大鲵虹彩病毒的形态结构及其包涵体特征

运用电镜和免疫荧光技术,对纯化的大鲵(Andrias davidianus)虹彩病毒粒子、感染病毒的EPC细胞以及确诊感染病毒的病鲵组织样品进行观察和分析。结果表明,纯化的大鲵虹彩病毒负染后电镜下显示球形结构,具囊膜,直径约150 nm;感染EPC细胞中的病毒颗粒呈典型的正二十面体结构,由核衣壳和核心构成,核衣壳呈正六边形,对角直径为(150±5)nm(N=30),核衣壳厚度约5 nm,核心直径为(98±18)nm(N=27)。在病鲵病变的肺和肾组织中发现存在大量聚集或分散的病毒颗粒,其形态特征和感染EPC细胞超薄切片观察的结果一致。免疫荧光电镜观察结果显示,感染病毒的细胞可观察到明显的红色荧光信号,且呈斑块状分布,大小不等。综合大鲵虹彩病毒初步的形态发生和免疫荧光观察结果,认为病毒感染细胞后在不同的发生时期会形成不同类型的病毒包涵体。     

大鲵虹彩病毒β-丙内酯灭活方法的研究

为探讨β-丙内酯(β-propiolactone,BPL)灭活大鲵虹彩病毒(Giant salamander iridovirus,GSIV)的最适条件,研究了BPL对GSIV的灭活方法。采用终浓度分别为0.025%、0.05%、0.1%、0.2%的BPL灭活细胞培养的GSIV,4℃条件下分别灭活24 h、48 h、72 h、96 h,通过细菌培养、细胞培养、病毒核酸PCR扩增以及鱼体感染试验进行灭活病毒的安全性检验,确定最适灭活条件。试验结果表明,GSIV经终浓度为0.1%的BPL 4℃灭活处理72 h后可完全灭活病毒,灭活病毒无细菌污染,接种对GSIV敏感的鲤上皮瘤细胞系(EPC)细胞无细胞病变效应(CPE)出现,病毒主衣壳蛋白(MCP)基因特异性引物PCR反应未扩增出靶基因产物,灭活病毒对健康大鲵的感染试验未出现疾病症状。灭活效果检测结果表明,与未灭活GSIV相比较,最适灭活条件下的GSIV结构蛋白与抗原性未发生显著变化。结论显示BPL可用来灭活GSIV,本研究确立了BPL灭活GSIV的最适条件,为大鲵虹彩病毒细胞培养灭活疫苗研究奠定了重要基础。     

中国大鲵“烂脚病”病原菌的分离鉴定

为了解重庆地区部分中国大鲵(Andrias davidianus)养殖场流行"烂脚病"的病因,对患"烂脚病"中国大鲵进行剖检后,在其肺部分离到一株优势菌CQWU2013,对该优势菌进行致病性实验、生理生化特性鉴定、16S r DNA测序和药敏实验。结果显示:中国大鲵"烂脚病"是由肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella mobilis)引起的,该菌为短链状排列的革兰氏阴性杆菌,其生理生化特性符合肺炎克雷伯氏菌的指标,16S r DNA序列同源性高达99.6%;药敏实验显示该菌对部分青霉素类、β-内酰胺类、氨基糖苷类和糖肽类药物耐药,对供试的20种药物中有7种药物出现明显的耐药现象。     

大鲵细胞与大鲵虹彩病毒的微载体规模化培养工艺及优化

利用Cytodex 3微载体悬浮培养系统规模化培养大鲵肌肉细胞(GSM)和大鲵虹彩病毒(GSIV),研究了微载体培养GSM细胞的形态和增殖特性,同时测定了病毒在培养系统中的增殖动态相关指标。结果显示,在Cytodex 3微载体培养系统中,将GSM细胞在贴壁期以转速30 r/min,每静置40 min搅拌2 min的方式间歇搅拌,10 h后贴壁率可达95%,培养基中最适血清浓度为10%,最适微载体浓度为2 g/L,最适细胞初始接种密度为1.2×10~5 cells/mL;增殖期以25 r/min的连续搅拌方式可以达到最佳的细胞生长效能。倒置显微镜与扫描电镜观察结果显示,GSM细胞呈长梭形,紧密贴附在Cytodex 3微载体上,生长良好。采用优化的工艺条件培养GSM细胞,以感染复数(MOI)为0.5的剂量接种GSIV至规模化培养的GSM细胞,48 h后GSM细胞出现典型的细胞病变效应,72 h病毒滴度达到最高TCID_(50)=10~(–8.50±0.20)/mL。本研究为大鲵虹彩病毒病疫苗的规模化生产工艺研究奠定了前期基础。     

大鲵虹彩病毒病灭活疫苗安全性与免疫效力研究

为了探明大鲵虹彩病毒病灭活疫苗的安全性与免疫效力,采用β-丙内酯(β-propiolactone,BPL)灭活鲤上皮瘤细胞(Epithelioma papilloma cyprini,EPC)内增殖的大鲵虹彩病毒(giant salamander iridovirus,GSIV),制备成大鲵虹彩病毒病灭活疫苗,利用免疫...     

