斑点叉尾(鮰)源海豚链球菌DGX07株simA基因克隆、鉴定及分子特性分析

以Primer p14(5’-GATCAAGTCC-3’)为引物对分离自患病斑点叉尾(鮰)海豚链球菌强毒株DGX07进行RAPD分析.同时参照GenBank中海豚链球菌simA基因序列设计特异性引物,以DGX07基因组DNA为模板,扩增出约1 500 bp的simA基因,并将其克隆到pMD19-T载体上,之后对重组质粒进行PCR和双酶切(BamH Ⅰ+Xho Ⅰ)鉴定,鉴定正确后送测序公司测序.RAPD分析结果显示,DGX07和标准菌株均能扩增出750 bp大小的条带.通过生物信息学软件对测序结果分析显示,simA基因全长1 566bp,由521个氨基酸组成,与海豚链球菌simA和simB亲缘性达100％,存在1个由41个氨基酸组成的信号肽,具有Bap31和Gram_pos_anchor两个超家族的保守结构域;具有与蛋白翻译后修饰功能相关的磷酸化位点22个和N-糖基化位点2个,编码多肽链中亲水区大于疏水区,是一种膜外蛋白,并具有多个抗原优势位点区域.密码子偏爱性分析表明,斑点叉尾(鮰)源海豚链球菌simA基因密码子使用频率差异较大,密码子偏爱性与酵母较为接近.获得GenBank登录号为JF330100.     

海豚链球菌兼职蛋白FBA的克隆表达、抗原性检测及免疫效果评价

为检测斑点叉尾鮰源海豚链球菌兼职蛋白(fructose-1,6-bisphosphate aldolases,FBA)的抗原性和潜在的疫苗价值,本实验克隆得到斑点叉尾鮰源海豚链球菌DX09(基因组登陆号LXQF01)的fba基因序列(基因登录号A7N10_RS06935),对克隆序列进行生物信息学分析,并通过原核表达得到重组FBA蛋白(r FBA),制备了兔抗r FBA血清用于FBA蛋白抗原性检测,同时通过免疫保护实验评估重组蛋白的免疫保护效果。结果显示,海豚链球菌DX09 fba基因有1个882 bp的开放阅读框(ORF),编码293个氨基酸。生物信息学分析显示,其分子式为C_(1378)H_(2172)N_(368)O_(422)S_8,分子质量为30.9 ku,理论等电点为5.01,不具有信号肽和跨膜区域;具有保守的裂解酶结构域,且与其他来源的FBA蛋白同源性达100%;具有较高的抗原指数,表明其可形成多个抗原表位。SDS-PAGE检测发现,诱导表达的重组蛋白以包涵体的形式出现在沉淀中,大小约为47 ku。Western blot分析表明,兔抗r FBA血清能特异性结合菌体蛋白。同时免疫保护实验显示,重组蛋白对斑点叉尾鮰的相对保护率可达55%,免疫后鱼体抗体水平相对对照组显著升高。本研究表明,原核表达的斑点叉尾鮰源海豚链球菌DX09 rFBA具备较好的抗原性和免疫保护作用,具有研发斑点叉尾鮰海豚链球菌亚单位疫苗的潜在价值。     

罗非鱼源无乳链球菌cpsE基因的克隆和分子特性分析

利用特异性引物,采用PCR扩增出分离自患病罗非鱼无乳链球菌强毒株的cpsE基因,将其克隆到pMD19-T载体上,通过菌落PCR鉴定和利用限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ对重组质粒进行双酶切鉴定之后送测序公司测序,并利用生物信息学软件Clustal X 2.0、MEGA 4.1、Bioedit 7.0、TMHMM、NetPhos 2.0、NetNGlyc 1.0、SignalP 3.0 Server、PSIpred、SAM_T08以及CUSP等分析cpsE基因的分子特性。结果显示,罗非鱼源无乳链球菌cpsE编码氨基酸序列具有高度保守性,与人源、动物源无乳链球菌亲缘性达100%,具有1个参与催化糖基元转运的Glycosyltransferases超级家族结构域,具有与蛋白翻译后修饰功能相关的磷酸化位点3个,编码多肽链中亲水区大于疏水区,且存在跨膜区。密码子偏爱性分析表明,罗非鱼源无乳链球菌cpsE基因密码子使用频率差异较大,密码子偏爱性更接近真核生物。     

