耐碱锰超氧化物歧化酶（Mn-SOD）基因工程菌的构建及其表达条件研究

利用PCR技术以Bacillus sp.110-2基因组DNA为模板,扩增出606 bp编码锰超氧化物歧化酶的基因Mn-sodA,将其连接到原核表达载体pET-30a(+),得到重组载体pET-sodA,重组载体在大肠杆菌BL21(DE3)中经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导得到表达。SDS-PAGE分析显示融合表达产物的分子量大小为26.5k Da,同核酸序列测定的推导值相符。对含有sodA的基因工程菌表达情况研究表明：重组蛋白全部以可溶性形式存在;重组酶的比活力252 U/mg,为原始菌株的2.1倍,目的基因在大肠杆菌中实现了高效表达;而且,重组酶还保留了野生型酶显著的耐碱能力。BL21（pET-sodA）基因工程菌的构建一方面提供了一种可利用的耐碱蛋白资源,另一方面探索了一种极端酶的生产方法。     

抗对硫磷基因工程四价抗体在大肠杆菌中高效表达与鉴定

为提高抗对硫磷基因工程四价抗体在大肠杆菌中可溶性表达量,本研究利用克隆技术得到四价抗体基因sc-sa,将该融合基因连接至表达载体pTO-T7的Ω序列和T7启动子下游,构建成功的表达质粒导入大肠杆菌OrigamiB(DE3),经IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western Blot鉴定表达产物,Ni亲和层析纯化蛋白,间接非竞争ELISA法测定该四价抗体的亲和力。结果表明在大肠杆菌OrigamiB(DE3)中表达分子量约为46kDa的四价抗体,0.1mmol/L的IPTG在30℃条件下诱导原核表达,外源蛋白占菌体总蛋白含量近50%,纯化后可溶性蛋白纯度在90%以上,ELISA结果显示该抗体与对硫磷结合呈阳性,抗体效价在1∶1×106以上,亲和常数为6.84×108L/mol。与母源抗体和相应单链抗体相比,利用pTO-T7载体四价抗体在大肠杆菌OrigamiB(DE3) 中可实现高效表达,且抗体效价和亲和力均得到进一步提高。     

耐碱锰超氧化物歧化酶基因(Mn-sodA)工程菌的构建及其表达条件

从Bacillus sp.110-2基因组上分离得到的耐碱锰超氧化物歧化酶基因(Mn-sodA),将其连接到原核表达载体pET-30a(+),得到重组载体pET-sodA,重组载体在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导得到表达.SDS-PAGE分析显示,融合表达产物的分子量大小为26.5 kD.对含有sodA基因工程菌的表达情况研究表明,重组蛋白全部以可溶性形式存在;重组酶的比活力252 U/mg,为原始菌株的2.1倍,目的基因在大肠杆菌中实现了高效表达;而且,重组酶还保留了野生型酶强的耐碱能力.BL21(pET-sodA)基因工程菌的构建提供了一种可利用的耐碱蛋白资源,同时探索了一种极端酶的生产方法.     

牛杀菌/通透性增加蛋白氮端片段的原核表达

目的 克隆牛杀菌/通透性增强蛋白(BPI)N端cDNA,构建原核表达载体,在大肠杆菌中表达BPI蛋白,并纯化重组蛋白。方法 参照Genbank报道的序列,应用RT-PCR技术,从牛嗜中性粒细胞mRNA中扩增出杀菌/通透性增加蛋白基因,然后将该基因插入原核表达载体pGEX-4T-1中,重组质粒转化大肠杆菌BL21,进行诱导表达。结果 获得BPI N端长度为714 bp的基因片断,序列分析证实该片断中有1个点突变。大肠杆菌中的表达产物为相对分子质量约为52×103的GST-BPI融合蛋白。结论 成功的表达和纯化了BPI重组蛋白。     

