鲤肠道小肽转运载体PepT1多克隆抗体的制备及其组织表达分析

为从蛋白水平研究小肽转运载体(PepT1)在鲤(Cyprinus carpio L.)不同组织中的表达及分布规律,本研究采用PCR法获得PepT1 cDNA片段,并转化至大肠杆菌Rosetta,对目标多肽进行原核表达,将Pep T1重组蛋白纯化后免疫新西兰长耳兔(Oryctolagus cuniculus),获取兔抗鲤PepT1多克隆抗体。采用ELISA检测抗体效价,免疫组化检测PepT1的组织表达情况,并用荧光实时定量PCR技术检测PepT1转录水平组织表达情况。结果显示,目标多肽分子量约为28 kD;抗体效价达到4×10~5。PepT1在鲤的前肠、中肠、后肠、脾、肝胰脏和肾中均有表达。肠道组织PepT1的高表达与其主要完成食物中肽的吸收功能密切相关,且吸收部位主要集中在前肠和中肠;肾中PepT1免疫染色阳性区域也较为明显,这与肾小管基底膜存在对短肽的重吸收功能相关。此外,肝胰脏和脾PepT1也有一定量的表达,可能与这两个重要器官代谢旺盛有关。本研究制备的兔抗鲤PepT1多克隆抗体能够有效识别鲤各组织中的PepT1蛋白,在后续研究中亦可用于其他鱼类PepT1转运蛋白的表达定位和定量研究。     

鲤细胞因子多克隆抗体的制备及检测

为从蛋白质水平研究细胞因子在鲤体内免疫应答过程中的合成变化,本研究采用PCR技术克隆TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12、IL-10和TGF-β基因含有部分抗原决定簇的片段,引入双酶切位点Bam HⅠ和HindⅢ后连接至p ET-32a/21a,构建相应的表达载体,制备多克隆抗体。采用ELISA检测抗体效价,并以此作为实验工具,检测经嗜水气单胞菌感染后鲤血清中炎性细胞因子的合成变化。结果显示,基因TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12、IL-10和TGF-β融合蛋白分子量分别约为31.8、31.7、35.3、32.5、18.0和33.6 ku;抗体效价达到2.4×106;在病原菌感染后的不同阶段,促炎细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12和抗炎细胞因子IL-10、TGF-β呈现出不同的合成变化。研究表明,制备的抗体具有较高的效价、亲和力和特异性,可用于鲤细胞因子的定量研究,该抗体的获得为鲤免疫应答与细胞因子合成的系统研究奠定了基础。同时,获取的鲤细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12、IL-10和TGF-β的抗体亦可用于其他鱼类细胞因子蛋白质水平的定量研究。     

鲤胰岛素样生长因子Ⅱ的克隆表达与抗体制备

从鲤(Cyprinus carpio)肝脏总RNA中成功地克隆和诱导表达了胰岛素样生长因子Ⅱ(IGF-Ⅱ)基因,并用间接ELISA法和Western-blot对其融合蛋白的多克隆抗体的效价和特异性进行了分析。结果表明,克隆的鲤IGF-Ⅱ基因与已报道的序列相比,有1个位点发生同义突变;经SDS-PAGE电泳分析,目的蛋白主要以包涵体的形式存在,表达量占菌体总量的35%。经ELISA测定,制备的抗体效价为6400。Western blot分析表明,抗血清能与重组蛋白发生特异性反应     

鲤春病毒血症病毒G蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

利用PCR方法扩增鲤春病毒血症病毒糖蛋白G的部分基因序列,即全基因组序列上第3 094~4 170位的碱基,并将其克隆至表达载体pGEX-KG中,构建重组质粒SVCV-g-KG。将重组质粒转化感受态细胞BL21,经IPTG诱导后,表达了与预期大小相符的约66 kDa的融合蛋白,可溶性分析表明该蛋白主要表达在包涵体中。将纯化的融合蛋白免疫日本大耳白兔,制备多克隆抗体。酶联免疫吸附试验检测其抗体效价可达1∶256 000,间接免疫荧光试验和免疫印迹试验证明其与病毒结合活性良好,特异性高;病毒孵育试验结果表明该多克隆抗体具备中和活性,能够有效阻断鲤春病毒血症病毒对细胞的感染。     

