猪CD8α分子胞外区基因片段的原核表达

采用PCR技术从pGEM-pCD8α重组质粒中克隆了pCD8α胞外区去信号肽基因片段,并构建原核表达载体pET-30a-pCD8α-ED,在不同IPTG浓度和时间下进行诱导表达.结果表明:SDS-PAGE表达出约25ku的融合蛋白,目的蛋白主要以包涵体的形式存在,IPTG最佳诱导浓度为0.5mmoL·L-1,诱导6h时表达量达到峰值;Western-blot结果显示,在25ku左右出现杂交条带,表明表达的融合蛋白能被抗HIS标签的单克隆抗体识别,说明目的蛋白在大肠杆菌中得到了成功表达.     

猪CD163的分子克隆、原核表达及免疫血清制备

采用生物信息学软件分析猪CD163结构,用RT-PCR从猪巨噬细胞RNA中扩增猪CD163前1 511 bp cDNA片段,再用PCR扩增抗原指数较高的697 bp cDNA片段,将其克隆人质粒载体进行序列测定;将cDNA片段克隆入含细胞毒性T细胞相关抗原4 (CTLA-4)胞外区(IgV)编码序列的原核表达载体,用I...     

猪圆环病毒Ⅱ型ORF2基因的克隆与表达

猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)是引起断奶后仔猪多系统衰竭综合症(PMWS)的重要病原.笔者用PCR方法扩增PCV2截短的ORF2基因并亚克隆至表达载体pGEX-6P-1,构建的重组表达质粒命名为pGEX-ORF2,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),在37℃经IPTG诱导4h.PCV2的cap蛋白以包涵体形式得到有效表达.经SDS-PAGE及Western blot分析表明表达的重组蛋白分子量约为46KD,重组蛋白具有良好的免疫学活性.     

绵羊CD58基因的克隆与原核表达

通过对猪、绵羊CD58mRNA序列比对,设计出绵羊CD58的特异性引物,应用反转录PCR技术从绵羊淋巴细胞mRNA中扩增出绵羊CD58基因,将该基因克隆到原核表达载体pGEX4-1中进行原核表达.结果表明:克隆出的绵羊CD58cDNA长807bp,其中包含了开放式阅读框;该基因在大肠杆菌中进行表达,SDS-PAGE电泳在53ku处能观察到特异表达的融合蛋白,产物通过Western-blot检测证实,可以被CD58单克隆抗体识别.     

猪CD40L基因的原核表达及特异性多克隆抗体制备

从猪外周血淋巴细胞中克隆猪CD40L基因,构建表达载体pET-CD40L,转化大肠杆菌BL21(DE),表达获得相对分子质量约为48x103的重组融合蛋白.以纯化的重组蛋白免疫新西兰兔,获得抗猪CD40L的特异性抗体.间接ELISA检测到多克隆抗体效价达到1:12 800,Western-blot检测结果表明,得到的抗体既可与纯化的CD40L蛋白特异性结合,又可与表达猪CD40L的重组杆状病毒特异性结合.     

猪CD8β分子重组蛋白的表达、纯化与免疫活性鉴定

对猪CD8β(pCD8β)基因重组蛋白的表达纯化条件以及免疫活性进行了研究.结果表明:pET-28a-pCD8β重组菌诱导表达产物的分子量约为24 ku,与预计的分子量大小相符.包涵体形式表达的重组蛋白的纯化产物经免疫印迹分析和ELISA检测证实有良好的特异性反应;SDS-PAGE后的目的胶带以直接研磨法和电洗脱纯化法加佐剂分别免疫BALB/c小鼠后,ELISA检测抗原免疫效价均大于1∶6 400,说明本试验对pET-28a-pCD8β纯化的重组蛋白具有良好的免疫原性和反应原性,可以制备CD8β的单克隆抗体.     

猪圆环病毒Ⅱ型ORF2部分基因的克隆及原核表达

根据发表的猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)ORF2基因序列,设计合成1对特异性引物,从分离到的PCV2吉林株(JL01)中扩增出PCV2 ORF2579 bp的核苷酸片段,克隆到表达载体pET-32a中,经BamHⅠ和HindⅢ酶切及序列分析获得阳性重组表达质粒pET-32a-ORF2。将其转化到表达宿主菌BL21中,经IPTG诱导,成功表达了ORF2基因编码的部分结构蛋白,分子量为40 kD。通过SDS-PAGE和Western检测表明,表达的重组蛋白能够被PCV2阳性血清所识别,具有良好的反应原性。     

大麦纤维素合成酶截短体的重组表达及多克隆抗体制备

对大麦纤维素合成酶(Hordeum vulgare CesA,Hv-CesA)的蛋白质序列进行疏水性分析和跨膜区预测,获得截短的亲水性非跨膜区特征序列,采用PCR扩增截短序列编码区,定向克隆入N端带有His标签的pET-28a(+)表达载体中,并转化大肠杆菌进行诱导表达,利用钴离子螯合层析纯化重组表达蛋白,并制备高效价的多克隆抗体。结果表明,截短的Hv-CesA基因在大肠杆菌Rosetta gami2以包涵体的形式高效表达,western blotting显示制备的多克隆抗体能特异识别其对应的抗原。     

