鸡白细胞介素18基因的克隆与原核表达

白介素18(IL-18)最早被称为干扰素诱导因子(interferon-γ-inducing factor,IGIF),是近年发现的一种重要的免疫调节因子。该实验根据Gen Bank中已公布的鸡IL-18的基因序列,设计并合成了一对特异性引物,应用RT-PCR方法扩增出IL-18基因,并将该基因克隆到p MD18-T载体中,经过质粒酶切、PCR和测序鉴定,阳性克隆命名为Chp MD18-T-IL-18。将Chp MD18-T-IL-18双酶切后与p ET32a表达载体连接,转化到大肠杆菌BL21感受态细胞中,经IPTG诱导表达鸡IL-18蛋白,结果表明,在28k D左右出现了目的条带,经west-ern blot检测确定该蛋白获得高效表达,为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础。     

重组hIL-24原核表达载体的构建及表达

采用基因克隆的方法构建人白细胞介素(hIL-24)基因的原核表达载体pET-28a(+)-hIL24,在大肠杆菌中诱导表达重组蛋白rhIL-24,SDS-PAGE和Western blotting分析蛋白表达,探讨其最佳诱导表达条件.结果表明:hIL-24基因的表达产物分子质量约25 ku,且以包涵体的形式存在于超声裂解后的沉淀中,重组蛋白rhIL-24可特异性被鼠抗人IL-24单克隆抗体识别.当IPTG终浓度为0.5 mmol·L~(-1)、37℃诱导8 h时,其表达量最高.hIL-24基因在该原核表达系统中的成功表达,为其生物学功能的研究奠定了基础.     

牛白细胞介素-17真核表达载体的构建及在牛乳腺上皮细胞中的表达

【目的】在体外分离培养牛乳腺上皮原代细胞,并构建牛白细胞介素-17(bIL-17)基因真核表达质粒,观察重组质粒在牛乳腺上皮细胞的表达.【方法】提取牛脾脏细胞总RNA,通过RT-PCR扩增bIL-17,将bIL-17连入pMD19-T进行测序,测序成功后将bIL-17插入含有增强型绿色荧光蛋白报告基因的真核表达质粒pEGFP-N3上,构建真核表达质粒pEGFP-N3-bIL-17.用脂质体法将pEGFP-N3-bIL-17质粒转染于牛乳腺上皮细胞,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白在细胞中的表达,RT-PCR检测bIL-17基因在细胞内的转录,定量ELISA检测bIL-17蛋白在细胞内的表达情况.【结果和结论】成功构建具有绿色荧光和新霉素抗性的双选择标记的牛白细胞介素-17真核表达载体,并可在牛乳腺上皮细胞成功表达.     

大肠杆菌原核表达载体pSBET-His的构建

为了构建原核表达载体pSBET-His。pSBETa质粒经XbaI和BamH I限制性内切酶双酶切,获得原核表达载体的骨架。以pET28a(+)为模板,通过高保真PCR法应用T7 promoter引物和T7 terminator引物对pET28a(+)载体T7表达区域进行扩增,PCR产物电泳纯化后经双酶切和纯化获得138 bp含His-Tag序列的片段。将pSBET原核表达载体骨架和含有His-Tag序列的片段进行连接后转入DH5α感受态细胞中,经菌落PCR及酶切筛选构建pSBET-His。成功构建了pSBET-His原核表达载体。应用该载体表达的蛋白质,可采用镍离子亲和层析法进行纯化。该研究为应用pSBET-His载体进行烟草丛顶病毒ORF4的原核表达研究奠定了基础。     

牛白细胞介素15基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

根据GenBankTM中发表的牛IL-15基因序列设计并合成了特异性引物,以经LPS和ConA刺激的牛外周血单个核细胞提取的总RNA为模板,用RT-PCR方法扩增出长度约500 bp的目的基因片段,并将该基因克隆到pMD18-T载体上.酶切、PCR及序列测定结果表明,获得了牛IL-15全长基因的克隆.进一步通过PCR方法得到缺失其N端48个氨基酸的信号肽序列的牛IL-15成熟蛋白基因,将其亚克隆到原核表达载体pET-32a上,构建重组表达质粒pET-IL-15,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,该菌表达以包涵体形式存在的相对分子质量约为33 000的融合蛋白.用Ni螯合层析方法纯化表达的蛋白.Western-blot试验显示表达的重组融合蛋白能与抗6×His的单克隆抗体发生反应,同时也能与鼠抗猪IL-15的多克隆抗体发生明显交叉反应.     