口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC基因的克隆与原核表达

以O型口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus，FMDV)为研究对象，通过RT-PCR扩增到非结构蛋白3ABC基因，定向克隆到原核表达载体pET-42a上。表达产物经SDS-PAGE和Western blot检测，证明重组载体pET-42a-3ABC成功地在大肠杆菌(Escherichia coli)中表达了3ABC蛋白，这一研究为建立以基因工程产品为抗原、鉴别诊断自然感染和免疫动物的方法提供了技术条件。     

乳腺高效表达拟蛛丝蛋白基因载体的构建及其克隆策略

6条长约80bp的寡聚核苷酸链，通过其互补末端延伸补平成3条双链DNA；3条双链DNA按3：1：3混合，PCR扩增得到大量拟蛛丝蛋白基因单体；将单体多聚化，加上设计好的信号肽和终止密码子，再将多聚体基因构建到乳腺高效表达载体pBC1上，使之成为乳腺高效表达的拟蛛丝蛋白基因载体。着重讨论了基因构建过程中DNA克隆技巧和策略。     

人乙醛脱氢酶2的原核表达及其条件优化

为实现人乙醛脱氢酶2（ALDH2）基因在原核生物中高效表达,将含有6×His标签和SUMO融合蛋白标签的人乙醛脱氢酶2基因的表达载体转化至宿主菌BL21（DE3）中。在异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导下,目的基因在大肠杆菌内高效表达。通过对表达条件的优化,37℃使用终浓度0.3mmol/L的IPTG诱导3h,重组大肠杆菌的表达量可占全菌蛋白的16%。SUMO融合蛋白标签的加入以及较低的诱导温度（16℃）有利于提高人乙醛脱氢酶2基因在大肠杆菌内的可溶性表达。     

bar因在大肠杆菌中的高效表达及其表达产物的分离和纯化

bar基因来源于P3301质粒载体,通过构建PB813测序载体对bar基因进行了测序,与GenBank中bar基因全编码区比较发现：在DNA上有两个碱基不同,但在蛋白质水平上完全相同。用PCR方法从P3301载体上克隆了552碱基的bar基因全长序列插入到大肠杆菌(Escherichia coli)表达载体pET30a( )中,构建了pET30a-bar融合表达载体并转人大肠杆菌宿主菌BL21(DE3)。在异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导下,pET30a-bar融合表达载体在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中以可溶性蛋白的形式高效表达了膦丝菌素乙酰转移酶(PAT),并通过金属鏊和层析一步纯化了目的蛋白。用肠激酶切除了融合蛋白的融合部分之后再一次通过金属鏊和层析,经过透析后获得了PAT纯品。     

鸡γ-干扰素cDNA的克隆和在大肠杆菌中的温度诱导型表达

克隆了鸡(Gallus gallus)的γ-干扰素cDNA，并用大肠杆菌(Escherichia coli)进行了温度诱导型表达。用PCR方法扩增了鸡γ-干扰素基因组基因，将其克隆到载体pGEM-T上。对重组载体的插入片段进行酶切分析和部分序列测定：证明了基因的正确性；克隆的鸡γ-干扰素基因的编码序列中存在一个点突变(G→A)，这一突变导致一个三联体密码子GAA变为AAA，编码的氨基酸由谷氨酸(Glu)变为赖氨酸(Lys)。用鸡γ-干扰素基因组基因构建了真核表达载体pCI-ChIFN。将这一真核表达载体转染兔成纤维细胞的细胞系中进行表达实验：提取转染后细胞裂解物中的RNA，再以此为模板进行RT—PCR，获得了完整的鸡γ-干扰素cDNA基因，同时证明鸡γ-干扰素基因组基因能在兔成纤维细胞系中表达。用鸡γ-干扰素cDNA构建了温度诱导型原核表达载体pBVcDNA，并将其转导到大肠杆菌DH5α中，经细菌发酵和温度诱导，表达了一个18kD的特异蛋白，其表达量占细菌总蛋白的8．75％。     