大鲵精液离体保存的初步研究

针对大鲵(Andrias davidianus)的性腺发育不同步,为提高受精率,对其精液特性和保存条件进行初步研究。人工辅助采集精液,对精液量、酸碱度、密度、活力等基本特性进行常规测定。分别对保护液、光照、温度等保存条件进行分组研究试验。结果表明：雄性亲鲵的精液量最大可达12 ml/kg,pH值6.7～7.0微酸状态,密度215～1075万/ml,精子活力为0.7～0.9。离体保存条件下,室温暗环境（20LUX）较光环境（400LUX）可延长存活时间0.5h,暗环境低温（0～4℃）较室温（21～22℃）可延长存活时间3d,低温暗环境原精液中添加保护液比对照组精子存活时间延长6～12h。     

大鲵遗传多样性分析

以线粒体DNA控制区为分子标记,对汉水流域大鲵(Andriasdavidianus)的遗传多态性进行了研究。在获得的757bp的碱基序列中,有18个多态性核苷酸变异位点,占全部碱基数的2·38%;基因突变以转换为主,有一处插入或缺失;A、T、C、G四种碱基的平均含量分别为31·8%、33·0%、20·9%、14·3%,且A+T的含量(64·8%)明显高于G+C的含量(35·2%)。28个样本检测到8种单倍型,单倍型间的核苷酸变异在0·13%~1·74%之间,单倍型多样性(Haplotypediversity)指数和核苷酸多样性(Nucleotidediversity)指数分别为h=0·8230±0·0440和π=0·00446±0·00122,显示了大鲵驯养群体的的遗传多样性水平较低。     

大鲵细菌性疾病研究进展

为深入了解和治疗大鲵(Andrias davidianus)细菌性疾病,针对已知的大鲵细菌性疾病的致病病原菌、发病的临床特征及诊断防治措施进行了简单概述,并提出了相应研究展望。     

大鲵源致病性弗氏柠檬酸杆菌的分离、鉴定和药物敏感性

为鉴定患病大鲵(Andrias davidianus)病原菌,从大鲵肠、胃、脾脏中分离得到菌株int1705,分离菌株经形态特征观察、生理生化特性测定、16S rRNA和aspC管家基因序列测定及系统发育学分析,鉴定为弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)。经人工感染,结果显示:菌株int1705能使健康大鲵发病并致死,半致死浓度(LD50)为3.16×10 6 CFU/mL,且发病症状与自然发病相似。药敏试验结果显示,菌株int1705对多粘菌素B、头孢他啶、诺氟沙星、氧氟沙星、复方新诺明等10种药物敏感。     

大鲵病毒性疾病最新研究进展

中国大鲵(Andrias davidianus)是我国的特有物种,具有极高的产业开发价值,但病毒性疾病严重危害大鲵人工养殖产业的健康发展。本文对大鲵虹彩病毒的分类地位及主要特征、大鲵虹彩病毒病的病理症状及诊断防治措施几个方面进行了简要概述,以期为大鲵病毒性疾病的深入研究提供科学依据。     

中国大鲵皮肤营养成分分析

采用常规方法对大鲵(Andrias davidianus)皮肤水分、粗蛋白质、粗脂肪、灰分、氨基酸以及Ca、P、Zn等营养成分进行分析和评价.结果显示:新鲜大鲵皮肤水分含量为77.84%,粗蛋白含量25.45%,粗脂肪含量1.23%,灰分含量0.82%;矿质元素中Ca含量101.20 μg/g、P含量730μg/g、Z...     