斑点叉尾鮰血浆铜蓝蛋白的全长cDNA克隆及表达特征分析

本研究克隆了斑点叉尾鮰中血浆铜蓝蛋白基因全长cDNA序列,其中5′非翻译区(5′-UTR)25 bp、3′非翻译区(3′-UTR) 860 bp、开放阅读框(Open reading frame,ORF) 3 225bp,编码一条含有1 074个氨基酸的多肽链。与其他真核生物血浆铜蓝蛋白成员进行同源性比较,表现出较高的保守性。本研究利用荧光实时定量PCR技术分析了斑点叉尾鮰血浆铜蓝蛋白基因在正常组织和被不同病菌感染后的肝脏、肠、头肾及脾脏中的表达。结果发现,正常组织中血浆铜蓝蛋白基因在正常肝脏中表达最强烈。4种病原（迟钝爱德华氏菌、海豚链球菌、嗜水气单胞菌和斑点叉尾鮰呼肠孤病毒）引起的血浆铜蓝蛋白基因的应答在不同组织中都有差异。血浆铜蓝蛋白基因对海豚链球菌的应答最为显著,而对呼肠孤病毒的应答最不明显。而且不难发现,感染4种病原菌后,血浆铜蓝蛋白基因在头肾中的表达都出现明显的上调。     

斑点叉尾鮰暴发海豚链球菌病的研究

2006—2007连续两年广西斑点叉尾鮰网箱养殖暴发一种流行性传染病,该病波及面广,传染性强,死亡率30％～100％。发病症状主要表现为浮头、转圈、狂游及发病后期单边眼睛浑浊、突出及伴有全身大面积弥漫性出血。作者先后从症状较为典型发病班点叉尾鮰分离到CMS003～CMS005、CMS009～CMS012共7株代表性菌株,经人工感染实验表明分离菌株对健康斑点叉尾鮰具有很强的致病力,出现症状与自然发病斑点叉尾鮰症状相同。通过常规形态、生理生化及海豚链球菌（Streptococcus iniae）特异性PCR诊断和16S rRNA基因序列系统发育进化分析方法对分离菌株进行分类鉴定,结果表明分离的7株细菌均为海豚链球菌。研究结果表明,海豚链球菌已成为广西斑点叉尾鮰网箱养殖的高致病性病原菌。     

斑点叉尾鲴线粒体DNA控制区结构和群体遗传多样性分析

经克隆测序获得了我国5个批次引进的40尾斑点叉尾鲴(Ictalurus punctatus)群体的线粒体控制区全序列,研究控制区序列结构和群体遗传变异.结果显示:比对长度包括906个位点,共有变异位点28个,简约信息位点21个.通过与GenBank中其它鱼类的mtDNA控制区序列进行结构分析,将斑点叉尾鲴的控制区分为终...     

无乳链球菌和海豚链球菌早期预警分子检测

为提高罗非鱼链球菌病发前的早期预警,根据海豚链球菌的16S rRNA基因的部分序列和无乳链球菌的Sip基因特异性序列,分别合成特异性检测引物,经过对反应体系和反应条件的优化,建立检测较低含量的无乳链球菌和海豚链球菌的分子技术.试验结果显示,所建立的双重PCR可扩增出870 bp无乳链球菌和614 bp海豚链球菌的特异性...     