猪白细胞介素18成熟蛋白基因克隆及在不同原核表达系统中的表达

RT-PCR方法直接从猪脾脏淋巴细胞中扩增出猪白细胞介素18成熟蛋白基因的cDNA,克隆到pGEM-T载体,构建重组质粒pGEM-T pIL18,转化E.coli JM109感受态细胞,取PCR和酶切鉴定为阳性的重组质粒进行序列测定.测序结果表明,pIL-18成熟蛋白基因核苷酸长度为474 bp,编码157个氨基酸.将其分别克隆到表达载体pQE30、pET-28a、pGEX6P-1中,构建重组表达质粒pQE-mpIL18、pET-mpIL18、pGEX-mpIL18.用IPTG诱导表达,重组菌菌体裂解物SDS-PAGE可检测到相对分子质量分别为19 000、21 000、45 000的重组蛋白.经薄层扫描分析,pQE-mpIL18、pET-mpIL18、pGEX-mpIL18菌体裂解物分别占菌体总蛋白的17%、28%、27%,均以包涵体形式存在.     

鲈鱼白细胞介素-8 cDNA序列的克隆与原核表达

采用RT-PCR方法扩增和克隆了鲈鱼白细胞介素-8(LjIL-8)的编码阅读框。该编码阅读框由300个核苷酸组成,编码由99个氨基酸组成前体蛋白。LjIL-8氨基酸序列与哺乳动物和鱼类IL-8类似物的氨基酸同源性分别为23%~48%和25%~92%。氨基酸序列分析表明,N端存在一长23个氨基酸的信号肽,含有形成2个链内二硫键的4个半胱氨酸。分子进化分析表明,LjIL-8与欧洲鲈鱼的亲缘关系最近。将LjIL-8编码序列克隆到原核表达载体pET-28a (+),转化E.coli BL21(DE3)后用IPTG进行诱导表达,SDS-PAGE检测结果表明,预期分子量大小的小分子蛋白在大肠杆菌中成功表达,Western-blotting检测结果显示,目的蛋白能与抗6×His单克隆抗体发生特异性反应。     

苹果AFL1基因原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

AFL1基因是苹果控制花发育的关键基因之一。在已得到AFL1 cDNA基因的基础上,将AFL1克隆到原核表达载体pET28b中,获得了重组表达质粒pET-AFL1,并将此重组质粒转化到大肠杆菌菌株BL21中,经IPTG诱导表达、SDS-PAGE电泳分析,结果显示,AFL1基因在大肠杆菌中成功表达,表达的AFL1融合蛋白分子量大约为53 kD。     

鸡白介素18与鸡γ干扰素基因融合表达载体构建

为了研究新型细胞因子制剂,构建鸡白细胞介素18和鸡干扰素γ的基因融合表达载体。无菌提取鸡脾细胞的总RNA,以其为模板经过RT-PCR的方法分别扩增出Ch IL-18和Ch IFN-γ基因片段,并连接到p MDTM18-T克隆载体上,构建重组质粒p MDTM18-T-Ch IL-18和p MDTM18-T-Ch IFN-γ。以重组质粒p MDTM18-T-Ch IL-18和p MDTM18-T-Ch IFN-γ为模板,利用多肽氨基酸接头和overlap技术,获得Ch IL-18-Ch IFN-γ融合基因并连接到克隆载体p MDTM18-T上,经PCR、酶切及测序鉴定正确后连接到p ET32a原核表达载体中。构建Ch IL-18-Ch IFN-γ原核表达载体。为下一步研究二者之间的作用关系及抗病毒功能奠定了基础。     

