草鱼出血病病毒854株的纯化及其理化特性

离心技术纯化病毒。病毒粒子具双层衣壳,直径约为65nm。病毒对氯仿、乙醚、酸碱、胰蛋白酶的处理不敏感。冻融和56℃、1小时处理,毒力下降显著。-80℃、-30℃两种温度条件下保存,其毒力损失有差异。鱼用消毒剂鱼康有杀病毒作用。     

草鱼出血病病毒vp6核酸疫苗的免疫效果评估

为了评估草鱼出血病病毒(GCRV)vp6基因核酸疫苗的免疫效果,将vp6基因克隆进pFastBacTMDual载体杆状病毒的多角体蛋白(Ph)启动子下游,同时将团头鲂(Megalobrama amblycephala)β-actin启动子控制的vp6基因克隆进杆状病毒的P10启动子下游,获核酸疫苗载体pFastBac-FA-VP6-ph-VP6。按每尾分别注射疫苗载体10、30、60μg的剂量免疫草鱼(Ctenopharyngodon idellus)(体长14～20 cm,体质量60～120 g),同设pFastBacTMDual载体(30μg/尾)阴性对照组及空白对照组(0.4 mL/尾无菌水)。于免疫后不同时间通过RT-PCR检测免疫鱼体中vp6基因的表达,并于免疫后第14、21、28、49、70天分别通过间接凝集反应检测血液中的抗体水平,并在免疫第21天感染GCRV评估免疫保护效果。结果显示,核酸疫苗免疫草鱼后,各免疫组均有抗体产生,抗体效价在免疫后第28天达到最高;攻毒后每尾注射疫苗载体10、30、60μg组的死亡率分别为0%、0%、5%,pFastBacTMDual载体对照组和空白对照组分别为30%和100%。表明构建的核酸疫苗对草鱼病毒性出血病有较好的免疫保护效果。     

草鱼出血病浸泡免疫技术

草鱼是整个养殖品种最易感染疾病的一种,特别是出血病,流行范围极广,死亡率高达80%以上,并能诱发烂鳃、赤皮、肠炎等病。其病症表现为①红肌肉型:病鱼体色呈暗黑而微红,将皮肤剔除后,肌肉呈点状或斑块状出血;病情严重的全身出血,呈鲜红色。②红鳍红鳃盖型:病鱼的口腔、下腭、鳃盖、眼眶四周以及鳍的基部出血,有的鳞片也出血,肌肉局部点状出血或全身出血。③“肠炎”型:病鱼体表及肌肉出血都不甚明显,但肠道局部出血或全部出血呈鲜红色,肠系膜和周围脂肪有明显的出血点,     

草鱼出血病注射免疫技术推广试验报告

草鱼生长速度快,肉味鲜美,是我国池塘养殖的当家品种之一,但由于草鱼在饲养过程中易患各种疾病,尤其是草鱼出血病发病季节长,流行范围广,每年6—10月当水温26℃—36℃时常发生此病,对当年草鱼种危害极其严重,而且也是来年成鱼养殖继发病或激发细菌     

草鱼出血病的免疫试验

我所与邵阳市城东公社五里牌大队渔场刘益善同志协作，共同开展草鱼出血病的免疫试验，初步获得成功。按中国科学院水生所提供的办法是：取典型病鱼的肾、肝、脾和肌肉组织，捣碎匀浆，加生理盐水(含Nac10．65％)，使成20倍浓度，3000转／分离心半小时，取上层清液再按800单位／毫升加入青、链霉素，加入甲醛液使最终浓度成为0．1％。     

草鱼Mx蛋白基因的克隆与原核表达

根据已报道的Mx蛋白cDNA序列设计合成特异引物，应用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法，从草鱼呼肠孤病毒(GCRV)诱导的草鱼(Ctenopharyngodon idellus)肝脏总RNA中扩增获得Mx蛋白cDNA，回收纯化后克隆到pGEM-T Easy Vector系统的T载体上。重组子的序列分析表明：所克隆的Mx蛋白cDNA长722bp，编码240个氨基酸，包括1个三联GTP结合区域和1个发动蛋白(dynamin)族特征的序列。与已知鱼类Mx蛋白基因序列比较表明，草鱼Mx蛋白基因序列与其它鱼类Mx基因相应序列具有较高的同源性，其中与斑马鱼Mx蛋白E型基因碱基序列比较同源性最高，为87．1％。将此基因改造后定向克隆至原核表达质粒pBV220，构建成重组草鱼Mx蛋白基因表达质粒pBVgcMx，并在大肠杆菌中获得高效表达，重组草鱼Mx蛋白的表达量占菌体总蛋白的26．6％。Q-sephrose FF层析柱分离纯化的重组草鱼Mx蛋白纯度达95．6％。     