斑点叉尾鮰肠败血症（ESC）PCR

由鮰爱德华氏细菌引起的肠败血症（ESC，又称爱德华氏病）是影响斑点叉尾鮰养殖最大的疾病。为快速和准确的诊断该疾病，本研究以NCBI公布的妇爱德华氏细菌eip基因（GeneBank登录号为AF037441）为模板序列，设计种特异性诊断引物，成功建立了用于斑点又尾鮰肠败血症病原菌的PCR检测方法。研究结果表明。该方法能够直接从发病斑点叉尾鮰脑、肝、脾和肾组织中检测到妇爱德华氏菌，检测的最低量为21个细菌；同时，该诊断方法与Ⅰ型荧光假单胞菌、点状产气单胞菌点状亚种、鳗弧菌、温和气单胞菌、肠型点状产气单胞菌、拄状黄杆菌、嗜水气单胞菌、河孤菌、豚鼠气单胞菌及海豚链球菌等常见水产病原菌无交又反应。临床样品检测证明。本研究所建立的PCR检测方法可以用于斑点叉尾鮰肠败血症的快速诊断。     

大鳍鳠 IL-1β基因cDNA克隆及表达分析

白细胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)作为炎症反应的关键介导物,通过开启基因的表达来调控免疫反应。为了丰富鱼类该基因的研究,实验采用RT-PCR和RACE-PCR技术,首次从鲇形目鱼类大鳍鳠中获得IL-1β基因cDNA的全序列。大鳍鳠IL-1β基因cDNA全长1 194 bp,包括3’非编码区域(UTR)为224 bp,5’UTR为82 bp,开放阅读框(ORF)为888 bp,编码296个氨基酸。预测的蛋白质分子量为33.843 43 ku,等电点为5.00。与斑点叉尾等其他8种脊椎动物进行同源性分析发现,大鳍鳠IL-1β氨基酸序列与斑点叉尾相似性最高,为79.0%,与原鸡的相似性最低,为22.0%。进化树分析表明,大鳍鳠IL-1β与斑点叉尾聚为一支。半定量PCR显示,大鳍鳠IL-1β基因在肌肉、脑、脾脏、头肾、体肾、胃、皮肤、肝脏及肠等组织中都有不同程度的表达;经嗜水气单胞菌刺激后大鳍鳠IL-1β基因在头肾和脾脏的转录表达显示,1 d后该基因在头肾与脾脏中的表达量都达到最大,15 d后恢复到刺激前的水平。研究显示,大鳍鳠IL-1β在抵御病原感染过程中发挥重要作用。     

斑点叉尾肠败血症(ESC)PCR诊断方法的建立

由爱德华氏细菌引起的肠败血症(ESC,又称爱德华氏病)是影响斑点叉尾养殖最大的疾病。为快速和准确的诊断该疾病,本研究以NCBI公布的爱德华氏细菌eip基因(GeneBank登录号为AF037441)为模板序列,设计种特异性诊断引物,成功建立了用于斑点叉尾肠败血症病原菌的PCR检测方法。研究结果表明,该方法能够直接从发病斑点叉尾脑、肝、脾和肾组织中检测到爱德华氏菌,检测的最低量为21个细菌;同时,该诊断方法与I型荧光假单胞菌、点状产气单胞菌点状亚种、鳗弧菌、温和气单胞菌、肠型点状产气单胞菌、柱状黄杆菌、嗜水气单胞菌、河弧菌、豚鼠气单胞菌及海豚链球菌等常见水产病原菌无交叉反应。临床样品检测证明,本研究所建立的PCR检测方法可以用于斑点叉尾肠败血症的快速诊断。     

罗非鱼海豚链球菌16S rRNA基因的序列测定和系统进化分析

为了从分子水平上对1株致病性罗非鱼链球菌进行分类学鉴定,利用原核生物16SrRNA基因通用引物对分离纯化的罗非鱼致病性链球菌进行16S rRNA基因的克隆及序列分析。结果扩增出长约1.5 kp目的片段,测序得到1条长度为1 447 bp核苷酸序列。核苷酸相似性分析表明,序列与NCB I公布的海豚链球菌(Streptococcus iniae,S.iniae)SCCF5L菌株16SrRNA基因核苷酸序列相似性最高(99.4%),暂称为中国广西株(S.iniae-CGX)。同时,亲源关系较近的S.iniae、S.difficilis和S.agalactiae代表菌株构建的系统发育进化树显示,所得菌株与S.iniae代表菌株组成同一进化分支,与S.agalactiae代表菌株组成的另一进化分支距离较近(95.5%),而与S.difficilis代表菌株组成的进化分支距离较远(92.3%)。上述研究证实,本试验从发病罗非鱼脑组织分离到的致病性链球菌为海豚链球菌。     

