杜梨类钙调磷酸酶B亚基蛋白基因PbCBL2的克隆和功能初探

 类钙调磷酸酶B亚基蛋白（Calcineurin B-like protein,CBLs）是植物中一类重要的钙离子传感器,参与调控植物生长发育及逆境胁迫响应过程。为了探明杜梨CBLs家族成员PbCBL2的序列特征和表达模式,以杜梨（Pyrus betulaefolia Bunge）幼苗为试材,运用EST搜索结合RACE技术、染色体步移法对PbCBL2的cDNA、DNA和启动子进行克隆,采用半定量RT-PCR和原核表达研究该基因在非生物胁迫下的表达模式。结果表明,PbCBL2基因cDNA序列长681 bp,编码一个含有226个氨基酸残基的蛋白。基因组DNA序列长1 927 bp,包括8个外显子和7个内含子,启动子序列包含光反应元件、厌氧诱导必需顺式作用元件、赤霉素反应元件和水杨酸响应顺式作用元件。PbCBL2编码的多肽具有植物类钙调磷酸酶B亚基蛋白结合Ca²⁺所必需的4个EF手型结构和1个典型的植物钙调磷酸酶A亚基结合位点。未经处理的杜梨幼苗（对照）根和叶中未检测到PbCBL2的表达,PbCBL2的表达受NaCl、PEG6000、甘露醇和ABA诱导上调。PbCBL2转入大肠杆菌BL21（DE3）后,能够明显减轻NaCl、甘露醇和PEG6000对该菌株的生长抑制。PbCBL2基因具备植物CBLs基因家族的固有特征,对盐碱、干旱、渗透胁迫和ABA处理均存在转录响应,大肠杆菌转入该基因后能够提高对盐胁迫和渗透胁迫的耐受能力。     

杜梨PbNHX1基因的克隆、表达分析及功能验证

【目的】克隆1个杜梨Na~+/H~+逆向转运蛋白基因PbNHX1,并对其序列特征、表达特点及功能进行研究。【方法】采用RT-PCR和PCR克隆PbNHX1的c DNA和DNA序列,利用生物信息学方法进行序列分析,定量PCR检测其在非生物胁迫下转录水平变化,酵母互补试验检测PbNHX1基因的离子转运能力。【结果】杜梨PbNHX1基因c DNA编码区长1 704 bp,对应基因组DNA序列长3 594 bp,由13个外显子和12个内含子组成,编码蛋白含567个氨基酸。系统进化树显示,PbNHX1位于液泡膜型Na~+/H~+逆向转运蛋白分支上,与杨树液泡膜型Na~+/H~+逆向转运蛋白Pt NHX1.3基因亲缘关系较近。正常生长条件下,PbNHX1在杜梨叶片中表达量高于根。施加200 mmol·L-1Na Cl、10%(φ)PEG6000或100μmol·L-1ABA后,PbNHX1在叶片中的转录水平持续上升;其在根中的表达量先升后降,表达高峰依次出现在处理后6、3和6 h。PbNHX1的转入可恢复Na Cl、KCl和潮霉素B对nhx1缺失酵母菌株AXT3的生长抑制,转基因酵母细胞中Na~+和K~+含量显著增加。【结论】PbNHX1具有植物NHXs基因家族的固有特征,对盐碱、渗透胁迫和ABA处理均存在转录响应,转入该基因能够提高酵母nhx1缺失突变体AXT3对盐胁迫的耐受能力,部分恢复其对阳离子的转运功能,从而促进Na~+、K~+积累。     