草鱼呼肠孤病毒VP6蛋白基因植物表达载体的构建

以据草鱼呼肠孤病毒(GCRV)VP6蛋白的全基因序列(GeneBank AF403394)为模板,采用RT-PCR构建了草鱼呼肠孤病毒VP6蛋白基因植物表达载体的构建。结果显示:实验构建的pCR 2.1-VP6重组质粒含有NcoⅠ和BglⅡ酶切位点;pCR 2.1-VP6重组质粒经PCR扩增和测序显示含有1.3 Kbp的草鱼呼肠孤病毒VP6基因读码框片段。将目的片段VP6酶切、克隆到携带有绿色荧光蛋白(GFP)基因的植物表达载体pCAMBIA1302中,再经酶切、PCR扩增和序列测定显示,pCAMBIA1302-VP6含有1.3 Kbp的草鱼呼肠孤病毒VP6基因片段,说明已插入植物表达载体pCAMBIA1302绿色荧光蛋白基因前,成功构建了融合表达草鱼呼肠孤病毒VP6蛋白和绿色荧光蛋白的植物表达载体pCAMBIA1302-VP6。     

Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒VP4、VP35蛋白多克隆抗体制备及其免疫原性分析

为建立针对Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒(GCRV)的血清学检测方法,分别构建了GCRV JX02株外衣壳蛋白VP4、VP35的原核重组表达质粒PGEX-4T-3-S6、PGEX-4T-3-S11,用纯化的重组蛋白r VP4、r VP35分别免疫小鼠制得相应的多克隆抗体,用间接ELISA方法测定2种抗体的效价,用Western Blot鉴定抗体的特异性。SDS-PAGE分析细菌表达的r VP4、r VP35大小分别约为98ku和61ku,且都主要以包涵体的形式存在;间接ELISA方法测定制备的抗体效价分别约为1:4×105和1:106;Western Blot结果显示,制备的2种多克隆抗体都既能够识别原核表达的重组蛋白,又能够识别JX02毒株上的对应蛋白,并且发现感染JX02的草鱼血清中存在结合VP4、VP35的相应抗体。本研究制备的2种多克隆抗体都具有良好的生物学特性,并且这2种重组蛋白作为相应抗体捕获原可以用于通过检测抗病毒抗体来确诊草鱼是否感染Ⅱ型GCRV。本研究将为GCRV主要流行株血清学检测方法的建立以及VP4、VP35蛋白相关功能研究奠定基础。     

草鱼呼肠孤病毒VP6蛋白在毕赤酵母中表达的初步研究

根据GeneBank中草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)104株VP6蛋白的全基因序列(HM234682)设计一对特异引物,以提取的GCRV-104核酸为模板,采用RT-PCR技术扩增VP6蛋白编码基因,并将其克隆到含强启动子AOXⅠ的毕赤酵母(Pichia pastoris)表达载体pPICZB上。重组酵母质粒pPICZB-VP6经SacⅠ线性化,电击转化到毕赤酵母KM71菌株中,Zeocin抗性平板上筛选高拷贝转化子。阳性转化子在30℃,0.5%(V/V)的甲醇添加量的条件下,连续诱导3 d,表达产物经SDS-PAGE和Western-Blotting检测,结果表明成功实现了GCRV-104 VP6蛋白在毕赤酵母中的胞内表达,重组VP6蛋白相对分子质量约46 000,与天然VP6蛋白相对分子质量接近,并且可与鼠抗草鱼GCRV-104 VP6蛋白的多克隆抗体特异性结合。     