鲤WISP基因家族的克隆、表达及系统进化树的构建

Wnt1诱导分泌蛋白(WISP)基因家族与CYR61、CTGF、NOV基因共同构成了CCN家族。研究通过鲤基因组序列与斑马鱼WISP基因编码区全序列的比对获得WISP1a、WISP1b、WISP2、和WISP3等4条序列。经过克隆、测序、比对拼接得到其开放阅读框,分别是1 089、1 077、1 038和1 026 bp,它们都是由5个外显子和4个内含子构成,分别编码362、358、345和341个氨基酸。分子系统学分析表明,鲤4个WISP基因具有高度同源性,其中WISP1a、WISP1b和WISP2均含有4个模块,WISP3缺少第2个模块。通过RT-PCR检测WISP基因在鲤组织中的表达,结果表明,WISP1a鲤在13个组织中均有表达,皮肤中表达最高,脾、肠、卵巢次之,其他组织中表达较低。WISP1b在精巢、脑、皮肤、卵巢中表达较高。WISP2在血液、鳃中表达较高。WISP3在血液、脑、肝中表达较高。实时荧光定量PCR法分析WISP基因在鲤胚胎发育时期的表达,结果表明,除WISP3外,WISP1a、WISP1b和WISP2在前期表达较高,36 h表达最低,随后逐渐升高至第6天开始下降。     

鲤春病毒血症病毒核蛋白、磷蛋白与基质蛋白的表达、抗体制备及免疫原性比较

鲤春病毒血症病毒(SVCV)能够引起鲤科鱼类大量死亡,被世界动物卫生组织(OIE)列为必须申报的重要疫病,也是我国唯一被列为一类疫病的鱼类传染病。为建立SVCV的快速免疫学诊断方法,研究其主要结构蛋白间的免疫原性差异,实验首先采用原核表达系统克隆并诱导表达,纯化SVCV的核蛋白(N)、磷蛋白(P)和基质蛋白(M),并进一步免疫新西兰白兔制备抗血清,抗血清经Protein A柱进一步纯化获得3种蛋白的多克隆抗体。利用间接酶联免疫吸附测定(ELISA)和免疫印迹实验(Western blot)对抗体效价和特异性进行分析验证。结果发现,SVCV的N、P和M重组蛋白均在原核表达系统获得大量表达,且表达的蛋白经纯化后免疫实验动物产生了相应的多克隆抗体。Western blot结果显示,3种蛋白抗体均与SVCV重组蛋白及天然蛋白发生特异性的免疫反应。ELISA结果显示,针对P蛋白制备的抗体效价最高,可达409 600;针对N和M蛋白制备的抗体效价也均大于204 800。同时,特异性检测实验结果显示,制备的3种蛋白抗体均仅与SVCV发生特异性免疫反应,而与SVCV宿主其他易感病毒均不发生交叉反应。实验结果将对SVCV的快速诊断及疫苗开发提供新的手段和思路。     

木聚糖酶对尼罗罗非鱼钠葡萄糖共转运载体（SGLT1）mRNA表达的影响

以尼罗罗非鱼[体重(106.16±16.77)g]为实验对象,小麦基础饲料为对照,小麦基础饲料中分别添加不同水平的木聚糖酶(0.05%、0.10%、0.15%)作为试验饲料。每个处理设5个重复,每个重复放养40尾雄性尼罗罗非鱼,旨在研究木聚糖酶对尼罗罗非鱼前肠和中肠钠葡萄糖共转运载体(SGLT_1)mRNA表达的影响,从分子水平揭示木聚糖酶促进尼罗罗非鱼生长的机理。饱食投喂,饲养75 d后,每饲料组分别取10尾鱼,尾静脉取血制备血清,测定血糖含量;采用离心柱型总RNA提取试剂金提取前肠和中肠总RNA,通过RT-PCR对前肠和中肠SGLT_1mRNA的表达进行相对定量。结果表明,0.05%组、0.10%组和0.15%组前肠SGLT_1 mRNA的相对表达量分别比对照组提高19.28%(P<0.05)、42.17%(P<0.01)和16.87% (P<0.05);对照组尼罗罗非鱼在摄食后2 h血糖仅为5.56 mmol·L~(-1),0.10%组极显著高于对照组(P<0.01);0.05%组和0.10%组的增重率较对照组分别提高8.29%、17.45%(P<0.01),0.15%组的增重率与对照组相比没有统计学差异(P>0.05)。研究结果表明,在小麦基础饲料中适量添加木聚糖酶能显著上调前肠SGLT_1mRNA的表达,促进葡萄糖吸收,从而提高尼罗罗非鱼的生长速度。     