大鲵虹彩病毒的PCR检测及初步应用

通过了解大鲵虹彩病毒(Giant salamander iridovirus,GSIV)在EPC细胞接毒情况和PCR的实际检测情况,为大鲵的病毒检测提供必要判断依据和检测方法.通过细胞接毒和组织分离分别提取病毒质粒,进行普通PCR扩增,电泳分析,比较病毒细胞培养和组织直接提取结果.Gsiv病毒体外培养:经传代48 h的EPC细胞,25℃培养,12h后可观察到CPE出现,24 h病变明显,CPE达15％,48 h后CPE可达70％,72 h后细胞完全脱落;PCR检测:对3个样本分别从组织提取和经细胞扩增分离的病毒进行普通PCR扩增检测,经细胞培养扩增的3个样本全部呈阳性;经组织提取的3个样本,2个呈阳性,一个呈阴性;电泳观察,病毒的扩增产物在500 bp左右.在体外环境下GSIV是高病力的一种病毒,对EPC细胞在25℃时效应时间为3d,普通PCR经组织的检出率低,经细胞培养扩增可提高检出率但耗时久,不利于实际生产中快速、准确诊断疫情的需要.     

大鲵虹彩病毒贵州分离株MCP基因的克隆与原核表达

根据Gen Bank中大鲵虹彩病毒主衣壳蛋白MCP(major capsid protein,MCP)基因序列(序列号:KF512820),设计一对特异性引物,以大鲵虹彩病毒贵州分离株基因组DNA为模板,PCR扩增大鲵虹彩病毒MCP基因并测序,与Gen Bank中大鲵虹彩病毒MCP基因进行比对,然后将其亚克隆到原核表达载体p ET-32a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导后进行Western blot分析。结果显示:PCR扩增出长度为1 392 bp的片段,与Gen Bank中大鲵虹彩病毒MCP基因核苷酸序列相似性为99.7%~99.9%,SDSPAGE电泳显示该重组蛋白的相对分子质量约为67×103。免疫原性检测结果表明,该重组蛋白可与兔抗大鲵虹彩病毒阳性血清特异性反应,具有免疫原性。     

科研人员首次分离到大鲵出血病病原——大鲵虹彩病毒

近日,水科院长江所鱼类病害研究室曾令兵研究员、水产养殖与遗传育种研究室肖汉兵研究员带领的研究团队,利用自己建立与收集保藏的鱼类细胞系资源在国内外首次成功地从患典型出血病的大鲵幼鱼、成鱼体内分离到大鲵虹彩病毒,填补了一项重要的国内外空白。     

工厂化养殖条件下大鲵适宜养殖密度的研究

在工厂化养殖条件下,研究了养殖密度对2~5龄大鲵(Andrias davidianus)摄食与生长的影响。结果表明:2龄大鲵适宜养殖密度为27尾/m2,该组特定生长率显著高于9尾/m2组、18尾/m2组(P<0.05),且饵料系数最低;当养殖密度为17尾/m2时,3龄大鲵的增重率、特定生长率最大,饵料系数最低且与低密度5尾/m2组差异显著(P<0.05),确定3龄大鲵的适宜养殖密度为17尾/m2;4龄大鲵特定生长率的最大值出现在养殖密度为10尾/m2,显著高于16尾/m2组(P<0.05),且饵料系数最低,4龄大鲵的适宜养殖密度为10尾/m2;5龄大鲵的适宜养殖密度为5尾/m2,特定生长率与高密度组9尾/m2差异显著(P<0.05),饵料系数最低。大鲵适宜养殖密度与体重存在显著的负相关性,关系式为y=-0.016 4x+25.34(r2=0.839 9)。     

十六种中草药及其复方对大鲵致病性豚鼠气单胞菌的体外抑制作用

应用二倍稀释法测定了诃子、五倍子、石榴皮等16种中草药及其复方对大鲵(Andrias davidianus)致病性豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度,应用棋盘法设计16种中草药组合的120种双联复方和10种中草药组合的120种三联复方,评估了复方的体外抑菌作用。结果表明:16种中草药对大鲵致病性豚鼠气单胞菌均有一定程度的抑菌作用,抑菌作用强弱依次为诃子、五倍子、石榴皮、大黄、槐角、覆盆子、黄芩、金樱子、肉苁蓉、丁香、川牛膝、赤芍、知母、防风、天葵子及罗汉果;在120个中草药双联复方中,5.8%为显著协同作用,82.6%为协同作用,11.6%为相加作用;在120个中草药三联复方中,29.2%为显著协同作用,87.5%为协同作用。因此,合理的中草药配伍能提高对大鲵致病性豚鼠气单胞菌的体外抑菌作用。     