荣昌猪白细胞介素-10(IL-10)基因的克隆及原核表达

根据GenBank收录的猪白细胞介素-10(PIL-10)设计1对特异性引物,经刀豆蛋白素A(conA)诱导猪淋巴细胞并提取总RNA,RT-PCR方法首次扩增出荣昌猪PIL-10的全长基因。序列分析表明PIL-10全长771 bp。设计1对引物亚克隆荣昌猪IL-10基因成熟蛋白编码基因(477 bp)。利用基因重组技术构建了PET32a(+)-PIL-10融合表达载体,经酶切鉴定,DNA测序证实重组质粒构建正确。将重组质粒转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导,SDS-PAGE,重组菌的RT-PCR,Western blotting结果表明融合表达成功。     

拟南芥AtCOR15a抗寒基因原核表达载体的构建及蛋白表达

[目的]通过RT-PCR获得拟南芥AtCOR15a基因的ORF全长,经酶切、连接,以pET-28a(+)为原核表达载体.构建成pET28a-COR15a的重组表达载体,研究该基因在大肠杆菌中的表达情况,为进一步研究该基因的功能奠定基础.[方法]根据拟南芥AtCOR15a基因序列设计特异引物,利用RT-PCR的方法扩增目的基因,构建原核表达载体pET28a-COR15a,并将此重组质粒转化到大肠杆菌菌株BL21(DE3)中,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷( IPTG)诱导表达,SDS-PAGE电泳分析,验证其蛋白表达量,并对其体系进行优化.[结果]AtCOR15a在大肠杆菌中成功表达,在37℃条件下诱导表达量最大,而30和16℃条件下蛋白表达量降低,IPTG浓度0.2～1.0 mmol/L对蛋白的表达量影响不大,并没有明显差异.但通过在不同诱导时间取样分析,结果发现加入IPTG后诱导5 h蛋白表达量最大,而8 h后逐渐降低.[结论]构建的原核表达载体在大肠杆菌中能高效表达,AtCOR15a融合蛋白分子量大约为19 kD,为进一步研究该基因的功能奠定了基础.     

性别决定基因Sry原核表达载体的构建和蛋白检测

动物的性别在畜牧业是一项很重要的经济性状,而哺乳动物的性别决定受睾丸决定基因Sry的启动,获得SRY蛋白并探索它与其他相关因子之间的相互关系对于深入了解该因子的作用机理和寻求高效经济的性别控制方法尤为重要。本研究以小鼠为实验材料,通过PCR、质粒重组、酶切和测序等方法构建小鼠Sry的原核表达载体,使用IPTG诱导蛋白表达、SDS-PAGE电泳和western blotting等方法检测重组表达载体的原核表达。PCR、酶切和测序结果一致显示成功地构建了原核表达载体pET-21b-Sry;使用anti-Sry和anti-His特异性抗体进行的western blotting实验结果验证了蛋白表达的正确性。本实验不仅实现了哺乳动物性别决定因子的Sry原核表达,而其还获得了具有生物活性的SRY蛋白,对于深入研究Sry及其他相关基因的相互作用奠定了实验基础。     

产气荚膜梭菌肠毒素基因原核表达载体的构建

以含C型产气荚膜梭菌分离株(CP2)肠毒素基因的克隆载体pMD18-T-cpe为材料,根据产气荚膜梭菌开放阅读框设计合成一对特异性引物,采用PCR技术对其进行扩增,经BamHI和EcoRI双酶切后,从胶上回收目的基因,与经过相同两种内切酶处理的原核表达栽体pET32a连接,转化大肠杆菌DH5a感受态细胞后,提取质粒进行PCR和BamHI/EcoRI双酶切鉴定后测序.结果表明,肠毒素基因已成功地克隆到原核表达栽体上(重组质粒命名为pET32a-cpe),从而构建了产气荚膜梭菌肠毒素基因的原核表达质粒.     

