茄子基因组DNA提取及ISSR-PCR反应体系的优化

为了应用ISSR分子标记对茄子(Solanum melongena L)种资源进行种质鉴定、分类及亲缘关系等方面的研究，本试验以茄子叶片为材料，探索茄子DNA的提取及ISSR反应的最佳体系。结果表明利用改良CTAB法提取DNA，可以消除茄子叶片多糖、多酚、色素等物质的干扰，得到高质量的DNA，完全符合ISSR反应需要。以茄子基因组DNA为模板，通过正交试验设计，从Taq酶、dNTP、引物、模板4种因素3个水平对茄子ISSR反应体系进行优化，建立了一套适宜于茄子的ISSR优化反应体系及程序，为进行茄子遗传多样性的研究奠定了基础。在20μL的反应体系包括：Taq酶1 U，Mg2+2. 5mmol/ L，dNTP 375μmol/ L , 引物浓度0.4μmol/ L，模板DNA 4ng，2μL 10×PCR Buffer（Mg2+）。     

利用目标起始密码子多态性(SCoT)分子标记分析梨遗传多样性

目标起始密码子多态性(start codon targeted polymorphism,SCo T)是一种新型的遗传分子标记技术。本研究采用单因素水平设计方法,优化并建立梨的适宜SCo T分子标记体系,通过SCo T标记技术,分析了安徽省砀山县的43份梨(Pyrus spp.)的遗传多样性和亲缘关系。结果表明,优化后梨SCo T-PCR反应体系:10×Easy Taq Buffer(含2 mmol/L Mg2+)2.5μL,模板DNA终浓度30 mg/L,上下游引物终浓度1.0μmol/L,d NTPs终浓度0.2 mmol/L,Taq DNA聚合酶1.0 U,总体积为25μL。随机选取2个DNA模板进行引物筛选,最终从67条引物中筛选出16条扩增条带清晰且有差异性的引物,共扩增出145条带,其中多态性条带有126条,多态性比率为86.1%,每条引物平均扩增出9.1条带。SCo T标记的43个梨材料遗传相似性系数为0.517~0.931,平均值为0.685。聚类分析表明,在遗传相似系数为0.610的水平上,43份梨材料分为A和B两组;在遗传相似系数为0.746的水平上,A组又分为6个亚组(Ⅰ~Ⅵ)。所研究的43份梨材料具有丰富的遗传多样性,且能够被SCo T分子标记有效地检验,为进一步研究利用安徽省砀山县梨种质资源提供了依据。     

栽培种花生AFLP标记体系的优化及多态性引物筛选

为建立并优化适合花生的EcoR Ⅰ和Mse Ⅰ内切酶组合的AFLP标记技术体系,本试验对花生基因组DNA大样提取方法、双酶切反应、连接体系、预扩增和选择性扩增等影响因素进行反复调试与优化,并对适合花生AFLP分析的引物组合(E/M)进行多态性筛选。结果表明,高质量的模板DNA提取采用改进的SDS-CTAB法,DNA样品的浓度在150~200 ng·μL~(-1),37℃双酶切3.0 h,接头浓度为50pmol·μL~(-1),T4-DNA连接酶浓度为10 U·μL~(-1),16℃连接10 h。以2×Es Taq MasterMix(含有Es Taq DNA Polymerase,3 mmol·L~(-1)MgCl_2和400μmol·L~(-1)d NTP)作为PCR反应原料,其中,预扩增反应体系为50μL,预扩增引物(E00和M00)的浓度为50 ng·μL~(-1),预扩增产物最适稀释倍数为20倍;选择性扩增反应体系为20μL,扩增产物中加入10μL Loading Buffer,经95℃变性10 min后,立刻转移到冰浴中冷却备用。最终,从225对AFLP引物组合中,筛选出稳定且多态性丰富的42对引物组合,可用于后期作图群体基因型检测和种质资源遗传多样性分析。本研究结果为下一步构建花生高密度遗传连锁图谱和开展分子标记辅助育种奠定了基础。     