鲈PPARγ基因的克隆、组织表达及其抗体制备

根据GenBank上其他物种的PPARγ基因序列设计兼并引物,从鲈肝脏cDNA中扩增得到鲈PPARγ基因cDNA序列1 588 bp,分析表明该基因的开放阅读框为1 569 bp,编码522个氨基酸,理论等电点6.06,分子量59.02 ku。将鲈PPARγ氨基酸序列比对后发现与欧洲鲈同源性最高,为93.1%;与金头鲷的同源性为92.3%,与人同源性也达到为61.8%。用RT-PCR分析该基因组织表达模式,结果表明,鲈PPARγ主要分布于肝脏、鳃和脂肪组织。将鲈PPARγ开放阅读框1 569 bp序列克隆至原核表达载体pET-28a(+)构成pET-28a-PPARγ1569重组体,并转化大肠杆菌BL21(DE3),以终浓度1 mmol/L的IPTG对其进行诱导表达4 h,SDS-PAGE电泳分析表明,pET-28a-PPARγ1569菌株在66 ku 处有1条特异的蛋白带,Western-blotting 检测表明该蛋白为鲈PPARγ融合蛋白。用镍离子亲和柱纯化的鲈PPARγ融合蛋白免疫小鼠得到其多克隆抗体。用间接ELISA法检测鲈PPARγ抗体的抗体效价约为1∶16 000。实验结果为进一步研究鲈PPARγ蛋白的生物学特性及功能奠定了基础。     

鲤IL-17N的基因克隆、表达及促炎作用

白细胞介素17（Interleukin-17,IL-17）在炎症和宿主防御中起重要作用。为了解鲤（Cyprinus carpio）IL-17N基因的功能,本研究使用同源搜索和基因克隆的方法在鲤基因组挖掘鉴定到两个IL-17N基因（CcIL-17Na和CcIL-17Nb）,均由TOP3B基因内含子2的互补序列编码。共线性比较显示,除了东方红鳍鲀（Takifugu rubripes）外,在其他已研究的鱼类中,与该基因相邻的均为SDF2L和PPM1F基因。两个CcIL-17Ns都有3个外显子,编码136个氨基酸,两者相似性高达为97.1%,CcIL-17Na、CcIL-17Nb和其他硬骨鱼类的IL-17N相似性分别为65.3%~97.1%、64.7%~96.3%,和鲤IL-17家族其他成员的相似性分别为32.9%~51.4%、31.4%~50.7%。鱼类IL-17家族系统树显示7个成员形成6支,其中IL-17A/F1和IL-17A/F3组成一支,其余6个成员单独成支,鲤IL-17N先与鲤科鱼类以94%置信值聚在一起,然后与虹鳟（Oncorhynchus mykiss）、大西洋鲑（Salmo salar）、青鳉（Oryzias latipes）、东方红鳍鲀（Takifugu rubripes）和尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）等以85%的置信值聚在一起,再与雀鳝（Lepisosteus oculatus）和腔棘鱼（Coelacanth）的IL-17N以95%置信值聚为一支。实时定量PCR结果显示CcIL-17Ns在受精后0.5 h和12 h的表达量极显著高于受精后25 h、35 h、60 h、120 h及仔鱼阶段的表达量（P<0.01）;CcIL-17Ns在鲤夏花和成鱼脑中的表达量均最高,显著（P<0.05）或极显著（P<0.01）高于其他组织。嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）感染导致CcIL-17Ns在各组织的表达均上调,感染6 h,脑中的表达量显著增加（P<0.05）,1 d,CcIL-17Ns在其他组织中均显著增加（P<0.05）,感染3 d和7 d,表达量均下降至与对照组无显著差异（P>0.05）。构建原核重组表达载体pMAL-c2X-17N,在大肠杆菌（Escherichia coli）Transetta（DE3）中进行原核表达,使用镍柱纯化获得可溶的IL-17N重组蛋白（MBP-17N）。使用0.1 ng/mL、1 ng/mL、10 ng/mL和100 ng/mL的MBP-17N孵育鲤肾组织8 h,结果显示,不同浓度的MBP-17N均使IL-1β和NF-κB显著上调（P<0.05）;1 ng/mL和10 ng/mL的MBP-17N极显著上调IFN-γ（P<0.01）;0.1 ng/mL、1 ng/mL的MBP-17N显著上调IL-6,1 ng/mL、10 ng/mL、100 ng/mL的MBP-17N显著上调CCL20（P<0.05）;1 ng/mL的MBP-17N使TRAF6的表达显著高于对照组（P<0.05）。本研究通过分析鲤IL-17Ns的系统发育、测定该基因的时空表达特征,发现嗜水气单胞菌感染后各组织CcIL-17Ns表达上调、原核表达蛋白能引起炎症因子的表达,从而证实了鲤IL-17N参与炎症反应。     