手掌参中赤霉酸诱导的富含半胱氨酸蛋白基因的表达、纯化及鉴定

目的: 构建含赤霉酸诱导的富含半胱氨酸蛋白基因(gcgasa)的原核表达载体,并在E.coli BL21(DE3)中表达。材料：手掌参。方法：设计带有EcoR I和Hind III酶切位点的引物,分别对gcgasa基因编码区全长及信号肽缺失的片段进行PCR扩增,将目标片段克隆入原核表达载体pET-32(a),构建重组质粒。经测序鉴定后,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达融合蛋白,并采用SDS-PAGE、Western-blotting、电镜超薄切片技术检测外源蛋白的表达及定位情况。对于水溶性蛋白,采用Ni2+-NTA亲和层析及凝胶过滤手段纯化。结果: 含有信号肽的外源基因在大肠杆菌周质空间中以包含体形式存在,而信号肽缺失的片段主要以可溶形式表达,经Ni2+-NTA纯化可获得目的蛋白。结论：首次在原核表达系统中高效表达了水溶性的gcgasa蛋白,为其结构和功能的研究奠定了基础。     

在大肠杆菌内高效表达大分子量拟蜘蛛牵丝蛋白

依据已报道的蜘蛛(Nephilaclavipes)牵丝蛋白部分cDNA序列,设计合成两种不同结构的拟蜘蛛牵丝蛋白基因单体,大小分别为360和390bp。多聚化得到8倍体和16倍体后,克隆到表达载体pET-30a,得到4种表达载体,转化大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21(DE3)诱导表达。用自制的抗蜘蛛牵丝蛋白血清Westernblot检测,表达产物呈梯度排列,主带与预计大小一致。蜘蛛牵丝蛋白表达量最高为800mg/L。     

Expression of High-molecular-weight Artificial Spider Dragline Silk Protein in Escherichia coli

依据已报道的蜘蛛（Nephila clavipes）牵丝蛋白部分cDNA序列，设计合成两种不同结构的拟蜘蛛牵丝蛋白基因单体，大小分别为360和390 bp。多聚化得到8倍体和16倍体后，克隆到表达载体pET-30a，得到4种表达载体，转化大肠杆菌（Escherichia coli）BL21(DE3)诱导表达。用自制的抗蜘蛛牵丝蛋白血清Western blot检测，表达产物呈梯度排列，主带与预计大小一致。蜘蛛牵丝蛋白表达量最高为800 mg/L。     

家蚕3-羟酰辅酶A脱氢酶基因全长cDNA克隆及其在质型多角体病毒感染家蚕的差异表达

家蚕质型多角体病毒（Bombyx mori cytoplasmic polyhedrosis virus,BmCPV）是家蚕的重要病毒病原之一,往往给养蚕业生产造成极大危害。我们以前的研究运用基因芯片技术在感染质型多角体病毒的家蚕中肠中鉴定出一个差异表达的3-羟酰辅酶A脱氢酶蛋白基因（Bombyx mori3-hydroxyacyl-CoA dehyrogenase protein gene-Bm3HAD）。本研究利用cDNA末端快速扩增技术（RACE）克隆了该基因,其全长cDNA序列为1168bp,包含一个83bp5＇端非翻译区序列（5＇-UTR）、一个930bp的开放阅读框（ORF）和一个155bp的3＇端非翻译区序列（3＇-UTR）;基因结构分析发现该基因由5个外显子和4个内含子组成。RT-PCR结果显示该基因在家蚕中肠、脂肪体、血液、丝腺及生殖体中均有表达。荧光定量PCR结果表明该基因在BmCPV感染初期为上调表达,随着病毒感染的进展,该基因的表达水平逐渐降低,并转变为下调表达。研究结果为进一步研究BmCPV对家蚕致病的分子机制提供了有益的信息。     