RAPD技术在葡萄种质鉴定上的应用

为建立一种简单，快捷的方法以鉴定葡萄（Vitis)种质资源，对CTAB，SDS和高盐法3种DNA提取方法进行了比较。结果表明，改良的CTAB法较为适合葡萄基因组DNA的提取。通过对TaqE,Mg^2 ,dNTP，模板DNA，Primer不同浓度的优化实验以及对PCR反应程序的筛选，建立了适合葡萄基因组RAPD分析的技术体系。运用该体系对部分葡萄品种进行RAPD分析。结果表明，采用适合的引物在该体系条件下能够达到鉴定葡萄种质资源的目的，并可应用到葡萄的遗传图谱，指纹图谱及分子标记等分子生物学的研究中。     

油茶SRAP-PCR反应体系的建立和优化

为了建立油茶SRAP-PCR扩增体系,本研究使用单因素试验设计,对反应体系的Taq酶、Mg2＋、模板DNA、dNTP和引物浓度5个主要影响因子各设10个不同的水平梯度,筛选出适宜的因子范围;在此基础上,进一步采用L16（45）正交设计,对影响油茶SRAP-PCR反应体系的5个因素在4水平上进行优化,建立了油茶SRAP-PCR最佳反应体系,即25μL体积中包含模板DNA30ng,Mg2＋2.8mmol/L,引物0.44μmol/L,dNTP0.2mmol/L和Taq酶1.0U。该SRAP-PCR体系的建立为油茶种质资源遗传多样性分析、品种鉴定及指纹图谱构建等研究提供了一个标准化的程序。     

落羽杉属树木基因组总DNA的提取及SRAP反应体系的优化

本文针对落羽杉属植物组织中多糖、多酚等次生物质含量高的特点,对其基因组DNA提取方法进行研究,比较了SDS法、CTAB法提取落羽杉属植物基因组DNA的效果,结果表明：CTAB法提取效果较佳。在此基础上,利用正交设计法,对SRAP反应体系中的各个主要影响因子Mg^2＋．dNTP、引物、TaqDNA聚合酶进行了优化筛选,确立了适合落羽杉属植物SRAP-PCR反应的最佳体系,即10μL体系中含有1μL 10×PCR bufier,Mg^2＋2．0mmol／L,dNTP100μmol／L,引物0-3μmol／L,彻DNA聚合酶0．5U和50ng模板DNA。利用该优化体系,通过48对SRAP引物组合对2个落羽杉属植物（落羽杉和墨杉）及4个杂交后代进行SRAP扩增,结果发现,SRAP引物及优化后的反应体系能够有效地用于落羽杉属植物种质资源鉴定及遗传多样性分析等研究。     

葡萄SRAP反应体系优化及引物筛选

本试验利用L16（4^5）正交试验设计探寻葡萄SRAP—PCR反应体系中的关键因子,同时结合单因素试验简单、快捷的特点逐个对PCR反应体系的主要成分进行优化。充分利用两种方法的优点并降低试验工作量取得了较好的效果,建立了适于葡萄的SRAP反应体系。结果表明Mg^2＋浓度为影响葡萄SRAP—PCR反应的关键因素;优化的20μLSRAP—PCR反应体系中各组分的最适含量为：10×Buffer2．0μL,Mg^2＋2．5mmol／L,dNTPs0.3mmol／L,引物0．4μmol／L,砌DNA聚合酶1．0U,模板DNA1．0ng／μL。利用SRAP反应体系,从100对SRAP引物组合中筛选出扩增稳定,条带清晰,多态性好的引物19对。本研究建立的适于葡萄SRAP—PCR扩增的反应体系,将为葡萄种质遗传多样性评价、基因组分析、指纹图谱构建,分子标记辅助育种和遗传改良研究提供基础。     

