貂、貉源犬瘟热病毒流行毒株H基因的克隆及遗传多样性分析

为研究鼬科动物犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)毒株的变异特性,对分离自不同地区貉、貂的5个CDV毒株和1个CDV国内弱毒疫苗株(vacChina)的H基因进行了核苷酸测序,并与12个参考毒株构建系统发生树。结果表明:5个流行毒株之间H基因核苷酸序列同源性均达到97.5%以上,vacChina与5个流行毒株的H基因核苷酸序列同源性普遍较低(90.5%～91.8%),而与国外疫苗株Convac和Onderstepoort的H基因核苷酸同源性达96.8%和97.2%。流行毒株之间H蛋白氨基酸同源性差别不大(97.1%～100.0%),流行毒株与vacChina疫苗株H蛋白氨基酸同源性普遍较低(89.7%～91.8%),vacChina与Onderstepoort、Convac有着很高的同源性,其H蛋白氨基酸同源性分别为97.1%、95.6%。结果分析显示,CDV的流行和免疫失败现象的发生与国内所用疫苗毒株和野毒株的遗传关系甚远有关。     

不同毒株犬瘟热病毒结构基因的通用扩增及序列测定

为了更准确、快速、高通量地追溯犬瘟热病毒流行毒株来源,揭示其进化规律,本研究分析比对了GenBank中已公布的23株犬瘟热病毒全基因组序列,针对6个结构基因的保守区设计了特异性通用引物,用于扩增犬瘟热病毒野毒株和疫苗株的6个结构基因。经过优化引物对的特异性、通用性、工作浓度及退火温度等,最终确定6对特异性通用扩增引物,对本室保存的3株疫苗毒CDV-3株、OR12株、CDV/R-20/8株,及2个流行毒HBF-1株和SD(14)07株的6个结构蛋白基因进行RT-PCR通用扩增。取5μL扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳,结果显示,以上述5株犬瘟热病毒的cDNA为模板,用6对通用引物扩增,分别获得6个特异性条带,大小与预期相符。选取疫苗毒CDV-3株和野毒HBF-1株N、P、M、F、H和L基因连接至p EASY-Blunt载体上,进行序列测定。测序结果显示,与GenBank中已公布的序列同源性均大于99.0%,证实筛选的6对特异性引物能够实现对犬瘟热病毒野毒株和疫苗株的不同结构基因的准确扩增,并获得精准序列。这提高了犬瘟热病毒检测鉴定的效率和特异性,有利于人们快速、准确地获取犬瘟热病毒未知毒株结构基因的序列,追溯病原来源和分析其进化规律,为疫苗研制提供思路。     

貂、狐、貉源犬瘟热病毒分离株H和N基因的遗传多样性分析

为研究鼬科动物犬瘟热病毒(CDV)毒株的变异特性,对来自不同地区的貉、狐、貂的5个CDV分离株(其中HD-m、LN-m为貂源,HTp-r、THD1-r为貉源,HB-f为狐源)和1个CDV国内弱毒疫苗株(vCh)的N基因和部分H基因进行了核苷酸测序,并构建系统发生树.结果表明,5个分离株之间H基因核苷酸序列同源性均达到97.5%以上,而N基因为94.5%～99.8%.vCh与5个分离株的H基因和N基因核苷酸序列同源性普遍较低(H基因:90.5%～91.8%;N基因:90.9%～93.5%),而与国外疫苗株vCon和vOnder的H基因核苷酸同源性达96.8%和97.2%.分离株之间H蛋白氨基酸同源性差别不大(97.1%～100%),而N蛋白氨基酸同源性差别较大(91.6%～100%).5个CDV分离株与vCh疫苗株H蛋白和N蛋白同源性均普遍较低,H蛋白为89.7%～91.8%,N蛋白为92.8%～96.8%.vCh与vOnder、vCon有很高的同源性,其H蛋白氨基酸同源性分别为97.1%和95.6%,vCh与vOnder N蛋白氨基酸同源性达97.3%.结果显示,最近犬瘟热的流行和免疫失败现象的发生与国内所用疫苗毒株和野毒株的遗传关系甚远有关.     