犬瘟热病毒H基因原核表达质粒的构建

为H蛋白进一步表达作为诊断用抗原、建立特异的犬瘟热病毒(CDV)抗体检测方法及CDV的预防奠定基础,以已构建含有犬瘟热病毒H基因的pMD18-H质粒为模板,利用合成的特异性引物进行PCR扩增,得到1824bp的目的DNA片段,将所得H基因克隆至经相同双酶切处理后的pET32a(+)原核表达载体中,获得重组质粒pET32...     

番木瓜环斑病毒CP基因dsRNA原核表达载体的快速构建

重点介绍了一种快速构建dsRNA原核表达载体的方法。以番木瓜环斑病毒外壳蛋白基因（PRSV-CP）3＇端-279 bp保守区段为基础,通过OZ-LIC法构建861 bp,432 bp和279 bp 3种不同长度的发卡结构,再通过XhoⅠ和ClaⅠ双酶切,将其连接到pSP73原核表达载体上,构建成PRSV-CP基因dsR...     

脑膜炎奈瑟氏菌NspA基因重组乳酸菌表达载体的构建及原核表达

用Nco Ⅰ和Kpn Ⅰ双酶切克隆质粒pMD-18T-NspA及可以在乳酸菌与大肠杆菌之间穿梭表达的载体质粒pW425et,将NspA基因与pW425et表达载体用T4DNA连接酶相连,构建出重组质粒pW425et-NspA,将其转入至E.coli DH5α感受态细胞中,筛选阳性重组子进行SDS-PAGE和Wester...     

鸡IL-18原核表达工程菌遗传稳定性与表达产物的生物学活性检测

通过对鸡白介素18(IL-18)原核表达工程菌BL21-ChlL-18遗传稳定性、表达产物的Western-blot及其经Sephadex G-100纯化后的ELISA和淋巴细胞转化试验分析,以检测其遗传稳定性及其表达产物的生物学活性.结果表明,该重组工程菌能稳定地表达鸡IL-18,表达产物不仅能够与抗鸡IL-18的多...     

鸡白细胞介素-18真核表达载体构建与ILTV弱毒疫苗联合免疫

为了探索鸡IL-18在传染性喉气管炎病毒(ILTV)弱毒疫苗中的免疫佐剂作用,将鸡IL-18(ChIL-18)克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建重组真核表达质粒pcDNA3.1/ChIL-18(简称pIL-18)。用pIL-18、ILTV弱毒疫苗及其两者联合分别免疫21日龄SPF雏鸡,免疫后每周抽取外周血及外周抗凝血,应用ELISA和流式细胞仪分别检测免疫鸡的体液免疫及细胞免疫水平。免疫后第4周用100 ELD50ILTV强毒进行攻击。结果pIL-18与ILTV弱毒疫苗联合免疫组的淋巴细胞亚群CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+明显高于ILTV弱毒疫苗免疫组(P<0.01),ILTV强毒攻毒后发病鸡数量少,并且发病症状较轻。     

斑马鱼p53基因原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

利用原核表达系统克隆表达斑马鱼p53基因。RT-PCR法从斑马鱼胚胎中扩增获得p53基因编码区,并将其克隆至原核表达载体pET28a上,构建重组质粒pET28a/z-p53,将重组质粒转化E.coli BL21(DE3)受体菌,IPTG诱导表达,表达产物经镍柱纯化、尿素透析复性,SDS-PAGE电泳分析,结果表明,p53基因在大肠杆菌中成功表达,表达的p53融合蛋白分子量大约为53kD,透析复性后获得了高纯度可溶性的p53蛋白。     

金花茶CnCHS基因原核表达载体的构建及表达分析

根据已经克隆得到的金花茶（Camellia nitidissima Chi．）查尔酮合成酶基因序列,设计引物对P1／P2扩增出该基因全长并将其构建到原核表达载体 pGEX 4T 1中,转入大肠杆菌BL21后,用浓度为0．4 mmol／L的IPTG诱导其表达。SDS PAGE电泳检测结果显示,被诱导的大肠杆菌菌体中出现了约68 ku的特异融合蛋白,表明该基因在大肠杆菌中成功表达。