唐古特大黄SRAP反应体系优化及引物筛选

SRAP-PCR反应体系的优化是SRAP分子标记的基础,为建立高效稳定的唐古特大黄SRAP反应体系,进一步对唐古特大黄进行遗传多样性、种质资源分析,本研究在单因素试验基础上,对唐古特大黄SRAP-PCR反应体系主要影响因素Mg~(2+)、d NTPs、引物、Taq酶进行正交试验L9(34)。结果表明,唐古特大黄最佳SRAP-PCR反应体系为:Mg~(2+)0.5 mmol·L~(-1),d NTPs 0.4 mmol·L~(-1),引物0.2μmol·L~(-1),Taq聚合酶0.06 U·μL~(-1),总体积25μL。利用最优体系进行引物筛选,从58对SRAP引物中获得了30对条带清晰、多态性好的引物对组合。SRAP-PCR优化反应体系的建立为利用SRAP技术进行唐古特大黄种质资源分析、遗传多样性研究等奠定了基础。     

雁鹅ISSR-PCR反应体系的优化*

本试验以雁鹅基因组DNA为模板,采用正交试验设计L25（55）对PCR反应中5个因素（引物、dNTPs浓度、模板DNA、Mg2+、TapDNA聚合酶）在5个水平上进行优化实验,在初步实验的基础上通过因素内比较进一步优化各因素在ISSR-PCR反应中的浓度,快速准确地建立雁鹅ISSR-PCR的最佳反应体系,为进一步进行雁鹅遗传多样性的研究、遗传图谱构建和基因定位奠定技术基础。在25uL的反应体系中,确定雁鹅ISSR-PCR的最佳反应体系为：ISSR引物的浓度为0.20umol/L,dNTPs浓度为0.28mmol/L,模板DNA的用量为40ng,Mg2+浓度为1.5 mmol/L,Taq DNA聚合酶的用量为1.0U。在正交试验设计的基础上,通过因素内比较进一步优化各因素在ISSR-PCR反应中的浓度,可以更加准确地确立ISSR-PCR的最佳反应体系。     

毛薯ISSR-PCR反应体系的建立

本研究主要建立毛薯ISSR-PCR的最佳反应体系。研究采用改良CTAB法提取毛薯总基因组DNA,应用单因子实验法设定模板DNA,Mg2＋浓度,dNTP浓度,Tap酶浓度以及退火温度的5个不同梯度,探讨单因素变化对毛薯ISSR-PCR扩增的影响。实验结果表明,毛薯ISSR-PCR最佳反应体系为：总体积20μL,模板DNA为50ng、Taq酶为0.8U、Mg2＋浓度为2.0mmol/L、引物浓度为0.5μmol/L、dNTPs浓度为0.5mmol/L。     

珍珠黄杨ITS-PCR体系的建立与优化

本研究利用改良CTAB法从珍珠黄杨叶片中提取基因组DNA作为模板,在TaqDNA聚合酶量不变的基础上,利用正交设计L9（34）对4个因素（模板DNA、Mg2＋、dNTP和引物）在3个水平上对珍珠黄杨ITS-PCR反应体系进行优化。实验结果表明,在总体积50μL的反应体系中,建立了最佳ITS-PCR扩增条件：Mg2＋浓度2.0mmol/L、引物浓度0.3μmol/L、dNTP浓度0.3mmol/L、DNA模板浓度240ng/50μL、TaqDNA聚合酶的用量1.75U/50μL和退火温度56℃,该优化体系保证了珍珠黄杨ITS-PCR产物的纯度和质量要求。珍珠黄杨ITS片段克隆测序后获得的序列长度为642bp,其系统学信息将为珍珠黄杨的起源进化提供有力的分子水平证据。     

均匀设计优化毛竹EST-SSR PCR反应体系

本研究以毛竹叶片DNA为模板,利用均匀设计U10（54）表,对毛竹EST-SSRPCR反应体系的TaqDNA聚合酶、Mg2＋、dNTPs及引物浓度4因素5个水平进行优化筛选。优化实验结果表明,毛竹EST-SSRPCR的25μL优化反应体系为：10×PCRBuffer（含Mg2＋）2.5μL、TaqDNA聚合酶1.5U,Mg2＋、dNTPs及引物的最适浓度分别是1.0mmol/L、0.1mmol/L、0.48μmol/L;通过梯度PCR试验筛选得到相应引物的最佳退火温度为52.4℃。对优化出的EST-SSRPCR反应体系进行稳定性检测,结果均能获得丰富、稳定、清晰可辨的DNA谱带。该优化体系为利用EST-SSR分子标记对毛竹进行遗传多样性等相关研究工作提供了基础条件。     

