弓形虫上海株SAG2基因克隆和序列分析

目的:对弓形虫上海株SAG2基因进行克隆与鉴定。方法:采用PCR方法从弓形虫上海株总DNA中扩增到SAG2基因,与pGEM-T-easy vector连接,并进行DNA测序分析。结果:用DNAStar软件对扩增出的片断与GenBank上的7个虫株相应的序列进行同源性比较,不同宿主和不同区域上的弓形虫SAG2基因序列差异很小。结论:用基因重组技术获得的SAG2抗原,作为候选疫苗和诊断抗原,有着广阔的发展前景。     

小亚璃眼蜱源性牛环形泰勒虫裂殖子表面抗原(Tams1)基因检测及同源性分析

针对牛环形泰勒虫裂殖子表面抗原(Tams1)基因设计特异性引物,对提取的奶牛全血DNA和小亚璃眼蜱组织DNA进行环形泰勒虫病原的PCR扩增,并对PCR产物进行克隆、测序和同源性分析。结果显示,血源性和小亚璃眼蜱蜱源性环形泰勒虫Tams1基因序列大小分别为534bp和546 bp,经NCBI BLAST后发现,血液源性环形泰勒虫与环形泰勒虫印度株同源性为99%,而蜱源性环形泰勒虫与环形泰勒虫意大利株有99%的同源性,表明新疆地区存在环形泰勒虫不同株型的流行。     

新疆部分焉耆马场马梨形虫病病原学检测及序列分析

为了解新疆地区焉耆马场马梨形虫病病原感染情况，促进当地马梨形虫病的综合防控和马产业的健康发展，选取5个焉耆马场作为试验点，随机采集156匹焉耆马全血进行马梨形虫病病原DNA检测，并使用SPSS Statistics 17.0、Megalign与MEGA 11.0软件分析不同采样点、不同年龄、不同性别马匹的感染情况差异，同时进行病原核酸的同源性比较和系统进化树构建。结果显示：156匹焉耆马全血样品中，检出马梨形虫病病原核酸阳性82份，其中马泰勒虫、马驽巴贝斯虫和两者混合感染阳性率分别为33.3%(52/156)、26.9%(42/156)和7.7%(12/156)。不同采样点、不同年龄、不同性别焉耆马的马梨形虫病病原阳性率均无显著差异（P> 0.05）。通过Megalign与MEGA11.0软件分析发现：测序得到的马泰勒虫18S rRNA基因序列与选取的参考虫株同源性为95.5%～100%，马驽巴贝斯虫BC-18S rRNA基因序列与选取的参考虫株同源性为98.6%～99.6%。马泰勒虫18S rRNA基因与马泰勒虫伊犁株（OL589505.1）位于同一分支上，进化关系较近，与其他...     

泡状带绦虫线粒体ND1基因的克隆及序列比对分析

针对带绦虫线粒体DNA的ND1基因设计引物扩增目的基因,使用基因分析软件Larsergene V7.1与GenBank已知带绦虫基因进行比对分析。实验成功扩增泡状带绦虫甘肃地区虫株X2线粒体基因组的ND1基因。分析结果显示,泡状带绦虫ND1基因种间不同虫株的基因同源性均在98.8%~99.5%之间,ND1基因推导的氨基酸序列与其他泡状带绦虫的蛋白同源性均在98.5%~99.2%之间,其中与四川地区的虫株同源性均达到了99.2%。推断泡状带绦虫线粒体DNA的ND1基因相对保守,与Taenia sp. AL-2012、Taenia regis和猪带绦虫差异较明显,最高只有91.3%,可以作为泡状带绦虫的初步鉴别基因。     

一株猪瘟病毒田间株EO蛋白基因的克隆和序列分析的研究

采用RT-PCR技术，扩增猪瘟病毒田间株XN株的EO蛋白基因，构建EO基因的重组质粒，序列分析表明，该病毒EO蛋白DNA序列与国内几株流行株的同源性高达99％，与CSFV-1、CSFV-2群猪瘟病毒的差异较大，该病毒EO蛋白191-227段DNA和氨基酸序列与国内流行株比较同源性相对较高，而与不同基因群CSFV国外流行株比较时同源性相对较低。     