广东省养殖罗非鱼、海鲈、尖吻鲈海豚链球菌感染调查

利用细菌分离培养方法结合特异PCR技术,对广东省珠三角地区养殖罗非鱼(Oreochromis spp.)、海鲈(Lateolabrax japonicus)及尖吻鲈(Lates calcarifer)的海豚链球菌(Streptococcus iniae)感染情况进行了周年调查。每月固定时间在特定养殖区域采集目标鱼的脑、肝、脾、肾和肌肉等组织,并对其进行海豚链球菌的细菌分离培养鉴定。仅从已经患病的尖吻鲈中分离到3株链球菌,经生理生化鉴定和16S rDNA测序确定为海豚链球菌。利用海豚链球菌特异PCR技术对上述养殖鱼类不同组织进行检测,发现罗非鱼、海鲈、尖吻鲈的海豚链球菌感染率分别为30.21%、23.53%、14.55%,其中罗非鱼脑和肌肉的感染率明显较其他组织高(P<0.05),分别为20.65%和23.75%;海鲈的脑部和肌肉感染率也较其他组织高(P<0.05),分别为12.1%和10%;而尖吻鲈各组织感染率没有较大差异(P>0.05)。另外,研究结果还表明采集样本的海豚链球菌感染率随着其体长的增加而呈现下降趋势。     

海豚链球菌simA和pgmA真核表达质粒对尼罗罗非鱼免疫保护的研究

尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)是世界水产养殖业中的重要经济鱼类,但在养殖生产中易受海豚链球菌(Streptococcus iniae)感染而致病致死,使用疫苗是一种相对理想的防感染措施。该研究采用海豚链球菌simA、pgmA基因构建的真核表达载体作为DNA疫苗,肌肉注射罗非鱼评估疫苗保护效果。免疫后在DNA和RNA水平上,在注射鱼体内检测到2个目的基因。首次免疫后第7至第28天,鳃、肝、肾脏、头肾中疫苗组的白介素1 (Interleukin,IL-1β)与肿瘤坏死因子(Tumor Necrosis Factor,TNF-α)表达量高于PBS对照组;疫苗组的抗体滴度、血清抗菌活性显著(P<0.05)高于PBS对照组。攻毒后,注射pcDNA3.1-pgmA、pcDNA3.1-simA、pcDNA3.1-pgmA与pcDNA3.1-simA等比例混合疫苗的相对保护率(Relative percent survival,RPS)分别为60.7%、49.9%和75.0%。结果表明所制备的疫苗具有免疫保护效果,可作为候选疫苗。     

Evaluation of the link between gyrodactylosis and streptococcosis of Nile tilapia, Oreochromis niloticus (L.)

Streptococcus iniae and Gyrodactylus niloticus are two common pathogens of cultured Nile tilapia, Oreochromis niloticus. We studied concurrent infection of tilapia by G. niloticus and S. iniae and evaluated whether parasitism in tilapia with Gyrodactylus increased susceptibility and mortality following immersion infection with S. iniae. Results showed that death mainly occurred in fish with G. niloticus and challenged with S. iniae (G-S group). The accumulative mortality (42.2%) was significantly higher in the G-S group than in fish not infected by the parasite (6.7%), but exposed to S. iniae. Bacteriological examination revealed S. iniae from > or =92% of dead or moribund fish challenged with S. iniae. Gyrodactylus not only damaged fish epithelium and provided entry for invasive bacteria but also was found to harbour viable cells of S. iniae for 24 and 72 h. Streptococcus iniae was isolated from 60% and 40% of G. niloticus collected from fish infected by intraperitoneal injection or immersion, respectively, at 24 h post-challenge. The present study confirms that parasitism of tilapia by G. niloticus increased host mortality following exposure to the bacterial pathogen S. iniae.     