大丽轮枝菌RAPD反应组分的优化与应用

根据正交实验理论，设计一种优化RAPD各个反应组分以获得理想图谱的最佳反应浓度方法，能够显著减少反应组分优化次数，大丽轮枝菌（Verticillium dahliae)RAPD扩增最优反应组分浓度为：MgCl2 3.5mmol/ ,dNTP0.25mmol/L ,引物15pmol/L,Taq酶1.5U,DNA5n，实验表明，MgCl2与dNTP浓度之比是影响RAPD的增效果的最主要因素。根据优化的反应组分，用9个随机引物对来自江苏南通，射阳，泗阳，盐都4个群体53个大丽轮枝菌菌株进行RAPD扩增，对各个群体的遗传结构分析表明，各地群体遗传相似性较高。     

药用菊花SCoT-PCR反应体系的正交优化

为进一步开发利用药用菊花种质资源,为药用菊花的遗传多样性及分子鉴定研究提供技术支持,建立并优化药用菊花的目标起始密码子多态性-聚合酶链式反应(SCoT-PCR)体系,在方差分析基础上,运用L25(56)正交设计在5个水平上对影响药用菊花SCoT-PCR反应的模板DNA、Mg2+、dNTPs、Taq酶、引物5个因素进行优化试验,并对PCR结果进行分析。建立了药用菊花SCoT-PCR最佳反应体系(20μL):模板DNA 10 ng,引物0.8μmol·L-1,dNTPs 0.2 mmol·L-1,Mg2+2.0 mmol·L-1,Taq酶1.5 U,SCoT反应的影响因素依次为:Taq酶引物dNTPsMg2+模板DNA。优化的SCoT-PCR反应体系在多个药用菊花品种遗传多样性研究中得到了验证,结果表现出良好的稳定性、重复性和多态性丰富等特点,该体系的建立为药用菊花品种遗传多样性分析、系统发育研究、遗传图谱构建、基因定位和分子标记辅助育种研究奠定了基础。     

均匀设计在枇杷ISSR-PCR反应体系优化中的应用

本实验通过U255（5^4）均匀设计实验研究,对枇杷ISSR—PCR分子标记体系中模板DNA、dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg^2＋、引物5个组分的浓度进行优化。获得25μL反应体系中各成分的适宜浓度或用量分别是：模板DNA为10ng、dNTPs为0．5mmol／L、TaqDNA聚合酶为1U、Mg^2＋为2．5mmol／L,引物为0．4μmol／L。与单因素梯度优化体系相比,操作简便,简化了实验步骤,获得的实验结果可靠,从100条ISSR引物中筛选出27条扩增良好的引物,并获得了这些引物的最佳退火温度,经琼脂糖凝胶电泳获得了清晰的图谱。这一优化体系的建立为进一步利用ISSR标记技术进行枇杷种质鉴定及遗传多样性分析提供了一个标准化程序。     

利用ISSR揭示不同类型月季遗传多样性

本研究应用正交设计法对ISSR反应体系中的各个主要影响因子进行了优化筛选,确立了适合月季ISSR-PCR反应的最佳体系。结果表明,25μL的ISSR反应体系中各组分的最适浓度分别为：1×PCR缓冲液、1U Taq DNA聚合酶、800pmol／L 引物、0.16mmol／L dNTPs、Mg^2＋ 1.5mmol／L。筛选了33个ISSR引物,共得到了11个多态性比较高的ISSR引物,占所筛引物的33.33％。利用筛选出的11条ISSR引物对3种月季类型的23份月季材料进行遗传多样性分析,共扩增出477条DNA带,其中多态性位点有14个,平均每条引物可以检测到4.5个多态性位点。用NTSYS软件对样品进行了UPGMA聚类分析,聚类结果表明丰花月季基本能聚为一类,切花月季与藤本月季交叉聚在一起。这表明月季种质的遗传差异与其应用分类的相关性不紧密。     