大鲵感染虹彩病毒的诊断和治疗

2013年7月,陕西省汉中某大鲵养殖场发生以大鲵体表和四肢多处溃烂并伴有出血为特征的疾病,染病大鲵大量死亡。经临床观察、病理解剖及实验室检测,最后确诊病原为大鲵虹彩病毒。通过采取综合防治措施,养殖场大鲵疫情得到有效控制。     

一株大黄鱼虹彩病毒的分离鉴定及多克隆抗体的制备

2021年7月,浙江省象山某养殖场养殖的大黄鱼（Larimichthys crocea）出现类似大黄鱼虹彩病毒引起的疾病。采用鲤上皮瘤细胞培养和病毒主要衣壳蛋白测序分析的方法,从患病的大黄鱼中分离到一株病毒。该病毒接种到鲤上皮瘤细胞（EPC）后出现空斑、脱落的细胞病变症状。根据虹彩病毒MCP和ATPase基因保守序列设计特异性引物对病毒组织样本进行PCR扩增,得到分别为1 367 bp和740 bp的目的基因片段。将MCP基因扩增片段测序,经BLAST对比及系统发育树聚类分析,确定该分离的病毒属虹彩病毒科细胞肿大病毒属。通过蔗糖密度梯度离心纯化,用透射电镜观察该病毒粒子呈正六边形,直径为120～150 nm。用纯化病毒作为抗原免疫小鼠获得抗大黄鱼虹彩病毒的多克隆抗体,效价为1∶7 000;通过SDS-PAGE和Western blotting初步确定3个免疫蛋白。本研究为大黄鱼虹彩病毒纯化提供一种新方法,并初步分离出免疫蛋白,为该病毒相关分子生物学研究、蛋白研究以及疫苗制备等提供理论依据。     

大鲵虹彩病毒理化及生物学特性研究

对大鲵虹彩病毒(Giant salamander iridovirus,GSIV)的理化特性及生物学特性进行了研究。结果表明:GSIV对热处理敏感,56℃和65℃处理30 min均可彻底灭活病毒;GSIV经酸(pH3)和碱(pH10)处理,病毒滴度(TCID50)与对照组相比较分别下降了8.58、9.04个对数级,差异极显著(P<0.01);GSIV经有机溶剂氯仿、乙醚以及胰蛋白酶处理,TCID50与对照组相比较分别下降了9.33、7.83、6.49个对数级,差异极显著(P<0.01)。冻融次数对GSIV滴度的影响不显著(P>0.05)。GSIV对细胞培养物的感染性试验结果表明,GSIV可在鲤上皮瘤细胞系(Epithelioma papilloma cyprini,EPC)、斑点叉尾鮰肾脏细胞系(Channel catfish kidney,CCK)、虹鳟鱼性腺细胞系(Rainbow trout gonadal,RTG-2)等细胞中增殖,但在EPC、CCK细胞中增殖速度快,TCID50高;GSIV在EPC细胞中的最适生长温度是25℃。GSIV在EPC细胞中增殖动态试验结果表明,GSIV感染细胞6 h后TCID50开始快速上升,进入对数增长期,72 h时TCID50达到最大值,以后趋于稳定。GSIV感染EPC细胞超薄切片透射电镜观察结果显示,在EPC细胞质中可见大量虹彩病毒样颗粒,呈晶格状排列,直径约140 nm。     

大鲵虹彩病毒流行株的分离及其主衣壳蛋白编码基因序列比较分析

大鲵虹彩病毒(giant salamander iridovirus, GSIV)是近年中国大陆新发现的引起人工养殖大鲵(Andrias davidianus)大规模死亡的病毒病原。为了揭示大鲵虹彩病毒流行株的基因型差异, 本研究对2010–2012年采集自全国不同大鲵养殖区域的患虹彩病毒病的大鲵样本进行了分子检测、病毒分离培养以及病毒主衣壳蛋白(major capsid protein, MCP)基因测序与比对分析。结果显示, 采自陕西、湖北、湖南、浙江、江西、福建等省的10个样本检测为阳性, 通过细胞培养获得10株病毒流行株。对该10株流行株MCP基因的测序与比对分析发现, 核苷酸序列相似性达到99.7%~100%, 其推测的氨基酸序列无明显差异, 证实中国大鲵虹彩病毒流行株属同一基因型。系统进化树分析结果表明, 所选大鲵虹彩病毒与蛙病毒分别聚为一枝, 但其亲缘关系较近。本研究结果旨为大鲵虹彩病毒病的疫苗研制及其免疫防控技术研究奠定基础。