柔嫩艾美耳球虫马杜拉霉素抗药株与敏感株的mRNA差异显示

利用柔嫩艾美耳球虫马杜霉素敏感虫株裂殖子和抗药虫株裂殖子为材料,对马杜霉素敏感虫株和抗药虫株进行差异显示PCR,共回收34条电泳差异片段,反向Northern点杂交鉴定4个片段为真正差异片段,并对4个片段进行测序、B1ast同源性比较.来自于马杜霉素抗药虫株裂殖子的ACD3-2序列与柔嫩艾美耳球虫微线-5同源性99%,说明AcD3-2序列是该基因的部分序列,微线-5蛋白与虫体融解宿主细胞膜、入侵、运动和溢出有关,在第二代裂殖子时期,抗药性虫株该序列发生转录,而在敏感虫株中沉默;HCD1序列来自马杜霉素敏感虫株,与柔嫩艾美耳球虫表面抗原16和17序列同源性分别为83%和86%,说明与这2个基因同源.AGD5片段来自抗药虫株,HAD8-2序列来自敏感虫株,通过比较这2条序列可能为新序列.     

一株寄生于大黄鱼的盾纤毛虫分子鉴定与系统进化分析

在大黄鱼稚鱼上发现一种可侵入患鱼体表、肌肉、腹腔和脑的盾纤毛虫，为了进一步明确该盾纤毛虫的分类地位，提取患鱼样品总DNA，对该虫株SSU rDNA和线粒体cox1部分序列进行PCR扩增、测序，与GenBank中纤毛虫的SSU r DNA和线粒体cox1序列进行同源性分析并构建系统发育树。结果显示，该盾纤毛虫874 bp的SSU rDNA部分序列与显赫针口虫（Porpostoma notata）同源性最高，相似性为98.97%。在基于SSU r DNA构建系统发育树中与显赫针口虫（P.notata）聚为一支，并独立于嗜污科（Philasteridae）的分支；获得该虫1 086 bp的cox1部分序列，与其SSU rDNA序列相比表现出更大的遗传变异度，在基于cox1部分序列构建系统发育树中，该虫株与嗜污科（Philasteridae）、尾丝虫科（Uronematidae）的分支也有一定距离。综上，该盾纤毛虫应是嗜污目（Philasterida）、针口虫属（Porpostoma）的显赫针口虫（P.notata）或其近缘种。     

东北地区部分犊牛感染贾第虫的基因型及基因亚型分析

采用巢式PCR方法鉴定东北部分地区牛源贾第虫的基因型。提取DNA后经巢式PCR扩增TPI基因，扩增产物测序后用BLAST和MEGA4．0软件进行同源性和系统发育分析。结果表明，吉林市和长春分离株属于蓝氏贾第虫的AssemblageE型；大庆分离株中蓝氏贾第虫的AssemblageE和AssemblageA型均存在。     

犬贾第虫病毒(长春株)全基因组序列分析

根据已报道的人源蓝氏贾第虫病毒序列设计了互相重叠的6对特异性引物，以犬贾第虫（长春株）纯培养滋养体总核酸为模板进行RT—PCR。PCR产物连接到pMD18-T载体进行测序，通过BLAST在GenBank进行同源性搜索，并用DNAMAN分子生物学软件进行分析。结果测得我国犬贾第虫病毒（长春株）基因组全长为6276bp（DQ238861），编码1个有887个氨基酸残基的衣壳蛋白和1056个氨基酸残基的融合蛋白，这2个阅读框被-1核糖体移码框分开，重叠处有220nt。基因组中G＋C占49．62％。其序列与国外报道的人源蓝氏贾第虫病毒（L13218）序列同源性为94．62％，编码的氨基酸同源性为93．50％；与国内人源蓝氏贾第虫病毒（AF525216）序列同源性为98．88％，编码的氨基酸同源性为98．30％。     