貂、狐、貉源犬瘟热病毒分离株H和N基因的遗传多样性分析

为研究鼬科动物犬瘟热病毒(CDV)毒株的变异特性,对来自不同地区的貉、狐、貂的5个CDV分离株(其中HD-m、LN-m为貂源,HTp-r、THD1-r为貉源,HB-f为狐源)和1个CDV国内弱毒疫苗株(vCh)的N基因和部分H基因进行了核苷酸测序,并构建系统发生树.结果表明,5个分离株之间H基因核苷酸序列同源性均达到97.5%以上,而N基因为94.5%～99.8%.vCh与5个分离株的H基因和N基因核苷酸序列同源性普遍较低(H基因:90.5%～91.8%;N基因:90.9%～93.5%),而与国外疫苗株vCon和vOnder的H基因核苷酸同源性达96.8%和97.2%.分离株之间H蛋白氨基酸同源性差别不大(97.1%～100%),而N蛋白氨基酸同源性差别较大(91.6%～100%).5个CDV分离株与vCh疫苗株H蛋白和N蛋白同源性均普遍较低,H蛋白为89.7%～91.8%,N蛋白为92.8%～96.8%.vCh与vOnder、vCon有很高的同源性,其H蛋白氨基酸同源性分别为97.1%和95.6%,vCh与vOnder N蛋白氨基酸同源性达97.3%.结果显示,最近犬瘟热的流行和免疫失败现象的发生与国内所用疫苗毒株和野毒株的遗传关系甚远有关.     

犬瘟热疫苗株CDV3核蛋白基因全序列测序及分析

根据GenBank上发表的犬瘟热病毒(CDV)核蛋白(N)蛋白基因序列,设计合成了1对寡聚核苷酸引物,提取犬瘟热病毒疫苗株CDV3的RNA为模板,采用RT-PCR扩增病毒的N蛋白基因,并进行产物克隆和序列分析。将CDV3疫苗株N基因与GenBank数据库中的疫苗株Onderstepoort及中国、美国和德国等分离的疫苗株或毒株共14株CDV N基因序列进行同源性分析,发现CDV3 N基因序列与疫苗株Onderstepoort的同源性为97.1%,与其他分离毒株的核苷酸同源性为92.8%～94.0%,其中与中国分离的TN株同源性为93.6%;然而,CDV3 N蛋白与它们的氨基酸同源性却基本都为96.6%～97.3%。这说明虽然犬瘟热弱毒株CDV3在核苷酸水平上与其他疫苗株毒株的差异较大,但是在氨基酸水平上的比较差异较小。     

犬瘟热病毒H基因5＇端的表达纯化及抗原性分析

为了获得高纯度的犬瘟热病毒5＇端H蛋白,本研究通过参考GenBank中发表的CDVH蛋白基因序列,用Oligo6．0软件设计一对特异性引物,从犬瘟热病毒疫苗毒株CDV3和野毒株CDVSD株提取总RNA,经FIT—PCR扩增得到388bp的基因片段,将目的基因与原核表达载体pET28a（＋）连接构建了pET28a—CDV3-H5和pET28a—CDVSD-H5重组质粒,转化到大肠杆菌BL21（DE3）中进行鉴定、测序、IPTG诱导表达。重组表达载体pET28a—CDVSD—H5在大肠杆菌中成功的表达,目的重组蛋白为22kD,而pET28a—CDV3-H5未能表达。经Ni—NTA洗脱纯化后,rCDVSD—H5蛋白被成功纯化。Western blot分析表叫,表达产物能够被犬抗CDV阳性血清所识别,具有良好的抗原性。为血清学诊断方法的建立和基因工程疫苗的研究奠定基础。     

H9N2亚型禽流感病毒广东2009年分离毒株的HA基因功能进化

采用常规的血清学试验和特异性RT-PCR方法,对A/chicken-Guangdong/E8/2009等4株H9N2亚型禽流感病毒广东分离株的HA基因进行克隆、测序和遗传衍化分析,并与国内疫苗毒株进行比较,力图从分子水平探讨广东H9N2亚型禽流感病毒的演化和变异规律。研究结果显示:4株分离毒株与3株国内疫苗毒株的氨基酸同源性在91.3%~93.3%之间,与09年其他地区分离得到的H9N2亚型禽流感毒株同源性在95.0%~99.2%之间。4株H9N2亚型禽流感病毒比国内所使用的3株疫苗毒株都在第295位新增一个潜在糖基化位点。此外,研究还发现4株分离毒株共有7处氨基酸位点发生突变,其中A316S突变正好位于HA切割位点,而Q216L则位于受体结合位点。本研究从一定程度上反映出2009年国内流行H9N2禽流感优势毒株与国内一些疫苗毒株有一定的进化距离。     