同工酶和RAPD技术对柳松菇(Agrocybe aegerita)菌株遗传多样性的分析

柳松菇(Agrocybe aegerita)作为一种栽培蕈菌的新品种和进行分子生物学研究的模式菌株,国内外的学者对其进行了多方面和多层次的研究.但目前对我国柳松菇的资源情况还缺乏确切的了解.在欧洲,1995年发表的有关柳松菇的研究提及已经收集了37株野生菌株,而目前我国食用菌菌种保藏中心收集到的国内柳松菇菌种仅有9株.我国地理环境和气候条件具有较大的多样性,柳松菇的野生资源也应该较为丰富,所以加强对我国柳松菇种质资源及其遗传多样性的了解,是促进柳松菇杂交育种和深化柳松菇遗传学研究的前提.本研究运用同工酶和RAPD技术对7株不同来源的柳松菇菌株的遗传多样性进行了分析,目的在于为柳松菇杂交育种工作的亲本选配提供实验依据,同时为进一步开展柳松菇种质资源遗传多样性的研究作方法学上的探索.     

吉富罗非鱼AFLP反应体系的建立与优化

本文以我国水产养殖主导品种吉富罗非鱼(farmed tilapia)为研究材料,进行扩增片段长度多态性(AFLP)反应体系的研究,初步建立了一套适合罗非鱼的AFLP反应体系。对体系中关键环节的优化结果如下:基因组DNA要求无降解和RNA污染,OD260/OD280比值在1.8~2.0之间;基因组DNA EcoRⅠ/MseⅠ37℃双酶切6h、20℃连接20h,连接产物10倍稀释,PCR预扩增产物稀释45倍作为选择性扩增的模板,选择性扩增产物经6%变性丙烯酰胺凝胶电泳检测可获得条带清晰、背景干扰小的图像。该体系的构建为今后进行罗非鱼群体遗传多样性分析、种质鉴定、重要经济性状分子标记的开发及遗传连锁图谱构建等方面研究提供了参考。     

组培枣苗基因组DNA提取方法及其含量的比较

本文以组培二倍体木枣、四倍体变异苗和二倍体京枣苗为供试材料,采用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度检测技术,研究了不同提取方法对其叶片基因组DNA的提取效果。结果表明,CTAB法提取枣叶片DNA的效果优于SDS法,表现为蛋白质杂质干扰少,DNA结构完整、纯度与得率高;用不同方法提取的样液中DNA片段的大小和分布是不同的,以改进的CTAB法提取的样液中大片段的DNA分子较多,所以在其底部分布较多,而用SDS法提取的样液中小片段的DNA分子较多,故在其上部分布较多;电泳时不同的加样量获得的DNA带也有较大差异,试验选出CTAB法提取样液的适宜的加样量为5μL（7.485μg）,SDS法提取样液的适宜的加样量为4μL（5.988μg）;枣品种间DNA的含量明显不同,木枣四倍体的DNA含量（3.074μg/μL）相当于组培木枣二倍体（1.497μg/μL）的2倍,也明显地高于京枣二倍体（2.182μg/μL）。这些结果为枣树遗传种质资源的研究奠定了一定的科学与技术基础。     

梨SRAP-PCR反应体系的建立与优化

SRAP标记是一种对ORFs进行扩增的新的分子标记技术，其具有方法简便、稳定，产率中等，不需预知物种的序列信息等特点，近年来在连锁标记的寻找与基因定位，种质鉴定，生物多样性研究，遗传图谱构建及比较基因组学等研究领域得到了应用。本研究开展了SRAP标记技术在梨树上应用的探讨，以3个不同梨品种为试验材料，对影响SRAP-PCR反应体系的Mg２＋、dNTP、引物浓度、Taq酶等因子设置梯度实验，筛选和建立可扩增多态性高、重复性好、带型清晰的最佳反应条件。结果表明：在20μL反应体系中，模板DNA30ng，MgCl2 2.0mmol/L，dNTP 200μmol/L，正、反向引物各0.2μmol/L，DNA聚合酶1U。