鲤疱疹病毒3型ORF136基因编码蛋白多克隆抗体的制备与鉴定

为了对鲤疱疹病毒3型(Cyprinid herpesvirus 3,CyHV-3)ORF136基因编码蛋白进行功能研究和血清学诊断,本实验通过对ORF136基因推导的第31~157位氨基酸序列进行PCR扩增,并与原核载体pET-32a(+)连接,转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态后进行IPTG诱导表达,将纯化后的重组蛋白免疫新西兰白兔(Oryctolagus cuniculus)以制备ORF136多克隆抗体,运用Western blot和间接免疫荧光技术对抗体进行鉴定。结果表明,重组融合表达蛋白大小与预期一致,约为35 kD,且主要分布在包涵体中。Western blot分析显示,免疫兔后获得的纯化ORF136多克隆抗体能特异性识别纯化的CyHV-3和感染CyHV-3的KS细胞;间接免疫荧光分析进一步表明ORF136多抗能识别感染CyHV-3的KS细胞。ORF136多克隆抗体的制备为ORF136蛋白功能研究和CyHV-3血清学诊断方法的建立提供了重要基础。     

鲤irisin多克隆抗体的制备及应用

为进一步研究鱼类糖代谢与鸢尾素(irisin)之间的关系,亟需制备irisin抗体并检测其应用可靠性。本实验通过构建Rosetta-irisin表达载体,经蛋白纯化、透析、超滤后免疫小鼠,获得相应多克隆抗体并检测其特异性和抗体效价。建立irisin检测方法,检测口服葡萄糖耐量(OGTT)、RNAi实验后鲤血清irisinA和irisinB的含量变化。免疫荧光检测鲤脑、肠道、心脏、肝胰脏irisin的表达及OGTT后,检测上述组织irisin含量变化。检测鲤肌细胞分化前后FNDC5 mRNA表达差异及irisin含量变化。结果显示,Rosetta-irisin表达载体在IPTG诱导4 h对鲤irisinA/B蛋白表达较BL21-irisin表达载体提高2.3/1.6倍;irisinA和irisinB抗体效价分别为9.0×10⁴和2.7×10⁵,不存在交叉反应,可分别对鲤血清irisinA和irisinB进行测定;OGTT后,irisinA和irisinB呈现出不同的合成变化;RNAi后,irisin含量显著降低;免疫荧光结果显示,irisin在脑中表达最高,肝胰脏次之,心脏、肠道中相对较少;OGTT后,脑、肠道、心脏和肝胰脏中irisinA和irisinB荧光强度显著增加。荧光定量表达分析与免疫荧光结果显示,鲤肌细胞分化后,FNDC5和irisin含量显著降低。综上,本实验制备了高亲和力和特异性的鲤irisinA和irisinB抗体,并检测其应用可靠性。该抗体的获得为系统研究irisin对鲤糖代谢的调控机制奠定基础。同时,鲤irisin检测方法可普遍用于其他鱼类irisin蛋白质水平的定量研究。     

团头鲂转录因子Nanog的原核表达及其多克隆抗体制备

为深入研究鱼类干细胞多能性转录因子Nanog的功能,本实验进行了团头鲂Nanog基因的原核表达和多克隆抗体的制备。首先,从团头鲂卵巢克隆出Nanog基因的编码区,将其连接到p ET32a载体上构建原核表达载体。接着将重组载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,通过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,获得预期大小的Nanog重组蛋白,并获得大量蛋白以制备抗体。最后通过ELISA检测抗体的效价和采用Western blot技术检测Nanog抗体的特异性。结果显示,在37°C,0.5 mmol/L IPTG诱导4 h可获得Nanog重组蛋白的高效表达;制备的多克隆抗体能够有效识别原核表达的Nanog蛋白及团头鲂肝脏和精巢的内源Nanog蛋白;该抗体也可应用于检测HepG2细胞中过表达的团头鲂Nanog蛋白。本研究为蛋白的原核表达和特异性抗体的制备及验证提供了研究思路,也为研究鱼类Nanog基因功能提供了特异性抗体。     