牛瑟氏泰勒虫P33表面蛋白基因的克隆与序列分析

为分析吉林省流行的牛瑟氏泰勒虫基因序列，根据GenBank上发表的牛瑟氏泰勒虫P33表面蛋白基因序列设计合成一对引物，用PCR方法扩增出牛瑟氏泰勒虫的基因片段，并成功地将该基因纯化后克隆到pGEM-TEasy载体上，将经EcoRⅠ酶切鉴定和PCR鉴定为阳性的重组质粒进行测序。结果表明克隆的基因片段长度为868bp，编码283个氨基酸，有2个潜在的糖基化位点。核苷酸同源性分析表明，该基因片段与韩国株（AF521557）、日本株（AB016280）、俄罗斯株（AB016279）的核苷酸序列同源性分别为99．4％、88.0％、88．1％。     

弓形虫ITS及5.8S序列的PCR扩增、克隆及分析

通过对国内来源于不同宿主的ZS人株、SH人株、CN猪株、QH绵羊株4个弓形虫虫株，以及国际标准强毒株RH株的核糖体DNA内转录间隔区(ITS)及5．8SDNA序列进行PCR扩增、克隆、测序和序列分析，旨在对国内不同宿主间弓形虫虫株的遗传变异情况进行分析和验证。为分子遗传学和分子诊断学研究提供资料。结果显示：QH绵羊株、ZS人株、SH人株、CN猪株的ITS及5．8S序列完全一致。且与GenBank上注册RH株的ITS及5．8S序列也一致；仅实验室传代保存的RH株的ITS2序列与其它4株的ITS2有2个碱基的差异。结果表明ITS可作为分子标记用于弓形虫与其它原虫的种间鉴定。但不适合用于弓形虫种内遗传变异的研究。     

弓形虫棒状蛋白17基因的克隆与序列分析

为研究弓形虫棒状体蛋白17(ROP17)基因的遗传变异,本研究以弓形虫RH株、PRU株和TgC7株为研究对象,首次PCR扩增了其ROP17基因部分序列,将PCR产物纯化后克隆到pMD18-T并测序。将测定的序列与网上下载的弓形虫VEG株、GT1株和ME49株相应序列进行比对,然后用Mega 5.0程序的NJ法和Puzzle 5.2程序的ML法构建系统发育树。结果表明,3株弓形虫分离株的ROP17基因部分序列长度均为1375 bp,A+T含量在49.53%~50.04%之间,3个虫株相应序列的变异碱基数皆小于20个,其变异率为2.3%,氨基酸序列变异率在0~6.11%之间。系统发育结果显示, ROP17基因部分序列能区分弓形虫基因Ⅰ型和Ⅱ型的虫株。本研究结果为进一步研究弓形虫ROP17基因的变异及研制弓形虫ROP17基因的亚单位疫苗提供了理论依据。     

弓形虫GJS株pcDNA3-MIC3核酸疫苗的研究

根据GenBank中MIC3基因序列设计1对引物,采用PCR技术从弓形虫GJS株基因组DNA中扩增微线体蛋白3(MIC3)基因片段,克隆到pMD18-T载体,经PCR、酶切及测序鉴定后,阳性重组质粒酶切并亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)后进行PCR、酶切及测序鉴定.重组质粒pcDNA3-MIC3肌肉注射免疫BALB/c小鼠,通过ELISA检测血清特异抗体;经腹腔攻击感染弓形虫GJS株速殖子,观察小鼠的生存时间.结果成功构建了pcD-NA3-MIC3质粒;免疫组小鼠血清检测到特异性抗体;攻击感染后免疫组小鼠平均存活时间较对照组明显延长.表明该核酸疫苗具有较好的免疫原性,能诱导小鼠产生良好的免疫保护作用.     