猪淋巴结PKR基因的克隆与体外初步表达

【目的】克隆猪淋巴结双链RNA激活的蛋白激酶(PKR)基因,并在体外初步表达,为研究流感病毒感染时猪PKR与P58IPK在体内外的相互作用奠定基础。【方法】用Trizol法从猪淋巴结中提取总RNA,RT-PCR法扩增猪PKR基因的完整编码区,将该片段连接到原核表达载体pGEX-4T-1和真核表达载体pDsRed1-N1中,采用SDS-PAGE检测原核表达载体pGEX-PKR在大肠杆菌BL21中的表达情况,用脂质体转染法将真核表达载体pD-sRed1-PKR转入猪脐静脉血管内皮细胞系(SUVECs),Western blot检测其在细胞中的表达。【结果】PCR扩增得到了1 754bp的DNA片段,与预期结果一致;原核表达载体pGEX-PKR和真核表达载体pDsRed1-PKR经双酶切和核酸测序分析,表明载体构建成功;SDS-PAGE检测结果表明,pGEX-PKR重组质粒在大肠杆菌中成功表达;Westernblot检测到pDsRed1-PKR重组质粒在SUVECs中成功表达。【结论】成功克隆了猪淋巴结PKR基因,并在体外初步表达成功。     

鲤鱼CD74同源基因的原核表达及多克隆抗体制备

通过PCR扩增出鲤鱼CD74同源基因的胞外片段trcIclp1和trcIclp2,将其克隆到原核表达载体pQE-30中,并在大肠杆菌菌株M15中经IPTG诱导表达,经过变性,Ni-NTA柱亲和纯化,透析复性,得到可溶性纯化蛋白。将纯化后的蛋白免疫NIH小鼠制备多克隆抗体,经Western鉴定,ELISA法测其效价分别高达1∶51 200和1∶12 800。     

猪RBP-4基因原核表达载体的构建及表达

为构建猪RBP-4基因原核表达载体,并在大肠杆菌中表达蛋白。取成年母猪正常卵巢组织提取总RNA,RT-PCR后回收扩增产物,构建表达载体pEASY-E1-RBP4,转化BL21(DE3)pLysS,IPTG诱导表达。测序结果显示,RT-PCR获得的cDNA全长序列与GenBank中的序列基本一致。原核表达产物经SDS-PAGE电泳鉴定,其以包涵体形式表达。试验成功构建了猪RBP4基因原核表达载体,并在大肠杆菌中表达,为后续蛋白纯化及抗体的制备奠定基础。     

宁乡猪生长激素基因的克隆及其原核表达载体的构建

[目的]研究了宁乡猪生长激素基因(nxGH)的克隆及其原核表达载体的构建。[方法]根据已报道的猪生长激素基因序列设计了1对特异性引物,应用RT"PCR技术从宁乡猪脑垂体中克隆了nxGH编码区序列。[结果]扩增片段全长651 bp,共编码216个氨基酸。该序列与已报道的三元和五指山猪生长激素cDNA基因核苷酸序列同源性为99.85%。将nxGH cDNA序列定向插入pET"32a原核表达载体中,成功构建重组原核表达质粒pET"GH。[结论]为下一步制备宁乡猪生长激素抗体奠定了基础。     

猪圆环病毒Ⅱ型河南地方株 ORF3的克隆及原核表达

为获得猪圆环病毒Ⅱ型 ORF3编码蛋白,研究该蛋白的特性及功能,根据 GenBank 数据库中PCVⅡ的基因组序列设计引物,利用 PCR 从病料基因组 DNA 中扩增 PCVⅡ河南地方株 ORF3,将其克隆至表达载体 pET 32a 中进行诱导表达,SDS PAGE 电泳检测重组蛋白表达情况,采用 Ni＋NTA 亲和纯化表达产物,透析复性后免疫日本大白兔制备多抗血清,并采用 ELISA 和 Western blot方法检测多抗血清的效价和特异性。结果显示,PCR 扩增获得全长315 bp 的 ORF3,重组质粒经测序和双酶切证实构建正确;SDS PAGE 结果显示,ORF3能够在大肠杆菌中表达,产物的分子量约为30 ku,以包涵体形式存在;纯化的重组蛋白具有较好的抗原性,制备的多抗血清抗体效价达1∶12800以上,抗体特异性高,能与表达的 ORF3编码蛋白结合。成功克隆了 PCVⅡ河南地方株 ORF3并实现原核表达,获得纯化的重组 ORF3编码蛋白。     

