大白菜cDNA-AFLP分析体系的优化

本研究以高感、高抗大白菜小黑点病的大白菜叶柄为试材,对影响cDNA-AFLP分析体系的几个关键因素进行分析,建立了适宜大白菜的cDNA-AFLP分析体系,并得到了较为清晰可辨的cDNA-AFLP图谱。结果表明:试剂盒法提取的NA较完整,纯度较高;400ng的cDNA利用FastDigest EcoRⅠ和Fast-Digest MseⅠ进行快速双酶切50min,酶切充分;在20μL的体系中,连接产物取原液作为预扩增反应的模板,并且预扩增反应的循环数为35,预扩增产物稀释20倍作为选择性扩增的模板,扩增结果最佳;MBI2×PC Master Mixture反应体系满足扩增反应的需要,不需要另外摸索反应条件,节省了试验成本;选用64对AFLP引物进行扩增,筛选出具有多态性条带丰富的AFLP引物45对。本研究为利用cDNA-AFLP分析大白菜小黑点病的的发病机理奠定了基础。     

TMV侵染烟草基因差异表达的cDNA-AFLP分析

以烤烟品种龙江925 [高抗烟草普通花叶病(TMV)]接种TMV的叶片为材料,选用240对引物组合的扩增, 获得约 9 500个转录基因片段, 经过克隆测序最终获得了12个诱导表达片段, 它们与核酸代谢、蛋白质合成与修饰、能量代谢、胁迫响应、细胞内运输、糖代谢等相关, 并利用荧光定量PCR分析一个诱导表达片段TIF2在0~72 h之间5个时间点(0、12、24、48和72 h)的基因差异表达, 证实了所获得的基因序列为真实诱导的表达序列。对此序列进行RACE, 最终获得全长cDNA序列, 全序列857 bp, 预测的编码区在101~613 bp之间, 共编码170个氨基酸。经Blastn、Blastp比对分析, 在烟草中没有获得其同源序列, 确定该基因是在烟草中发现的与抗TMV相关的新基因。     

利用cDNA-AFLP技术分析小麦成株抗条锈性差异基因表达特征

采用cDNA-AFLP技术,对成株抗条锈小麦品种兴资9104在成株期受条锈菌生理小种CY32侵染后5 d内9个时间点的基因表达谱进行了分析。共筛选64对引物,产生32 320个转录本(TDF);用37对引物检测到2 201个(6.81%)差异TDF,其中926个TDF诱导表达,1 275个下调表达。经大规模克隆、测序分析,最终获得330个差异TDF,聚类分析得到259个EST (unigenes),命名为aTaPST1至aTaPST259 (GenBank注册号：FL645754~FL646011和FL646262)。经BLASTX比对和功能分类分析,其中96条EST(37.07%)未找到同源性匹配,68条(26.25%)与未知功能蛋白同源性较高;其余95条ESTs主要涉及能量(11.20%)、基础代谢(4.63%)、转录调控(3.86%)、抗病与防御(3.86%)、蛋白质运输和储存(3.09%)、蛋白质合成和细胞生长(各2.32%)、以及信号转导(1.54%)等。选取抗病与防御、转录调控及信号转导类等相关的6个差异基因,qRT-PCR分析结果显示其表达模式符合cDNA-AFLP表达谱。小麦成株抗条锈性分子机制涉及植物多方面生理生化反应,包括抗病与防御、转录调控、蛋白质代谢、信号转导、以及非生物胁迫等多种途径相关基因的协同控制。     

大白菜育性相关蛋白差异表达

为揭示复等位基因遗传的大白菜雄性不育分子机制,通过基于质谱的蛋白质组学同位素相对标记与绝对定量技术技术(i TRAQ),开展了大白菜核基因雄性不育蛋白质组学研究,以找到不育与可育材料中差异表达蛋白,从蛋白水平来进一步揭示大白菜雄性不育的分子遗传机制。通过研究,共发现了358个差异蛋白,其中可育中上调表达的蛋白有226个,下调表达的蛋白有132个,GO分析结果表明,鉴定的蛋白质组数据具有较好的生物学功能覆盖范围。通过双向电泳验证,差异蛋白点差异特性与i TRAQ结果类似,表明i TRAQ用于差异蛋白分析结果可靠。     

小麦抗/感白粉病近等基因系基因表达差异的研究

采用cDNA-AFLP(cDNA-amplified fragment length polymorphism)技术,对小麦抗白粉病近等基因系Mardler/7*百农3217和百农3217材料的不同处理,于接菌后不同时间点的基因表达进行了表达分析。Mardler/7*百农3217及其感病轮回亲本百农3217在表达上存在差异;利用46对引物在抗/感近等基因系和感病轮回亲本DCINA处理发现283条差异带,对其中42条片段进行克隆测序,同源性分析发现包括信号转导相关的基因片段、与细胞壁的组成和结构相关的基因片段和与过敏性反应相关的基因片段。此研究结果发现其中的一些差异显示片段对小麦的抗白粉病机理的揭示具有重要作用。     