管理措施及土壤因子对5种农田生境地表蜘蛛群落多样性的影响

以往的研究表明有机管理有利于生物多样性保护,但在不同农业生境类型中是否都存在这个结论呢?基于此问题,本研究在一个多生境的有机管理农场与一个相邻的多生境常规集约化管理农区,采用陷阱法进行蜘蛛取样,对比有机和常规管理措施下大棚菜地、果园、稻田田埂、露天田块及农田边界等5种生境类型的农田蜘蛛多样性的差异,并分析土壤因子对蜘蛛多样性的影响。研究发现:1)有机管理与常规管理的蜘蛛物种数没有显著差异,但有机管理的果园中蜘蛛个体数比常规管理的果园中多139%,且差异显著。同一管理措施下,仅常规管理农田区的农田边界蜘蛛个体数和物种数分别显著高于其他生境均值104%和59%。2)有机管理农场比常规管理农田的蜘蛛物种组成差异略大,且在有机管理下不同生境间的蜘蛛群落组成差异更明显。3)土壤因子中有机质、全氮、全磷含量等对蜘蛛群落结构有显著影响,但对蜘蛛个体数和物种数没有显著影响,仅土壤Cu含量和蜘蛛个体数呈显著负相关。在本研究中虽然有机管理和土壤因子对蜘蛛多样性有一定影响,但不同生境间管理强度、植被结构等差异对蜘蛛多样性的影响更大。因此,发展多种农业生境类型的有机农业可提升物种β多样性。同时,在常规集约化管理农区,保留农田边界等半自然生境、适当减少化肥和农药等投入、降低农田内部的管理强度、防止土壤重金属污染等措施均有助于保护蜘蛛多样性。     

太行山区不同农业景观生境的蜘蛛群落结构特征及其影响因子

为探索太行山区农业景观中不同生境类型对蜘蛛多样性的影响,采用陷阱法对河北省武安市西部太行山区5种类型生境(核桃林、玉米地、苹果-芍药套作园、次生林、绿海花廊景观带)的地表蜘蛛多样性进行调查。通过分析5种类型生境中蜘蛛多样性分布及其与局部生境因子的相关关系,探讨半自然生境对蜘蛛的保护作用。结果表明:人为干扰会显著降低生境中蜘蛛丰富度和多度;增加植被群落结构的复杂程度会使生境中蜘蛛丰富度显著增加,而蜘蛛的多度显著降低;蜘蛛的多度随生境中枯落物厚度的增加而增加。其中核桃林的蜘蛛Shannon-Wiener多样性显著高于其他4种类型生境,核桃林、次生林和绿海花廊的蜘蛛丰富度显著高于苹果-芍药套作园和玉米地,苹果-芍药套作园和绿海花廊的蜘蛛多度显著高于其他3种生境。玉米地、苹果园-芍药套作和绿海花廊中蜘蛛的群落组成具有较高相似性,而核桃林与次生林中蜘蛛群落结构具有较高异质性。地表枯落物厚度是影响当地蜘蛛群落结构的最主要因素。研究区在农业景观与自然景观的过渡区种植核桃林、苹果-芍药套作园和绿海花廊间作板栗,对蜘蛛多样性的保护都有积极作用;不同的生境因子与不同蜘蛛群落的关系不同,如狼蛛偏向人为干扰较大的苹果-芍药套作园和绿海花廊景观带,所以生产管理时要结合特有的生境条件,对相应的蜘蛛进行合理的保护和高效的利用。研究结果对当地的农业景观生境管理和生物多样性保护具有指导意义。     

Long chain alkanes in silk extracts of maize genotypes with varying resistance to Fusarium graminearum

The alkane content of the silks of nine maize genotypes was analyzed to investigate the role of silk wax in resistance to Fusarium graminearum. Silk samples were collected 2, 4, 6, and 8 days after silk emergence and divided into three sections: exposed silk, silk channel silk, and silk that is under the husk and overlying the kernels. Four major unbranched alkanes (C(25), C(27), C(29), and C(31)) and three isoalkanes (C(27i), C(29i), and C(31i)) were identified. Total alkane contents were highest in the exposed silk followed by the silk channel silk, with the lowest in the youngest silk closest to the kernels. In the silk channel and overlying kernel silks, the moderately resistant inbred CO272 consistently had the highest alkane content. None of the other inbreds with improved resistance had as high a level of alkanes as CO272, indicating that alkane content is not a major mechanism of resistance.     