罗非鱼AMH基因的原核表达及多克隆抗体制备

抗苗勒氏管激素(anti-mullerian hormone, AMH),也称苗勒氏管抑制物质(mullerian inhibiting substance, MIS),为肽类生长因子,属于TGF-β生长和分化因子家族。为研究AMH对奥利亚罗非鱼性腺发育的作用,应用DNAstar软件分析罗非鱼AMH基因的抗原性,选择抗原性较强的22～243氨基酸作为目的片段构建了AMH的原核表达载体并进行融合表达。首先利用RT-PCR方法从性腺中扩增出长约663 bp的目的序列AMH基因,克隆至T载体中,经酶切鉴定和序列测定分析确认序列的正确性后将此片段克隆到表达载体pGEX-5x-1中构建重组表达质粒pGEX-AMH,并在大肠杆菌BL21中获得了高表达,目的蛋白约占菌体总蛋白的38.7％。菌体经溶菌酶裂解,制备无细胞抽提液,GSTrap FF column柱层析后得到分子量为49 ku单一条带的目的蛋白。目的蛋白经FactorXa酶切裂解,GSTrap FF column过柱纯化后得到纯化的AMH蛋白,分子量为26 ku,浓度为2.6 mg/mL。以每只20 μg的剂量4次免疫ICR小鼠,免疫小鼠可以检测到特异性针对AMH蛋白的血清抗体应答,免疫组抗体水平显著高于空白组(P<0.05),且加强免疫第5周后抗体效价为0.672±0.411,达到高峰值,血清效价为1∶2 000。试验结果表明表达产物具有免疫原性,可以刺激机体产生免疫应答。     

茜素络合物对鲤仔鱼耳石标记特征研究

利用100 mg/L的茜素络合物（alizarin complexone,ALC）对鲤仔鱼进行48 h的水环境浸泡标记,以探讨该ALC标记方法的特征,及其对矢耳石、星耳石和微耳石的标记效果以及鱼体ALC浸泡、续养恢复与耳石ALC标记区域形成和消失的时滞进行研究。结果显示,3种耳石在可见光和荧光下均能检测到明显的标记环。其中星耳石的标记效果最佳,微耳石次之。耳石上荧光信号出现和消失的时间与鱼体ALC浸泡开始和结束的时间均存在1 d的时滞。此外,浸泡标记过的鲤仔鱼在进行了长达50 d的续养恢复后,其耳石上的ALC标记环仍清晰可见。研究表明,ALC标记法所形成的标记环在耳石上可长期存在,使用ALC对鲤仔鱼进行生态标记具有很强的可行性。     

黑龙江野鲤和建鲤正反交与自交子代血液学指标的比较

从2008年8月25日至10月8日对黑龙江野鲤自交子代、建鲤自交子代、黑龙江野鲤♀×建鲤♂子代和黑龙江野鲤♂×建鲤♀子代4个群体进行了为期45 d的网箱养殖。而后,对两杂交群体和两自交群体血液学指标进行了测量比较,分析由于杂交而造成的血液学指标的变化并探讨其生物学意义。结果显示,黑龙江野鲤♀×建鲤♂子代与黑龙江野鲤自交子代相比在血糖和血红蛋白2个指标上分别存在极显著和显著差异(P＜0.01或P＜0.05);与建鲤自交子代相比在总蛋白和平均红细胞血红蛋白浓度2个指标上分别存在极显著和显著差异(P＜0.01或P＜0.05)。黑龙江野鲤♂×建鲤♀子代与黑龙江野鲤自交子代相比在总蛋白、谷丙转氨酶、总胆固醇和血红蛋白4个指标上分别存在极显著和显著差异(P＜0.01或P＜0.05）;与建鲤自交子代相比在谷丙转氨酶、血糖、甘油三脂和谷草转氨酶∶谷丙转氨酶4个指标存在极显著差异(P＜0.01)。血液学指标的差异反映出,两杂交群体和两自交群体相比,在代谢水平、免疫能力、肝脏功能、性腺发育和氧的运输能力上均发生了不同程度的变化,而这些变化可能是由于亲本不同造成子代遗传结构的不同而引起。     

黄颡鱼细胞因子信号传导抑制因子SOCS1的原核表达及多克隆抗体制备

细胞因子信号传导抑制因子(suppressor of cytokine signaling, SOCS)是一类由细胞产生的胞内蛋白,能够反馈性阻断细胞因子信号传导过程的负性调控因子。为深入研究黄颡鱼细胞因子信号传导的发生过程和机制,实验从黄颡鱼cDNA中克隆获得561 bp的黄颡鱼SOCS1(PfSOCS1)基因编码序列,成功构建了重组质粒pET32a(+)-PfSOCS1,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,在不同温度、IPTG浓度、诱导时间等条件下进行表达,确定最佳表达条件。本实验采用包涵体纯化的方法得到纯度较高的重组SOCS1蛋白;以重组PfSOCS1蛋白免疫Balb/C小鼠,制备多克隆抗体。通过Western blot鉴定了PfSOCS1抗血清可以特异性识别重组PfSOCS1蛋白。蛋白水平的组织分布显示,黄颡鱼SOCS1蛋白在肝脏中表达水平较高。