草鱼呼肠孤病毒HZ08株VP4蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为了建立针对草鱼呼肠孤病毒(GCRV)流行株的血清学检测方法,实验构建了能高效表达GCRV HZ08株主要衣壳蛋白VP4的重组表达载体pET32a-S6,利用纯化的VP4重组蛋白免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞与SP2/O细胞融合,经过克隆和筛选,获得3株能稳定分泌抗VP4重组蛋白单克隆抗体(monoclonal antibody,MAb)的杂交瘤细胞,分别命名为2C2、2F3和5E5.抗体经亚型鉴定均为IgG1,轻链为K链;间接ELISA试验证明,3株杂交瘤细胞分泌的MAb可特异性识别GCRV-HZ08,与GSRV,ISKNV,IHNV均无交叉反应.选择2C2作为腹水生产细胞株,免疫小鼠后腹水ELISA效价为1∶720 000;IFA和Western-blotting结果显示,这株杂交瘤细胞分泌的MAb能够特异性识别GCRV-HZ08病毒粒子.本实验制备的MAb具有良好的生物学特性,为GCRV流行株血清学检测方法的建立及VP4蛋白相关功能研究奠定了基础.     

In vivo antiviral efficacy of moroxydine hydrochloride against grass carp reovirus and the drug safety assessment

Our previous studies have verified that moroxydine hydrochloride (Mor) could inhibit replication of grass carp reovirus (GCRV) and suppress apoptosis of Ctenopharyngodon idella kidney cells, but be lack of information whether exists on antiviral activity in vivo. The paper was undertaken to explore the antiviral response of Mor against GCRV in grass carp and investigate the safety of drug for aquatic organisms. The results showed that injection treatment of Mor could more effectively inhibit GCRV replication than immersion administration. All the RNA systheses of vp3 and vp6 on day 7 in head kidney, gill, hepatopancreas and dorsal muscle in the Mor injection group were lesser than 0.07‐fold than that of in control group. And the GCRV‐inducing grass carp mortality was effectively controlled within 7 days post Mor injection therapy. Additionally, the reduction of superoxide dismutase activity, total antioxidant capacity and catalase activity in serum was effectively controlled by Mor. Moreover, drug safety assessment results showed that 500 mg/L of Mor was safe to C. idella, Bacillus subtilis, Chlorella vulgaris and Tetrahymena thermophila, which was far higher than the therapeutic concentration. The present study proved Mor as harmless formulations or products had potential value in the control of GCRV in aquaculture, with the advantage of super in vivo antiviral activity and environmental safety.     

草鱼Stefin克隆表达、纯化及活性特征鉴定

文章克隆了草鱼(Ctenopharyngodon idellus)Stefin c DNA全长序列,全长294 bp,编码97个氨基酸,无二硫键,N端存在高度保守的Gly(3、4)残基及QXVXG(45~49)序列,比对结果显示其氨基酸序列与Burton's mouthbrooder(Haplochromis burtoni)Stefin A1一致性最高,为47.5%。进化树分析表明草鱼Stefin A与Burton's mouthbrooder(Haplochromis burtoni)、southern platyfish(Xiphophorus maculatus)、Colisa chuna(Trichogaster chuna)、lamprologini(Neolamprologus brichard)、elephant shark(Callorhinchus milii)及bicolor damselfish(Stegastes partitus)Stefin A聚为一类。将构建的原核表达载体Stefin-Pet30a转入E.coli BL21,以1 mol·L-1IPTG诱导表达重组Stefin蛋白,而后经梯度尿素洗涤和镍亲和层析纯化,并分别利用SDS-PAGE和TSK-GEL G2000SWxl高效液相色谱检测诱导及纯化效果,SDS-PAGE结果显示重组Stefin蛋白得到高度纯化,最终呈现相对分子量11.4 k D的单一条带;其在高效液相上保留时间25.98 min处亦呈单一活性峰,纯度为96.28%。以荧光合成肽底物(Z-Phe-Arg-MCA)测活法鉴定重组草鱼Stefin对鲤鱼组织蛋白酶B、L的抑制活性,发现该重组蛋白对二者均体现了明显的抑制活性。     