葡萄类钙调磷酸酶B亚基蛋白基因VvCBL4的克隆与表达分析

【目的】在京秀(Vitis vinifera‘Jingxiu’)葡萄中克隆类钙调磷酸酶B亚基蛋白基因Vv CBL4及其启动子,分析Vv CBL4的表达特性与逆境胁迫的关系。【方法】用RACE技术克隆Vv CBL4的全长,实时荧光定量PCR检测Vv CBL4在不同逆境下的表达;用同源克隆技术获得Vv CBL4的启动子,在烟草叶片中瞬时表达分析Vv CBL4启动子的活性。【结果】Vv CBL4全长为959 bp,ORF为642 bp,编码213个氨基酸,具有3个EF手钙结合结构域。Vv CBL4在根部表达量最高,其次是果实。Vv CBL4的转录本能对干旱、低温和盐胁迫处理快速做出响应。Vv CBL4启动子富含与逆境响应相关的顺式作用元件。干旱、低温和盐胁迫处理能够增强启动子活性。【结论】获得Vv CBL4及其启动子序列,Vv CBL4的表达能对逆境胁迫做出响应,Vv CBL4启动子的活性受逆境胁迫诱导,说明Vv CBL4在葡萄逆境胁迫反应中具有重要的作用。     

湖北海棠植物络合素合酶MhPCS基因克隆及表达分析

【目的】为了探明植物络合素酶参与植物解毒重金属的作用,【方法】以湖北海棠(Malus hupehensis)为试材,克隆其植物络合素合酶基因(MhPCS)编码区序列,并研究该基因的表达特点。【结果】结果表明MhPCS基因编码区全长为1 494 bp,编码497个氨基酸。序列分析表明,MhPCS编码的氨基酸序列由2个典型的植物络合素合酶亚家族结构域组成,具有3个相邻的Cys-Cys元件(331-332、351-352和369-370位氨基酸)和植物络合素合酶蛋白的特征位点(Cys-56、Cys-90/91和Cys-109)。【结论】湖北海棠MhPCS与杜梨PbPCS蛋白同源性最高(94%),属于系统发生树的同一分支。MhPCS基因为组成型表达,各器官表达水平存在差异,其中根的表达量最高;100μmol.L-1CdSO4处理48 h内,MhPCS基因的表达量迅速上升;不同金属离子对其上调表达的诱导能力为:Cd2+>Cu2+>Pb2+。这为揭示重金属胁迫下湖北海棠环境适应的分子机制奠定了基础。     

扁桃AcCBF1转录因子的克隆及表达分析

【目的】分离和克隆新疆栽培扁桃CBF1转录因子基因,了解其在扁桃响应环境胁迫和逆境相关激素诱导的表达情况。【方法】以新疆扁桃幼苗为试验材料,对其进行低温、干旱、盐及ABA处理,使用PCR技术从新疆扁桃‘双果’克隆得到CBF1转录因子基因,通过农杆菌将35S-Ac CBF1-GFP融合质粒转化洋葱表皮细胞后在激光共聚焦显微镜下观察结果,并通过实时荧光定量PCR技术分析了SG-Ac CBF1转录因子基因在不同非生物逆境胁迫下的表达情况。【结果】序列分析表明,该基因编码框为729 bp,编码242个氨基酸,蛋白质分子量为27.405 ku,命名为SG-Ac CBF1,GenBank登录号为KM245571。氨基酸序列同源比对分析证实,SG-Ac CBF1属于CBF转录因子家族基因。系统发育树分析表明,SG-Ac CBF1与甜樱桃Pa DREB1的亲缘关系最近。亚细胞定位分析显示,SG-Ac CBF1蛋白定位于细胞核中。实时荧光定量PCR分析结果表明,低温、干旱、盐及ABA均能诱导SG-Ac CBF1基因表达。【结论】SG-Ac CBF1转录因子具有核定位功能,并参与了植物对逆境胁迫的调控。由于该转录因子属于家族基因,因此其对环境胁迫响应的强弱还有待探讨。     

山葡萄VaCBL6参与非生物胁迫和ABA途径的响应

对山葡萄(Vitisamurensis)‘左山–1’中的1个类钙调素磷酸酶B亚基蛋白基因VaCBL6进行克隆及功能分析。VaCBL6位于第4条染色体,开放阅读框为777 bp,编码258个氨基酸;结构域分析表明,该蛋白包含4个EF-hand与1个跨膜结构域;蛋白进化树分析表明,VaCBL6与欧洲葡萄VvCBL9和VvCBL6相似性较高,分别为98.84%、94.96%。VaCBL6编码蛋白定位于细胞核与细胞膜。VaCBL6在根与卷须中有较高的表达,且其表达受低温、干旱、NaCl和ABA的诱导。基于酵母体系的转录激活分析表明,VaCBL6无转录激活活性。100～125μmol·L~(-1) NaCl和0.25～1.25μmol·L~(-1) ABA处理均抑制了VaCBL6转基因拟南芥种子的萌发,且转化拟南芥幼苗对NaCl与ABA的敏感性提高。以上结果说明VaCBL6在植物的逆境胁迫应答中具有重要作用。     