狐、貉源犬瘟热病毒H和F基因的克隆与序列分析

为研究我国圈养狐、貉流行犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)的基因分型与遗传变异情况,通过RT - PCR方法扩增与测序分析了2009年来源于山东省和河北省病料中的CDVH与F基因,并分别与GenBank CDV野毒株和疫苗株的基因序列比对,构建了核苷酸序列的系统发生树.H基因系统发生分析显示,6株毒株归属为Asia -1型.H蛋白氨基酸序列比较表明,除HeB(09)3株有8个潜在N-连接的糖基化位点外,其余毒株N-连接的糖基化位点均为9个.以往的研究结果显示,日本和中国台湾分离株的潜在N-连接糖基化位点为8～9个.6株野毒F蛋白编码区氨基酸的同源性为98.0％～99.5％,与CDV3(登录号EU726268)和Onderstepoort(登录号AF305419)疫苗株的同源性为89.1％～90.6％,F蛋白的前导区(1～ 135位氨基酸)与疫苗株相比的同源性为62.2％～66.7％;野毒株F蛋白氨基酸在108～ 110处比疫苗株CDV3多1个潜在N-连接的糖基化位点,HeB(09)3的F蛋白还在366～369位多1个潜在的N-连接的糖基化位点.目前在山东省和河北省2地狐狸和貉中流行的犬瘟热野毒株为Asia -1型,HeB(09)3株H蛋白和F蛋白在N-连接糖基化方面与其他5株野毒株有明显的不同.     

H9N2亚型禽流感病毒血凝素基因的遗传变异

连续3年对某鸡场禽流感感染鸡群进行跟踪监测,对使用疫苗前与使用疫苗后不同时段分离的H9N2亚型禽流感病毒的血凝素(HA)基因进行全序列分析,研究其H9N2亚型禽流感病毒在同亚型灭活疫苗的选择压力下的遗传变异。结果表明:在使用第1次分离的病毒株制备的疫苗后8个月分离该病毒株,其HA基因仅有1个氨基酸发生变异;继续使用该疫苗第2年分离的该病毒株,其HA基因有20个氨基酸发生变异。     

表达小反刍兽疫病毒H基因的山羊痘病毒通用转移载体的构建及鉴定

笔者以山羊痘病弱毒疫苗毒株TK基因内KpnI为插入位点,构建了表达绿色荧光蛋白和小反刍兽疫（PPR）H基因的重组山羊痘病毒通用转移载体,为今后研究羊痘病毒活载体疫苗奠定基础。     

广东地区犬瘟热病毒血凝素基因的克隆与序列分析

【目的】对广州和东莞市宠物犬感染犬瘟热病毒(CDV)的情况进行病原鉴定和分析,为监测CDV的遗传变异情况和防治犬瘟热(CD)提供数据基础。【方法】从表现CD症状的犬只中鉴定了17份CDV阳性样本,采用RT-PCR的方法克隆得到这些野毒株的血凝素(H)基因序列,采用生物信息学方法进行序列比对分析。【结果】17株CDV的H基因核苷酸与氨基酸序列的相似性分别为97.4%～100.0%和97.5%～100.0%,与Onderstepoort、Lederle和Convac等疫苗株相比,其核苷酸与氨基酸序列相似性分别为90.3%～91.5%和89.4%～90.8%。进化树分析结果显示,17株CDV野毒株均属于AsiaⅠ型,与疫苗株的分支较远;本研究鉴定的野毒株已进化形成9个潜在的N-糖基化位点。【结论】AsiaⅠ型CDV仍为该地区的流行基因型,基因型较稳定,但与疫苗株相比形成了一定的进化距离和出现了大量的变异。因此,继续监控CDV在犬群中的进化,掌握其遗传变异状况具有重要意义。     

表达犬瘟热H基因重组伪狂犬病毒的构建及生物学特性研究

[目的]构建表达犬瘟热Onderstepoort株H蛋白的重组伪狂犬病毒,并研究其生物学特性。[方法]通过RT-PCR方法获得On-derstepoort株H基因,插入pcDNA3.1（＋）建立好完整的真核细胞表达盒并将此表达盒亚克隆到转移载体p8AA上。在此基础上再将报告基因LacZ的表达盒插入转移载体,命名为p8AAZH。将p8AAZH与伪狂犬病毒（PRV）Bartha-K61株基因组共转染至BHK-21细胞中进行基因重组包装出毒,待细胞病变后收集病毒液。通过蓝色蚀斑筛选、PCR、电镜观察以及Western blot,筛选纯化重组病毒并鉴定目的基因的表达。同时在BHK-21细胞上测定重组病毒的生长曲线。[结果]获得了表达H蛋白的重组伪狂犬病毒,重组病毒与亲本Bartha-K61株的生长曲线、病变特征相一致。[结论]成功构建了表达犬瘟热Onderstepoort株H蛋白的重组伪狂犬病毒,H基因的插入不影响重组病毒的增殖特性,为犬瘟热活病毒载体疫苗的研制与开发打下了基础。     