Development of a Penaeus monodon-type baculovirus (MBV) DNA probe by polymerase chain reaction and sequence analysis

Abstract. Penaeus monodon -type baculovirus (MBV) was isolated and purified from the hepatopancreases of MBV-infected Penaeus monodon Fabricius. MBV DNA was extracted and used as a template in a polymerase chain reaction (PCR). The primers were chosen from conserved regions of the polyhedrin gene of Autographa californica nuclear polyhedrosis virus (AcNPV). One DNA fragment (674 base pairs) was amplified after PCR. There was a 65% homology between the predicted amino acid sequence of this PCR product with that of the polyhedrin polypeptide of AcNPV. Nucleotide sequence analysis indicated that the amplified DNA is the open reading frame of the MBV polyhedrin gene. This 674 bp DNA fragment was subsequently used as a probe in a dot blot analysis. The probe was able to hybridize with the DNA extracted from the purified MBV and from the MBV-infected P. monodon , but not from the MBV uninfected P. monodon.     

Rapid identification of Streptococcus iniae by specific PCR assay utilizing genetic markers in ITS rDNA

The 16S-23S intergenic spacers (ITS) of ribosomal DNA from ten independent isolates of Streptococcus iniae and one reference strain ATCC29178 were sequenced, aligned and used to design a polymerase chain reaction (PCR) primer set for rapid and specific detection and identification of S. iniae. This primer set amplified a 377-bp DNA fragment specifically from S. iniae, but not from other common bacterial pathogens of fish or from non-fish pathogens. The PCR conditions were optimized to allow detection of the organism from agar, broth culture or infected fish tissue. The sensitivity of the PCR assay was established by the detection of DNA as low as 0.02 ng or as few as 10 CFU bacterial cells. The establishment of the specific PCR assay provides a useful tool for the identification and diagnosis of fish infection with S. iniae.     

军曹鱼MHC-Ⅰα基因全长cDNA的克隆及其组织表达分析

采用同源克隆和末端快速扩增（RACE）方法,得到1330bp的军曹鱼（Rachycentroncanadum）MHC-Ⅰα全长cDNA片段。该序列包括76bp的5’末端非编码区（UTR）,189bp的3’UTR及1065bp的开放阅读框（ORF）,编码354个氨基酸,预测其蛋白质分子量约40．10kDa,等电点5．70。构建MHC-Ⅰα氨基酸序列的系统进化树并进行氨基酸相似性比对,结果表明,军曹鱼和已知鱼类及人类（Homosapiens）MHC-Ⅰα氨基酸的同源性在27．9％～67．1％之间。所推测的蛋白序列具有一些重要特征,包括前导肽、α1、α2、α3区、CP／TM／CYT区和保守的半胱氨酸等。Real—timePCR检测结果显示,MHC-Ⅰα基因在各个正常军曹鱼组织中均表达,但表达量各有不同,其中较强的表达于头肾;中等程度表达于鳃、脾和肠;在心、脑和肌肉中表达较弱。     

