫层析抗原检测试纸的研制

为建立一种快速检测A型塞内卡病毒的免疫层析方法,本研究制备了SVA VP2蛋白的单克隆抗体,将单克隆抗体1D6作为金标记抗体,以单克隆抗体2C2和羊抗鼠Ig G分别作为检测抗体和质控抗体,用双抗体夹心原理制备了试纸条。结果表明,本研究所制备的2株单克隆抗体均具有良好的免疫活性,1D6和2C2识别不同抗原表位且具有较高的亲和力。基于单克隆抗体1D6和2C2制备的免疫层析试纸条能特异性的检测A型塞内卡病毒且与PRRSV、FMDV和SFV无交叉反应;病毒的最低检测限为4.8×10² TCID₅₀/m L且具有良好的重复性;该方法与RT-PCR方法检测临床样品的一致率为100%。综上所述,本研究制备的SVA胶体金免疫层析试纸具有良好的检测性能,为临床上SVA的防控提供了快速、简便的方法。     

胶体金免疫层析法检测猪旋毛虫病试验

用胶体金免疫层析试纸条检测10份猪旋毛虫病阳性样品,结果均为阳性;检测18份猪蛔虫病、12份猪囊虫病、11份猪细颈囊尾蚴病阳性样品和10份健康猪阴性样品,结果全部呈阴性;检测6份人工感染猪旋毛虫病阳性血清抗体滴度,结果与ELISA方法相一致。用该试纸条诊断旋毛虫病,特异性高,敏感性强,重复性和稳定性好,方法简便,快速实用。     

以偶联多肽为抗原建立检测O型猪口蹄疫 病毒抗体的ELISA方法

以偶联多肽为抗原建立检测O型猪口蹄疫病毒抗体的ELISA 方法。通过FMDV 多肽序列的筛选、化学 合成及反应原性鉴定,将多肽与非蛋白结构多聚体载体进行偶联。利用偶联多肽作为抗原,通过方阵滴定确定偶联 多肽、血清及HRP 的最佳工作浓度,确定方法的阴阳性临界值,然后进行特异性试验、敏感度测定及临床猪血清样 本的免疫效果评估等。结果表明,偶联多肽具有良好的反应原性,最佳包被浓度为1.0 滋g/mL,血清最佳稀释度为1: 32,HRP 最佳稀释度为1:8 000,方法特异性好,敏感度高,操作方便省时,能够对FMDV 的自然感染进行检测,也可 对FMDV 免疫后的猪血清抗体水平进行评估。     

猪O型口蹄疫病毒温度敏感突变株部分基因的PCR扩增及序列分析

根据O型FMDV全基因组序列设计引物,通过PCR扩增得到目的基因,并对猪O型FMDV的强弱毒株基因进行克隆与序列分析。结果表明:扩增得到的O型口蹄疫病毒温度敏感株L、P1、P2、P3(3C、3D)区目的基因片段大小分别为603、2 208、1 464、639、1 410 bp,与预期相符。各区序列拼接后与野生型猪O型FMDV序列比对,两者同源性为88%。     

C型口蹄疫病毒单克隆抗体的制备与鉴定

将灭活的C型FMDV背部皮下多点注射免疫BABL/c小鼠,取小鼠脾细胞和Sp2/0骨髓瘤细胞在PEG1 500作用下融合,用有限稀释法进行亚克隆.以C型FMDV重组VP1蛋白为抗原,间接ELISA法筛选单抗.以O、Asial、A型FMDV以及猪水疱病病毒为抗原,间接ELISA法检测单抗特异性.获得2株抗C型FMDV的单抗3B3和6D5,亚型鉴定为IgG1、IgG3;腹水效价分别为1∶25 600和1∶51 200;中和效价分别为1∶1 280和1∶640;2株单抗与O、Asial、A型FMDV以及猪水疱病病毒间无交叉反应,表明这2株单抗为高特异性抗C型FMDV单抗.研究结果可为C型FMD的诊断及预防提供基础材料,也可用于病因学及免疫学研究.     

猪O型FMDV重组多表位抗原基因的克隆表达及免疫学鉴定

【目的】制备猪O型FMDV广谱多表位疫苗,并筛选最适合的免疫佐剂.【方法】选取O型FMDV 3个毒株VP1蛋白的优势表位,设计并合成重复串联表位基因3FoEN2,并克隆猪IgG重链恒定区基因.利用BamHⅠ,EcoRⅠ等位点将2个基因依次克隆到pProEX-HTb载体,构建重组质粒pE-IgG并转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞.以IPTG诱导表达得到融合蛋白pE-IgG,经SDS-PAGE电泳分析,Western-blotting鉴定.分别用5种佐剂ISA206、ISA201、IMS1313、603、ISA61乳化融合蛋白配制疫苗免疫BALB/c雌鼠,间接ELISA方法测定抗体水平.【结果】重组蛋白以包涵体形式正确表达,大小为45kU,且能与感染O型FMDV的猪的阳性血清发生特异性免疫反应;ISA201佐剂试验组刺激机体产生的抗体水平最高.【结论】pE-IgG蛋白具有很强的免疫原性,与ISA201佐剂混合制备成的猪O型口蹄疫病毒多表位疫苗可刺激动物机体产生高水平抗体,是具有良好开发前景的疫苗.     