猪白细胞介素-2基因在大肠杆菌中的表达及其生物学活性测定

【目的】在大肠杆菌中表达猪白细胞介素-2(pIL2),并鉴定其生物学活性。【方法】以含猪IL-2基因的重组质粒pGEM-pIL2为模板,PCR扩增IL-2基因。将猪IL-2基因定向克隆到原核表达载体pGEX-6p-1中,转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)感受态细胞,在IPTG诱导下表达融合蛋白GST-pIL2,并应用甲基噻唑基四唑(MTT)试验测定融合蛋白的生物学活性。【结果】以含有猪IL-2基因的重组质粒pGEM-pIL2为模板,PCR扩增出1条约420bp的带。所获重组质粒pGEX-pIL2经酶切、测序鉴定,证实含有目的片段,且连接、构建正确。SDS-PAGE电泳结果显示,可检测到相对分子质量约为42ku的GST-pIL2,Western-blot证实GST-pIL2能与兔抗猪IL-2单克隆抗体发生特异性反应。表达蛋白经薄层层析扫描分析,表达量约占菌体总蛋白的40%。MTT试验证实,表达产物经变性、复性后能极显著促进猪脾淋巴细胞增殖。【结论】猪IL-2基因在大肠杆菌中得到表达,表达的蛋白具有一定的生物学活性。     

猪CD8α分子基因的克隆与初步鉴定

[目的]为了研究CD8分子的生物学功能。[方法]自行设计一对引物,从猪脾细胞中,克隆了猪CD8α链基因,获得大小为700 bp的基因片段,并对其进行鉴定。[结果]结果表明,该基因片段的核苷酸序列与已报道猪的同源性为99.2%,与豚鼠、人、猴子、猫和狗的同源性分别为35.6%、55.7%、55.6%、56.4%和56.8%。[结论]该研究为进一步研究CD8分子的生物学功能提供了依据。     

鸡MHCⅡβ链基因的克隆和表达及其抗体制备

用自行设计的1对引物,通过RT-PCR从鸡脾细胞中分别克隆了鸡MHCⅡβ链基因片段,大小为798 bp.核苷酸测序结果表明,与已登录的基因序列同源性为95%.将该基因片段插入含谷胱甘肽(GST)基因的质粒pGEX-4T-1,构建了pGEX-4T-1-chMHCⅡβ.经诱导表达,获得分子大小约为53 000的融合蛋白,其中chMHCⅡβ链大小约27 000.经亲和层析,获得纯化GST-β融合蛋白,进一步用此蛋白免疫小鼠,制备了鼠源抗鸡MHCⅡβ链抗体.经过琼扩和ELISA检测,表明该融合蛋白具有良好的抗原性.     

猪圆环病毒2型Cap基因的克隆与原核表达

利用PCV2鄂州株的基因序列设计特异性引物,分别在上、下游引物中加入Sac I和Hind III酶切位点,扩增出PCV2鄂州株的ORF2基因;将该片段克隆至p ET-28a原核表达载体,经PCR、酶切鉴定,成功构建了阳性重组表达质粒p ET-ORF2。将其转入大肠杆菌Rosetta中,经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳分析确定重组蛋白大小为34.5 k D,主要以包涵体的形式表达。优化后确定最佳诱导条件为:37℃,至OD值0.4⁰.6时加入终浓度为1 mmol/L的IPTG,诱导5 h。表达产物经His-tag镍柱纯化后进行Western-blot分析,结果表明表达的重组蛋白能够与PCV2标准阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应原性。     

猪传染性胃肠炎病毒SC-Y株N基因的克隆及原核表达

通过PCR方法扩增猪传染性胃肠炎病毒SC-Y株核衣壳蛋白(N)基因,然后将重组到pMD18-T载体中的约1174 bp的基因片段亚克隆到PET-32a( )表达载体上,通过酶切及PCR鉴定阳性的重组质粒命名为PET-N,核苷酸及推导的氨基酸序列分析表明,该基因与其他猪传染性胃肠炎病毒相应基因具有很高的同源性,将阳性重组质粒转化BL21(DE3),经IPTG诱导可表达分子量约66 kD的融合蛋白,N基因的表达可为传染性胃肠炎病毒的诊断提供良好的物质材料。     

猪圆环病毒2型Cap基因的克隆与原核表达

利用PCV2鄂州株的基因序列设计特异性引物,分别在上、下游引物中加入Sac I和Hind III酶切位点,扩增出PCV2鄂州株的ORF2基因;将该片段克隆至p ET-28a原核表达载体,经PCR、酶切鉴定,成功构建了阳性重组表达质粒p ET-ORF2。将其转入大肠杆菌Rosetta中,经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳分析确定重组蛋白大小为34.5 k D,主要以包涵体的形式表达。优化后确定最佳诱导条件为:37℃,至OD值0.4~0.6时加入终浓度为1 mmol/L的IPTG,诱导5 h。表达产物经His-tag镍柱纯化后进行Western-blot分析,结果表明表达的重组蛋白能够与PCV2标准阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应原性。