菠萝锌指蛋白基因AcRCHY1的克隆与表达分析

 根据植物C3HC4型兼CHY型锌指蛋白的功能保守区设计简并引物, 通过RT2PCR结合RACE 方法从菠萝(Ananas comosus L. Merr) 幼苗中克隆获得了一个新的菠萝锌指蛋白基因cDNA全长, 将其命名为AcRCHY1。该基因cDNA全长1 261 bp, 开放阅读框ORF为918 bp, 推测其编码一个含有306个氨基酸残基的多肽。AcRCHY1蛋白具有保守的C3HC4 (RING finger) 和CHY两个锌指结构域, 与其它植物锌指蛋白的同源性高达81%～91%。半定量RT-PCR分析表明, AcRCHY1 在菠萝中呈组成性表达, 在子房、花瓣和小花中的表达量明显高于根和叶; 低温、高盐、干旱和ABA等非生物胁迫处理后, AcRCHY1在叶片中的表达明显增强。因此, AcRCHY1蛋白可能与花器官生长发育的调控有关, 而且可能作为一个转录调控因子在菠萝响应低温、高盐和渗透胁迫过程中参与了依赖ABA的信号转导途径。     

黑莓RuMYB10基因的克隆和表达

【目的】从黑莓中克隆RuMYB10的编码区全长序列,并分析其在黑莓果实发育过程中的表达情况与果实花青素苷积累的关系。【方法】以黑莓基因组DNA为模板,通过同源克隆和SON-PCR技术获得了RuMYB10基因全长编码序列(Accession No.:JQ359611);并以黑莓果实mRNA为模板进行验证。采用实时定量PCR技术检测该基因在果实不同发育阶段的表达水平。【结果】结果表明,该基因编码区全长共1 837 bp,编码216个氨基酸,推导蛋白分子质量为24 863 Da。具有MYB转录因子家族特有的R2R3保守序列。含有两个内含子,第2个内含子长度为750 bp,占全长40.8%;在R3重复单元中存在与bHLH因子互作的‘[DE]Lx2[RK]x3Lx6Lx3R’序列;而促进花青素苷合成的MYB转录因子3个特征氨基酸残基中的丙氨酸(A)被丝氨酸(S)取代。RuMYB10基因在黑莓果实发育后期,即果实变红到最后变黑的过程中大量表达,与花青素苷的积累相一致。【结论】从黑莓中克隆到包含完整ORF的转录因子基因RuMYB10,具有MYB因子家族结构特征和bHLH因子结合域,且在果实花青素苷积累高峰期表达量最高。     

中华猕猴桃fasciclin基因家族生物信息学分析及克隆

【目的】探讨fasciclin基因在中华猕猴桃中的生物信息。【方法】对中华猕猴桃雌株38个fasciclin基因进行生物信息学分析和克隆其中一个与性别相关的fasciclin基因。【结果】38个fasciclin基因编码133～606个氨基酸。丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸磷酸化位点范围分别为10～56个、2～26个、0～8个。38个fasciclin基因拥有1～9个motif结构(取值10),其中Motif3为共同具有。68.42%fasciclin蛋白为不稳定疏水性蛋白。2 000 bp启动子区共预测到TFs 110个,较多的TFs依次为BBR-BPC、TALE和AP2,9个基因没有预测到TFs结合位点。UPGMA聚类法把38个fasciclin蛋白分成2类。基因克隆序列(723 bp)具有fasciclin保守结构域,该序列只比对到8号染色体上。【结论】fasciclin基因保守性不强;克隆序列与中华猕猴桃雌雄性状显著关联,但与美味猕猴桃雌雄无关联;雌株中的同源区没有注释到基因。     