Web spider community response along an edge between pasture and Araucaria forest

We investigated how vegetation features and temporal variation influenced web spider richness, abundance and composition along an edge between Araucaria forest and pasture in southern Brazil. Web spiders and vegetation were surveyed four times over a 1-year period, in five 5 × 5 m plots randomised in four locations: 50 m into the pasture, 0, 50 and 250 m into the forest. We collected a total of 836 web spiders (33 morphospecies and six families). We found different web spider assemblages occurring at the pasture edge and forest interior. The richness and abundance of web spiders decreased up to 50 m towards the forest interior in all seasons, and we found a positive influence of vegetation richness on web spider abundance. In conclusion, web spider assemblages are influenced by an edge gradient, this pattern is consistent throughout the year and is strongly related to vegetation features.     

少齿差星轮型减速器的弹性静力学分析

针对目前少齿差星轮型减速器在机械应用中行星轴承易烧毁的现象,对其进行力学分析以寻求解决的途径。综合考虑内啮合齿轮副、行星轴承的变形以及各轴的扭转变形,构造少齿差星轮型减速器的变形协调条件,并采用子结构法建立该类传动系统的弹性静力学模型。通过求解系统的弹性静力学方程,获得系统各环节的受力,并给出了一个运动周期内两相机构的齿轮啮合力、行星轴承力和各曲轴扭矩的变化规律。弹性静力学仿真表明,少齿差星轮型减速器两相机构各环节的受力均呈周期性变化,且二者的变化规律基本相同,仅存在180?相位差。两相机构中齿轮副的啮合较为平稳,其啮合力在一个运动周期内仅存在微小波动;但行星轴承的载荷状况较为恶劣,其中星轮轴行星轴承的载荷波动较大,而输入轴行星轴承的载荷幅值较大,这恰与星轮型减速器应用中行星轴承易烧蚀的现象相吻合。该研究可为少齿差星轮型减速器的强度设计和结构优化提供准确的力学依据。     

氮钾肥配合施用对桑叶产量品质及蚕茧质量的影响

通过连续4年田间施肥试验和一季养蚕试验,研究了氮肥和钾肥配合施用对桑叶产量、品质及相应桑叶喂饲家蚕对蚕生长及蚕茧品质的影响。结果表明,桑园施用氮钾肥显著提高桑叶产量,在氮钾肥各养分配比中,以高氮高钾处理(N450K300)的产量最高,比N0K0处理年均增产35.2%,与其他各处理产量差异显著。桑叶品质分析结果表明,桑叶中必需氨基酸、氨基酸总量、粗蛋白、油脂含量随氮肥用量增加而提高,但单施氮肥会对蛋氨酸和油脂含量产生负面影响;施钾导致糖分含量下降,其他品质参数值随钾肥施用而提高,氮钾肥配合施用具有提高桑叶品质的作用。养蚕结果表明,桑园增施氮钾肥生产出的桑叶,有助于降低蚕茧的死笼率、具有提高全茧量和茧层率及提高蚕茧产量的作用。蚕茧上茧率、茧丝长、解舒率和茧丝净度随着钾肥用量的增加而提高,在施钾基础上增加氮肥用量有提高蚕茧品质的作用,但不施钾只施氮肥对上茧率有负面影响,说明氮钾肥配合施用能促进蚕茧质量的提高。