大白菜对氮素响应的基因型差异及相关特征分析

为明确大白菜主产区主推品种对氮素响应的特征及基因型差异,筛选氮高效大白菜种质资源,探讨大白菜氮效率及氮敏感度的评价指标,以我国栽培面积和生产供应数量最大的蔬菜作物大白菜为研究对象,以目前主产区主推的68份代表性品种为试验材料,采用田间试验方法,于成熟期对开展度、株高、毛质量、外叶数、球质量、球高、球宽、球叶数、最大叶长、最大叶宽、中肋长、中肋宽、中肋厚、中心柱长和中心柱宽共15个在生产中关注的重要农艺性状及含氮量、氮农学利用效率和氮响应度3个氮效率性状在2种氮素水平(正常供氮,N:270 kg/hm²;低氮,N:54 kg/hm²)进行了详细调查、计算和分析,对各性状在2种氮水平下的相对值进行了计算,并对大白菜氮效率类型和氮敏感度进行了评价和划分。结果表明,除外叶数和中心柱长之外,其他13个农艺性状在2种供氮水平下均存在极显著差异,氮水平对大白菜重量性状的影响最大,对抽薹性相关的性状影响最小,大白菜的含氮量和氮农学利用效率在不同氮水平下也存在显著差异;各农艺性状在相同氮处理条件下均存在极显著的基因型差异,其中中心柱长在品种间变异系数最大;含氮...     

春、夏大白菜花药培养胚状体诱导的影响因素研究

以13份春、夏大白菜为材料进行花药培养,研究几种因素对花药胚状体诱导的影响.结果表明,当花蕾长为2.0～3.0mm,花瓣与花药长度之比为1/2～4/5时,54%～70%的小孢子发育处于单核靠边期,最适合进行花药培养.花药培养结果表明,基因型不同,胚状体的诱导率有极大的差异,最容易形成胚状体的材料是126,诱导效率达13.71%;胚状体的出现在花药接种后的15～30d之间,培养后20d左右是胚状体出现的高峰期.培养基的种类对培养结果也有影响,其中以Keller培养基效果最佳,Keller培养基中有机成份加倍,则可以明显提高胚状体的诱导效率,培养基中10%的蔗糖浓度促进胚状体的诱导.     

半矮生型桃生长跃变期差异表达基因的cDNA-AFLP初步分析

半矮生型桃"SD9238"是在中国农业科学院郑州果树研究所育种圃实生苗后代中发现的突变体,其早期生长缓慢,5月中旬之后进入迅速生长期,与普通型截然不同。本研究以"SD9238"为研究试材,采用cDNA-AFLP差显技术分析其新梢生长跃变期前后4个生长阶段差异表达基因。研究中共采用256对选择性引物组合,扩增出9021条可分辨的条带,其中有差异的条带共有1987条。初步选取其中11个差异条带,进行克隆和序列测定,生物信息学分析表明,转录衍生片段(Transtript derived fragment,TDF)的主要功能涉及木质素生物合成;蛋白质水解;转录调控及生长调节等,还有一些是未知功能基因。研究所得结果为进一步揭示半矮生桃生长调控的分子机理奠定了基础。     

基本培养基及蔗糖浓度对大白菜花药培养胚状体诱导的影响

以6个大白菜品种为试材进行花药培养,研究了不同基本培养基和蔗糖浓度对胚状体诱导的影响。结果表明,B5和Keller培养基为适适宜的基本培养基;培养基适宜的蔗糖浓度为8%~12%,最适浓度为10%。     

大白菜苗期对黑斑病抗性遗传规律的研究

采用４×４完全双列杂交对大白菜苗期黑斑病的抗性遗传规律进行了研究。结果表明，两个抗病亲本和两个感病亲本抗性差异显著；两个抗病亲本杂交的Ｆ１仍表现抗病，两个感病亲本的Ｆ１仍表现感病，一个抗病亲本和一个感病亲本杂交的Ｆ１表现中间偏抗类型，Ｆ１的抗性和中亲值差异显著，但未达到极显著水平，为部分显性，正反交差异不显著呈现核遗传，细胞质作用不显著。一般配合力的Ｆ值极显著，而特殊配合力Ｆ值不显著，大白菜苗期对黑斑病的抗性以加性效应为主，其广义遗传力为６４．４５％，狭义遗传力为６１．９５％。     

大白菜育性相关基因BRLSP-55的获得与验证

雄性不育的利用是大白菜制种的重要手段,获得大量育性相关基因可为了解大白菜雄性不育分子机制提供线索。采用cDNA-AFLP技术寻找差异条带,利用RT-PCR经序列比对并推测其功能。利用cDNA-AFLP方法从大白菜雄性不育两用系“AB01”的不育和可育花蕾中找到一个仅在可育花蕾中表达,而在不育花蕾中不表达的差异片段;经测序分析表明所得序列大小为351 bp,将其命名为BRLSP-55;并通过RT-PCR方法得到了验证;经序列比对初步判定该基因与拟南芥硫堇蛋白(Thionin Protein)的亲缘关系较近,所获得育性相关基因BRLSP-55可能为一种硫堇蛋白,在大白菜雄性不育机制中可能起重要作用。     