表达犬瘟热H基因重组伪狂犬病毒的构建及生物学特性研究

[目的]构建表达犬瘟热Onderstepoort株H蛋白的重组伪狂犬病毒,并研究其生物学特性。[方法]通过RT-PCR方法获得Onderstepoort株H基因,插入pcDNA3.1（＋）建立好完整的真核细胞表达盒并将此表达盒亚克隆到转移载体p8AA上。在此基础上再将报告基因LacZ的表达盒插入转移载体,命名为p8AAZH。将p8AAZH与伪狂犬病毒（PRV）Bartha-K61株基因组共转染至BHK-21细胞中进行基因重组包装出毒,待细胞病变后收集病毒液。通过蓝色蚀斑筛选、PCR、电镜观察以及Westernblot,筛选纯化重组病毒并鉴定目的基因的表达。同时在BHK-21细胞上测定重组病毒的生长曲线。[结果]获得了表达H蛋白的重组伪狂犬病毒,重组病毒与亲本Bartha-K61株的生长曲线、病变特征相一致。[结论]成功构建了表达犬瘟热Onderstepoort株H蛋白的重组伪狂犬病毒,H基因的插入不影响重组病毒的增殖特性,为犬瘟热活病毒载体疫苗的研制与开发打下基础。     

大熊猫源犬瘟热病毒基因组遗传特征分析

【目的】对首次暴发的大熊猫源性犬瘟热病毒（panda derived-canine distemper virus,P-CDV）全基因组进行克隆测序,以了解大熊猫源CDV的全基因组遗传变异情况,进一步追踪感染源,为大熊猫犬瘟热防控提供理论依据。【方法】根据GenBank公布的CDV全基因组序列设计17对特异性引物,利用RT-PCR技术,从感染犬瘟热病毒的大熊猫肺渗出液中分片段扩增CDV全基因序列,并克隆到pMD19-T载体中;经测序、拼接,获得第一个P-CDV全长cDNA序列;利用DNAman生物学分析软件分别对全基因组序列、H蛋白基因序列、F蛋白基因序列、P蛋白基因序列、M蛋白基因序列等进行遗传变异分析,构建系统进化树。【结果】经序列测序和拼接,大熊猫源犬瘟热病毒全基因组长15 690 nt,GenBank登录号为KP677502,主要编码6种蛋白,分别是N蛋白、P蛋白、M蛋白、F蛋白、H蛋白和L蛋白,在各个基因及间隔区中未发现碱基插入和缺失。遗传进化分析显示,P-CDV全基因组与20株代表性CDV全基因组序列同源性为91.5%-98.7%,P-CDV与强毒株MKY-KM08（HM852904）、PS、HLJ1-06（JX681125）、Hebei（KC427278）以及AC96I-H358（AB753776）在一个大的分支上,与PS株（JN896331）亲缘关系最近,同源性为98.7%,与标准野毒株Strain A75-17（AF164967）同源性为95.7%,与疫苗株CDV3（EU726268）亲缘关系较远,同源性为91.5%。H蛋白氨基酸序列分析和系统进化树表明,大熊猫源犬瘟热病毒属于强毒株,基因型为Asia-I型。P-CDV各蛋白基因与20株代表性的毒株相比有9处氨基酸发生了变异,与GenBank上现有的CDV序列相比,其中3处是独有的,分别是：F蛋白基因的208位由N（Asn,天冬酰胺,强毒株多为N）或K（Lys,赖氨酸,弱毒株多为K）变成了S（Ser,丝氨酸）,第215位由S变成了A（Ala,丙氨酸）,P蛋白基因的58位由Q（Gln,谷氨酰胺）变成K（Lys,赖氨酸）。【结论】成功克隆了大熊猫源犬瘟热病毒的全基因,并完成了序列分析,发现了在F、P基因上碱基的重要变异。这些数据将为研究大熊猫犬瘟热的遗传变异和流行特征提供分子生物学依据。     