大肠杆菌O157：H7荧光纳米颗粒试纸条的研制

建立大肠杆菌O157：H7荧光纳米颗粒免疫层析法。方法：首先将荧光纳米颗粒与大肠杆菌O157：H7单抗共价偶联,制成大肠杆菌O157：H7单抗-荧光纳米颗粒偶联物。用该偶联物代替金标颗粒,以双抗体夹心作为反应模式来制备大肠杆菌O157：H7免疫层析试纸条。在紫外灯下观察免疫层析试纸条上经免疫反应而产生的质控线和检测线上的荧光信号,并利用荧光强度来半定量检测大肠杆菌O157：H7。结果：用所制备的试纸条对11属24种54株菌进行检测,所有27株大肠杆菌O157：H7的检测结果呈阳性．其它非大肠杆菌O157菌株检测结果呈阴性。用该试纸条检测人工污染的鸡肉样品。灵敏度为2．7×10^4CFU／mL。通过观察检测线的有无。可对大肠杆菌O157：H7进行半定量检测。分别用所制备的大肠杆菌O157：H7免疫层析试纸条和标准法检测57份样品,2种方法的总符合率为80．7％。结论：大肠杆菌O157：H7荧光纳米颗粒检测试纸条的研制成功,为大肠杆菌O157：H7的快速检测提供了一个极好的检测方法．便于野外检测的开展．具有广阔的应用前景。     

魏氏梭菌α毒素快速诊断金标试纸条的研制

【目的】研制魏氏梭菌α毒素快速诊断金标试纸条,为魏氏梭菌病的快速诊断提供新方法。【方法】采用分子生物学方法制备魏氏梭菌α毒素,将其免疫家兔制备多克隆抗体。用制备的抗魏氏梭菌α毒素多克隆抗体作为胶体金标记抗体和检测线上的捕获抗体,制备魏氏梭菌α毒素快速诊断金标试纸条,对其特异性、敏感性、稳定性和重复性进行检测。用制备的魏氏梭菌α毒素快速诊断金标试纸条对临床样品进行检测,比较其检测结果与PCR检测结果的符合率。【结果】成功制备了魏氏梭菌α毒素多克隆抗体。成功研制了α毒素快速诊断金标试纸条,其检测线上抗体的最适包被质量浓度为0.06 μg/mL。研制的试纸条仅与魏氏梭菌α毒素发生反应,且不同批次的试纸条重复检测结果无差异,表明试纸条具有较高的特异性和重复性;该试纸条最低可检测1.40 mg/mL的毒素量,与PCR方法测得结果符合率为80.77%,基本能满足实际应用要求。【结论】成功研制了魏氏梭菌α毒素快速诊断金标试纸条,该试纸条具有快速、特异、敏感、稳定等优点,适用于对魏氏梭菌病进行普查和检疫,具有良好的应用前景。     

免疫金试纸法快速检测盐酸克伦特罗

试验选取自身蛋白制备克盐酸伦特罗克伦特罗载体抗原,免疫动物后产生高效价的特异性抗体,纯化抗体与胶体金结合成免疫金,制备成简易的检测试纸条。通过检测试纸条敏感性、保存期、金标抗体工作浓度选择、操作方法对比、实验检测及与单抗金标试纸条平行检测等试验,证明建立的免疫金试纸法快速检测盐酸克伦特罗具有实用性、可靠性和稳定性。自身全血清作载体可使抗盐酸克伦特罗的ELISA效价高达4万以上。免疫金试纸法对盐酸克伦特罗的最小检测量为40ng·mL-1,试纸条在室温保存150d不影响检测结果。实验检测86份ELISA试剂盒阴性样品和42份阳性样品,其符合率分别为100%和95.2%。市售单抗金标试纸条检测结果与ELISA法的阳性符合率为95%(19/20)。     

猪瘟胶体金快速诊断试纸条的研制

采用柠檬酸钠还原法制备胶体颗粒,用猪瘟(CSF)抗体标记纯化,并包被在玻璃纤维膜上,另外将纯化的CSF抗体和羊抗鼠抗体包被在硝酸纤维膜上,组装成CSF快速检测条,对猪瘟病毒进行检测.结果表明:使用所研制的CSF快速检测条检测收集的70份待检样品,共检出猪瘟阳性病例26例,而经病毒分离鉴定阳性病例有28例,阳性符合率达92.8%;将5份阳性猪瘟病毒稀释后用试纸条和ELISA方法进行敏感性实验,结果表明,诊断试纸条的敏感性较高,用试纸条对鸽新城疫病毒、鸡减蛋综合症病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒进行检测,无交叉反应.