草鱼呼肠孤病毒JX-0902株的分离和鉴定

收集江西南昌地区患典型草鱼出血病的病鱼组织,进行超薄切片电镜观察,结果显示,在脾、肾样品中发现大量病毒颗粒,病毒无囊膜,近球形,直径约70 nm,形态与已报道的草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)相似。取病鱼肌肉、内脏研磨,组织液经离心、过滤除菌后进行鱼体人工感染试验和细胞感染实验,结果发现,人工感染试验鱼出现死亡,且具有典型出血症状;组织滤液感染草鱼肾细胞系(CIK)细胞后,盲传6代未观察到典型细胞病变效应,但感染细胞固定后经超薄切片电镜观察,细胞质内有大量病毒存在,与病鱼组织切片观察到的病毒形态一致。SDS-PAGE结果进一步揭示,新分离病毒株(暂命名JX-0902)基因组由11条dsRNA组成,呈现水生呼肠孤病毒基因组典型特征,但基因组带型与GCRV 873株存在差异,而与HZ08株接近。根据GenBank上已提交的草鱼呼肠孤病毒S6序列(GQ896337)设计特异引物,以JX-0902株的cDNA作为模板,可扩增出特异性条带。基于S6序列的聚类分析结果显示,JX-0902与GCRV HZ08株、GD108株S6同源性高达98%、99%,该分离株应为草鱼呼肠孤病毒。     

草鱼呼肠孤病毒三重PCR检测方法的建立及其应用

针对草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)各类型毒株的保守区域分别设计3对引物,优化反应条件和体系,建立了草鱼呼肠孤病毒三重RT-PCR检测方法,通过PCR扩增分别获得大小约为530 bp、297 bp和196 bp的DNA片段。进一步分析表明,该检测方法具有良好的敏感性、特异性和稳定性,可以检测Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型核酸最低量分别约为260、190与230拷贝的病毒量,且某一类型的引物只能检测到同一类型的GCRV。用建立的多重RT-PCR方法对2008—2011年采集自江西、广东、湖北、浙江、重庆、四川、福建等地的草鱼(Ctenopharyngodonidellus)主养区的86份草鱼出血病样品进行检测和初步流行病学分析。结果表明,Ⅰ型阳性率为9.3%,Ⅱ型阳性率为45.3%,Ⅲ型阳性率为2.3%,Ⅰ型和Ⅱ型混合感染阳性率为5.8%,Ⅱ和Ⅲ型混合感染阳性率为2.3%,其他类型的混合感染未检测到。表明目前主要流行的草鱼呼肠孤病毒为Ⅱ型。本研究建立的GCRV三重PCR检测方法可以特异性的检测各种类型的草鱼呼肠孤病毒,且具有较高的敏感性;利用该方法进行草鱼出血病初步的流行病学分析表明,目前主要流行的草鱼呼肠孤病毒为Ⅱ型,不同毒株类型混合感染的现象也普遍存在。本方法的建立旨在对草鱼出血病的快速诊断和分子流行病学调查提供实用的可操作手段。     

Generation and characterization of aptamers against grass carp reovirus infection for the development of rapid detection assay

Grass carp reovirus (GCRV) causes devastating viral haemorrhagic disease in farmed grass carp (Ctenopharyngon idellus). As novel molecular probes, aptamers have been widely applied in rapid diagnosis and efficient therapies against virus or diseases. In this study, three single‐stranded DNA (ssDNA) aptamers were selected against GCRV‐infected CIK cells via SELEX (systematic evolution of ligands by exponential enrichment technology). Secondary structures predicted by MFOLD indicated that aptamers formed stem‐loop structures, and GVI‐11 had the lowest ΔG value of ?30.84 KJ/mol. Three aptamers could specifically recognize GCRV‐infected CIK cells, with calculated dissociation constants (Kd) of 220.86, 176.63 and 278.66 nM for aptamers GVI‐1, GVI‐7 and GVI‐11, respectively, which indicated that they could serve as specific delivery system for antiviral therapies. The targets of aptamers GVI‐1, GVI‐7 and GVI‐11 on the surface of GCRV‐infected cells could be membrane proteins, which were trypsin‐sensitive. Furthermore, FAM‐labelled aptamer GVI‐7 could be applied to detect GCRV infection in vivo. It is the first time to generate and characterize aptamers against GCRV‐infected cells. These aptamers have great potentials in development of rapid diagnosis technology and antiviral agents against GCRV infection in aquaculture.