黑龙江地区流行犬瘟热病毒H基因克隆及序列分析

对临床上流行的犬瘟热病毒CDV(ZH-10株)的H基因进行克隆和序列分析。结果显示:H基因全长约为1824bp;CDV ZH-10株与国外的Convac和Onderstepoort疫苗株亲缘关系较远,核苷酸同源性分别为91.3%、91.4%;ZH-10株与国内近期大部分分离株属于野毒株谱系,在基因型上归属Asia-1型。研究揭示了CDV基因型的地域性差异是近年来我国CD流行的一个主要原因,为将来研制出更加有效的CD疫苗奠定了基础。     

犬瘟热病毒N和H蛋白拮抗IFN-β信号通路的研究

为研究犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)不同毒株N、H蛋白调控宿主β-干扰素(IFN-β)表达的作用,将CDV野毒株LN(10)1、SD(14)7和疫苗株CDV3感染提前转染了pGL3-IFN-β报告基因质粒和pRL-TK内参质粒的MDCK细胞,分别在感染0h、8h、12h和24 h后通...     

犬瘟热病毒扬州分离株融合蛋白F和附着蛋白H基因的序列分析

根据Genbank犬瘟热病毒(CDV)毒株序列分别设计融合蛋白F和附着蛋白H全基因的2对引物,以2个CDV扬州分离株(CDV-YZ0101、CDV-YZ0102)为模板RT-PCR扩增出H基因和F基因2个片段,将其克隆进pGEM-Teasy载体,并进行序列分析.结果表明H基因的开放阅读框架(ORF)为1 824 bp,2种分离株间核苷酸和编码氨基酸同源性达98%左右,与中国长春分离株、美国、日本分离株的同源性分别为96%、93%～95%和90%～91%.氨基酸分析显示扬州分离株与其他分离株的H蛋白有8～9个可能的天冬酰胺糖基化位点,而OP-CDV疫苗株只有4个类似位点.扬州分离株与长春分离株同属一个系,与美国、日本分离毒株以及疫苗株相比,均存在着明显的差异.F基因ORF为1 989 bp,不同毒株间的核苷酸及编码氨基酸差异主要表现在信号肽区域,而编码的F0前体蛋白表现出较高同源性(97%～99%),且所有的13个半胱氨酸残基、4个可能的天冬氨酰糖基化位点和2个疏水区域均完全一致.因此CDV F与H蛋白基因相比有很高的同源性,证明中国分离株与国外参考株有差异.     

犬瘟热病毒GZ2株的分离鉴定及H基因原核表达质粒构建

对疑似CD的贵宾犬病料进行了CDV的分离和初步鉴定以及H基因的克隆和序列分析,以探讨不同分离株之间H基因的差异。结果表明:采用同步接种的方法,分离到1株犬瘟热病毒(CDV GZ2),并以其RNA为模板,扩增克隆了该病毒血凝素(H)基因,进而构建原核表达质粒pET-H。该毒株H基因ORF大小为1 824bp,可编码607个氨基酸;与国内分离株氨基酸一致性为97.4%～98.5%,与国外分离株为89.6%～95.6%,与疫苗株在89.6%～91.6%。进化分析表明:CDV的分布具有一定地域性,CDV GZ2与国内东北地区分离株亲缘关系近,而与国外分离株亲缘关系相对较远。     

犬瘟热病毒株的分离鉴定及遗传变异分析

[目的]分离鉴定吉林地区一株犬瘟热病毒,为犬瘟热的防治提供依据。[方法]应用Vero细胞从疑是患犬瘟热藏獒脏器组织中分离病毒,并进行分子病毒学鉴定,进一步对该犬瘟热病毒株的血凝素蛋白（H）基因序列进行分析。[结果]确定该犬瘟热分离株为A-sia-Ⅰ型犬瘟热,命名为ZA10-JL。[结论]对进一步研究犬瘟热,预防以及流行病学调查都有重要的参考作用。     

鸡肾型传染性支气管炎病毒广东分离株s1基因的序列分析

采用特异性RT-PCR方法,对9株广东传染性支气管炎病毒分离株的s1基因进行序列扩增、测定,应用DNAStar、MEGA4.1等分析软件将这些分离毒株与常用疫苗毒株、国际上其它血清型的代表参考毒株的s1基因序列进行同源性和进化关系分析。研究结果表明:9个分离毒株都属于类4/91分支,与疫苗株H120和Ma5的亲缘关系较远。