白菜低温要求型晚抽薹性的相关序列克隆与分析

为了阐明低温要求型晚抽薹的分子机制,本研究利用易抽薹大白菜BY和晚抽薹芜菁"M.M"杂交获得的81个DH系群体为试材,从中选择了6个极早抽薹和6个极晚抽薹的株系分别组成早抽薹池和晚抽薹池.以两池和双亲为样本,以无低温和3～5℃处理25 d后获得的mRNA为模板,反转录为cDNA,利用256对AFLP引物组合进行cDNA-AFLP分析,筛选与晚抽薹性相关的特异片段.对其中3条差异表达、且丰度较高的cDNA片段进行了克隆测序.序列测定和Blast分析表明,p65m47 cDNA片段与C2结构域蛋白基因有80%的同源性,期望值为7e-17,C2结构域蛋白在细胞的信号转导中起着很重要的作用;p66m55 cDNA I片段与拟南芥AT1G32530 cDNA有85%的同源性,期望值为5e-36,它编码蛋白结合位点/泛素连接酶/锌指结合蛋白;p66m55 cDNA Ⅱ片段与拟南芥AT1G65590 cDNA有87%的同源性,期望值为4e-37,它编码B-N-乙酰已糖胺水解酶.     

温度对白菜黑腐病侵染与发病影响的研究

白菜接种墨腐病后，置１５、２０、２５、３０℃的光照培养箱中保温４８ｈ。１１天后移在室温下，病均可以完成侵染。病害的进程随着环境环境的提高面表现出正相关。在上述温度梯度下，大白菜黑腐病病情指数达到５０的天数，分别为３５、３２、２７、８天。使其致死的时间分别为４１、３５、３２、３２天。因此，鉴定时提高环境的温度，有利缩短一病的时间，若接种的温度控制在２５℃或３０℃，则接种后的第１１或第８天即可进行病情     

大白菜DREB类转录因子cDNA的克隆及植物表达载体的构建

以干旱处理的大白菜自交系85-1为材料,利用RT-PCR技术获得了大白菜DREB类转录因子基因的cDNA编码序列,命名为BcDREB1(GenBank登录号为:EU924266).序列分析表明,BcDREB1核苷酸序列长663 bp,编码214个氨基酸,含有一个典型的AP2结构域,具有DREB转录因子的典型特征.将该基因的cDNA编码序列连接到植物表达载体pCAMBIA2301中,成功构建了大白菜BcDREB1基因的植物表达载体pCAM-BcDREB1,为进一步通过转基因技术研究该基因的功能奠定了基础.     

紫色不结球白菜花色苷合酶基因BrcANS的克隆与表达分析

以不结球白菜紫色品系NJZX1-3和其绿色突变体NJZX1-0及其后代F₂的2个株系NJZX2-1和NJZX2-2为材料,研究花色苷合酶基因在紫色不结球白菜叶片花色苷合成途径中的作用。利用同源克隆的方法,分别在NJZX1-3及NJZX1-0中克隆到花色苷合酶基因;经序列比对发现,花色苷合酶基因的核苷酸和氨基酸序列在2种材料和大白菜中完全一致,长度为1077 bp,编码358个残基,第211~307肽段具有2OG-Fe (II)双加氧酶家族基因的结构域,被命名为BrcANS。BrcANS蛋白与同科芥菜的同源性高达99%,进化关系亦与其最相近。在全部4种材料鲜叶中,总花色苷的含量(TAC)与叶片紫色程度是一致的,其中,NJZX1-3叶片中总花色苷含量最高,达到80.15±5.74 mg 100 g^–1 FW;BrcANS表达量为NJZX1-0 < NJZX2-1 < NJZX2-2< NJZX1-3,与其总花色苷含量呈正相关。BrcANS的mRNA在NJZX1-3和NJZX1-0两种材料的不同组织中特异性表达：在叶片中高度表达,而在其他组织中表达较弱;另外,在两种材料间的表达亦存在显著差异,在NJZX1-3叶片中的表达丰度显著高于NJZX1-0。随着叶龄的增大,紫色不接球白菜叶片紫色变浅,BrcANS的表达量下降,但在NJZX1-3和NJZX1-0间的表达差异亦明显减小。以上结果表明,BrcANS基因是紫色不结球白菜中花色苷合成的关键基因之一,其mRNA表达量与叶片紫色直接相关,可能在其转录水平上调控叶片中紫色的形成。     

大白菜NPR家族基因鉴定及表达模式分析

为明确大白菜NPR转录辅助因子在大白菜基因组中的数量、结构和表达特点,揭示NPR在水杨酸信号途径调控大白菜生长发育过程中的作用.本研究利用拟南芥资源信息库TAIR10和芸薹属基因组网站Brassica Database鉴定大白菜基因组中的NPR家族成员,并对其蛋白和基因特性进行生物信息学分析.鉴定出大白菜基因组中包括1...