西伯利亚鲟海豚链球菌和鲟疱疹病毒Ⅱ型混合感染的诊断与病理损伤

2018年8月,四川彭州与邛崃的养殖西伯利亚鲟发生一种以出血为临床特征,高死亡率的传染病,为明确其病因,本研究对发病鲟的肝脏、肾脏进行病原菌分离、鉴定和鲟疱疹病毒Ⅱ型(AciHV-2)的PCR检测。从患病鲟体内分离到2株G+链状球菌,其16S rRNA序列(MN416231、MN416230)与GenBank中海豚链球菌16S rRNA序列同源性达99%,在以16S rRNA序列构建的系统发育树上,分离菌与海豚链球菌聚为一支;同时基于海豚链球菌lctO基因的特异性PCR检测为阳性,鉴定2株分离菌为海豚链球菌。提取患病鲟肝脏、肾脏组织DNA进行AciHV-2特异性PCR检测,扩增出501 bp的特异性条带,在以AciHV-2 polymerase基因序列构建的系统发育树上,检测样本与AciHV-2聚为一支。病理组织学上,患病鲟的多组织器官发生明显损伤,尤其是肝脏、肾脏、鳃、脾脏和肠的损伤较为严重,表现为明显的变性、坏死、出血以及炎症细胞浸润;电镜下,观察到肝脏、肾脏组织内大量直径200～220 nm的疱疹病毒样颗粒与0.7～0.8μm的链球菌入侵细胞,并导致细胞损伤。综上,诊断患病西伯利亚鲟的病因是海豚链球菌与AciHV-2混合感染。     

哲罗鲑胰岛素样生长因子－I（IGF－I）cDNA 分子克隆、序列分析及组织表达

采用逆转录聚合酶链式反应（RT－PCR）方法,从哲罗鲑（Hucho taimen）肝脏的总 RNA 中扩增出胰岛素样生长因子－I（IGF－I）的 cDNA 开放阅读框（Open reading frame, ORF）序列,运用软件对其进行生物信息学分析,并利用荧光实时定量 PCR 技术检测了哲罗鲑成鱼不同组织中 IGF－I mRNA 的表达情况。结果显示, IGF－I 基因的 cD－NA 开放阅读框为573 bp,编码190个氨基酸,蛋白质等电点为9．21,氨基酸结构由信号肽、 B、 C、 A、 D 结构域及 E 肽组成;氨基酸序列与其他鲑科鱼类具有较高的同源性,其中与北极红点鲑的 IGF－I 同源性最高（99．2％）;组织表达分析显示,哲罗鲑 IGF－I mRNA 在肝脏中表达量最高,在鳃、前肠中次之,在脑、头肾、脾、心、胃和肌肉等组织中的表达量较低。     

斑点叉尾TLR5和TLR5S基因在不同病原诱导下的表达特征

分别用迟钝爱德华氏菌Edwardsiella tarda、嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila、链球菌Streptococcus iniae和斑点叉尾(鱼回)呼肠孤病毒(channel catfish hemorrhage reovirus,CCRV)对斑点叉尾(鱼回)Ictalurus punctatus进行感染实验,取感染后0h、12h、24h、48h、72h和7d的头肾、肠、肝脏和脾脏,采用实时定量PCR方法检测了TLR5和TLR5S基因在这4种免疫相关组织中的时空表达特征,探讨它们与斑点叉尾(鱼回)先天免疫反应的关系.结果表明,链球菌和迟钝爱德华氏菌能够引起TLR5和TLR5S强烈的上调表达,其中以感染链球菌12h后TLR5S在头肾中的表达上调量最为显著,与对照组相比提高了132倍(P＜0.01).在感染嗜水气单胞菌后的24h内TLR5和TLR5S基因的表达量上升,但随后却显示出了明显的下调趋势,而斑点叉尾(鱼回)呼肠孤病毒在TLR5和TLR5S基因表达中起到了明显的抑制作用,于大部分组织中表达下调.在感染12h的脾脏中,TLR5基因的表达量仅为对照组的0.017倍(P＜0.01),而TLR5S基因表达量达到最低,仅为对照组的0.01倍(P＜0.01).从不同的组织来看,TLR5在肠中的表达上调幅度最大,而TLR5S在头肾中的表达增幅最明显,如感染链球菌和迟钝爱德华氏菌12h后,TLR5在肠中的表达量分别增加了50.4倍(P＜0.01)和14.8倍(P＜0.01),TLR5S在头肾中的表达量分别上升了52.8倍(P＜0.01)和132倍(P＜0.01).以上结果进一步证明了TLR5和TLR5S基因在斑点叉尾(鱼回)先天免疫反应过程中发挥着非常重要的作用,同时在抗病原侵袭过程中表现出了一定的组织特异性和病原特异性.