Toxoplasma gondii infection in cats from São Paulo state, Brazil: seroprevalence, oocyst shedding, isolation in mice, and biologic and molecular characterization

Cats are the most important hosts in the epidemiology of Toxoplasma gondii infections in humans and animals. Serologic and parasitological prevalence of T. gondii were determined in 237 cats from 15 counties in S?o Paulo state, Brazil. Antibodies to T. gondii were found in a 1:25 dilution of serum of 84 (35.4%) out of 237 cats by the modified agglutination test (MAT). Samples of brain, heart, tongue, and limb muscles (total 50 g) of 71 of the seropositive cats were pooled for each cat, digested in pepsin and bioassayed in mice. Faeces (1 g) from the rectum of each cat were examined microscopically for T. gondii-like oocysts and verified by bioassay in mice; T. gondii oocysts were found in the faeces of three (1.3%) of 237 cats. T. gondii was isolated from tissue homogenates of 47 cats. The DNA obtained from these 47 tissue isolates was characterized using the SAG2 locus: 34 (72.4%) isolates were type I, 12 (25.5%) were type III and one (2.1%) was mixed with types I and III. No type II isolates were detected. Most (23/34) of the type I isolates killed all infected mice and 7 of 12 type III isolates did not kill infected mice. Characterization of the SAG2 locus directly from tissue homogenates from 37 of 46 cats was successful. Genotypes obtained from these primary samples were the same as those from the corresponding isolates obtained in mice. Genotyping of the three oocyst isolates revealed that two were type I and one was type III. Molecular and biologic characteristics of T. gondii isolates from animals from Brazil are different from those from other parts of the world.     

弓形虫MIC3基因真核表达质粒的构建及在 IBRS-2细胞内的表达

采用PCR技术从弓形虫RH株的基因组DNA中扩增编码MIC3的基因,克隆入pMD18-T载体,转化至E.coliDH5α感受态细胞,经抗性平板筛选、小量抽提质粒进行酶切、PCR及DNA测序鉴定后,亚克隆入真核表达载体pcDNA3.1。然后筛选含有目的基因的重组质粒,并转染IBRS-2细胞,在G418压力下进行筛选,利用SDS-PAGE、Western blot和ELISA检测表达情况。结果显示,扩增的MIC3基因与GenBank上相应基因序列(AJ132530)的一致性达99.9%,构建的真核表达质粒pcMIC3能在转染的IBRS-2细胞中表达分子量约为39.2ku的MIC3,且表达的蛋白质具有良好的免疫活性,为进一步研究该质粒的动物免疫试验奠定了基础。     

猪弓形虫特异性PCR诊断方法的建立及应用

以猪弓形虫核糖体DNA第一内转录间隔区(ITS1)序列为模板自行设计引物,建立了猪弓形虫病特异PCR诊断方法,并从弓形虫国际标准强毒株RH速殖子和疑似T.gondii感染猪全血及肺脏组织样品基因组DNA中扩增出了预期长度273bp的目的DNA片段。敏感性和特异性试验结果显示,该PCR方法能检测到的最低DNA量为0.001ng,且与相关的9种对照寄生虫、细菌和病毒无交叉反应。用建立的PCR诊断方法对临床30份猪弓形虫疑似病料和60份健康猪抗凝全血样品进行检测,结果30份病料中有24份呈现阳性;60份健康猪血中有5份为阳性;随机取两个临床样品的阳性PCR扩增片段进行克隆测序表明,二者序列与Gen-Bank中已登录的猪弓形虫ITS1基因相应部分序列完全相同。以上表明所建立的PCR方法具有高度的敏感性和特异性;本研究为猪弓形虫病的快速诊断提供了一种新方法。     

Characterization of Mycoplasma hyosynoviae strains by amplified fragment length polymorphism analysis,pulsed-field gel electrophoresis and 16S ribosomal DNA sequencing

Mycoplasma hyospnoviae strains from Denmark, Germany, Japan, Sweden, the Netherlands and the UK were examined for variations in the genomic DNA and within the 16S ribosomal RNA (rRNA) gene. Variations in the chromosomal DNA among 57 isolates recovered from the respiratory tract and joints of pigs, were investigated by analysis of amplified fragment length polymorphisms of the Bg/II and MfeI restriction sites and by pulsed-field gel electrophoresis of a BssHII digest of chromosomal DNA. Both methods allowed unambiguous differentiation of the analysed strains and showed similar discriminatory potential for the differentiation of M. hyosynoviae isolates. Concordant results obtained with the two whole-genome fingerprinting techniques evidence the considerable intraspecies genetic heterogeneity of M. hyosynoviae. Sixteen field strains of M. hyosynoviae and the type strain S16(T) were further examined for variation within the 16S rRNA gene. Ten field strains possessed the 16S rDNA sequences identical to the type strain, while the remaining six strains had sequences that differed by one to two nucleotides from that obtained from the type strain.     

伊氏锥虫、马媾疫锥虫、布氏锥虫、刚果锥虫的18S rDNA部分序列测定与系统发育关系

对伊氏锥虫（Trypanosoma evansi）：新疆株（XJCA）、湖北株（HBM）、云南株（YNB）、广东株（GDB2）；马媾疫锥虫（Trypanosoma equiperdum）、布氏锥虫（Trypanosoma brucei）、刚果锥虫（Trypanosoma congolense）提取基因组DNA，根据已报道的伊氏锥虫株18SrDNA基因序列设计合成引物，用PCR扩增了锥虫虫株基因组DNA,伊氏锥虫新疆株、湖北株、云南株、广东株、布氏锥虫、刚果锥虫均为373bp的片段；马媾疫锥虫为372bp的片段，PCR产物经电泳鉴定后用试剂盒回收纯化，纯化后PCR产物经连接、转化后测序，将测得的序列用DNAMAN软件分析并与国外已发表的相应序列进行了同源性比较，并绘制了系统发育进化树。结果与国外AJ009153、AJ223564、D89527株同源性达到99％～100％，与另外11株同源性75％。本研究为锥虫分子流行病学研究及分类研究打下基础。     

鸡艾美耳球虫18SrDNA序列与系统进化分析

为了确定鸡艾美耳球虫（Eimeria）不同种以及来自不同地区同种不同株之间的亲缘关系,研究其分类地位,对实验室保藏的柔嫩艾美耳球虫（Etenella）、毒害艾美耳球虫（Eneeatrix）、巨型艾美耳球虫（Emaxima）、堆形艾美耳球虫（Eaaervulina）等4种15株鸡球虫孢子化卵囊的18SrDNA基因进行克隆、测序,并与从GenBank下载的鸡球虫18SrDNA序列一起,使用软件DNAstar 5．0 MegAlign进行系统发育分析。结果显示,4种艾美耳球虫种间同源性在94．6％～99．4％之间,7株柔嫩艾美耳球虫的株间同源性在99．0％-99．9％之间,5株巨型艾美耳球虫的株间同源性在96．9％～99．8％之间。用该4种鸡球虫的18SrDNA序列与GenBank下载的另外4种鸡球虫18SrDNA序列构建系统发育树,显示这8种鸡艾美耳球虫形成2个分支,即堆形艾美耳球虫（EASH）、巨型艾美耳球虫（EMSH）、变位艾美耳球虫（Emivati）、和缓艾美耳球虫（Emitis）、布氏艾美耳球虫（Ebrunetti）、早熟艾美耳球虫（Epraecox）构成1个分支,柔嫩艾美耳球虫（ENSH）、毒害艾美耳球虫（ETAS）构成另1分支。巨型艾美耳球虫、柔嫩艾美耳球虫各株的系统发育树均根据地域关系产生2个分支。柔嫩艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫的亲缘关系较近,不同地理区域的同种不同株的亲缘关系相对较远,种间和种内的鉴定结果与普通生物学结果一致。本研究提示18SrDNA基因可用于鸡球虫不同种／株的分类鉴定,为艾美耳球虫分子遗传学鉴定提供了理论基础。     

弓形虫ROP18基因重组蜥蜴利什曼原虫的构建及鉴定

用PCR方法从弓形虫RH株全基因组中扩增ROP18基因,将其克隆至pMD18-T载体,经测序分析后,构建真核表达穿梭质粒pLEXSY-neo2-ROP18;利用电转染技术将外源基因表达盒转入蜥蜴利什曼原虫,G418筛选阳性克隆;阳性克隆分离培养后提取基因组,用ROP18特异性引物及同源重组鉴定引物进行重组利什曼原虫PCR鉴定,结果阳性虫体中扩增出特异性目的条带;应用鼠抗弓形虫多抗血清以Western blot印记法从蛋白水平进行重组蛋白检测,证明目的蛋白在蜥蜴利什曼原虫中得到表达。