杜梨2个MYB转录因子基因的克隆及序列分析

【目的】克隆杜梨(Pyrus betulifolia Bunge)MYB家族的2个基因(Pb3RMYB和Pb4RMYB),分析其序列特征,为研究其调控的分子机制奠定基础。【方法】利用RT-PCR和RACE技术克隆杜梨Pb3RMYB和Pb4RMYB的c DNA序列全长;利用BLAST和ORF Finder对核酸序列进行分析,利用CDD、Prot Param、TMHMM、Signal P、Plant-m Ploc、SPOMA、DANMAN、MEGA6等软件对氨基酸序列进行分析。【结果】克隆得到Pb3RMYB和Pb4RMYB基因全长,Gen Bank登录号分别为KX272614和KX272615。2者均含有MYB保守结构域,二级结构均以无规则卷曲、α-螺旋、延伸链和β-折叠为主,亚细胞定位分析表明2者均定位于细胞核中。其中,Pb3RMYB属于3R-MYB亚家族,全长2 355 bp,ORF长1 710bp,编码569个氨基酸,蛋白分子质量约为62 077.3 Da,等电点为7.08;BLAST分析表明Pb3RMYB与已报道的其他物种3RMYB具有较高的相似度。Pb4RMYB属于4R-MYB亚家族,全长3 625 bp,ORF长2 913 bp,编码970个氨基酸,蛋白分子质量约为109 600.6 Da,等电点为7.41。【结论】获得了2个杜梨MYB基因Pb3RMYB和Pb4RMYB,分别属于3RMYB和4R-MYB亚家族。     

枇杷AS-PCR反应体系的建立和优化

【目的】建立和优化枇杷AS-PCR反应体系,为开展枇杷S基因快速鉴定奠定基础。【方法】以‘大五星’、‘早钟6号’和‘龙泉5号’为试材,通过正交实验设计对影响枇杷AS-PCR反应较大的Mg2+等5个因素的浓度进行筛选,并对扩增反应程序进行优化,运用正交设计直观分析法和DPS 7.05统计软件对扩增结果进行方差分析。【结果】优化后的枇杷AS-PCR反应分析体系为:25μL反应体系中,含10×buffer2.5μL,Mg2+浓度2.0 mmol·L-1,Taq酶1.5 U,引物0.5μmol·L-1,模板DNA80ng,dNTPs0.4 mmol·L-1。反应程序为94℃预变性1 min;94℃变性30 s,退火温度30 s,72℃延伸1 min,35次循环;72℃延伸5 min,4℃保存。【结论】建立了基于S基因保守序列设计引物的枇杷AS-PCR反应体系,利用该体系成功确定了‘大五星’的S基因型为S2-S41,其中S41为新分离鉴定的枇杷S-RNase基因,它们在GenBank上的登录号分别为JQ228451和JX217035。     

豆梨植物络合素合酶PcPCS1基因克隆及其表达分析

以梨砧木豆梨（Pyrus calleryana Dcne.）为试材,克隆其植物络合素合酶基因（PcPCS1）的cDNA全长序列,并研究该基因的表达特点。结果表明PcPCS1 cDNA 序列长度为1 970 bp,编码497个氨基酸,推导的氨基酸序列由两个典型的植物络合素亚家族结构域组成,具有3个相邻的Cys-Cys元件（331-332、351-352和369-370位氨基酸）和植物络合素合酶蛋白的特征位点（Cys-56、Cys-90/91和Cys-109）。它与豆科植物的PCS1蛋白处于系统发生树的同一分支,且与百脉根LjPCS1蛋白的同源性最高（84%）。荧光定量RT-PCR分析结果显示：PcPCS1基因为组成型表达,各器官表达量存在差异,在20 mmol · L-1 CdSO4胁迫条件下,其表达量迅速上升,并且在豆梨叶中的表达量高于根;不同重金属离子对其上调表达的诱导能力为Cd2+ > Zn2+ > Cu2+。200 mmol · L-1 γ–谷氨酰半胱氨酸合成酶抑制剂丁胱亚磺酰亚胺能够显著抑制该基因的表达,补充200 mmol · L-1谷胱甘肽后,其相对表达量恢复或超过单一重金属离子处理的表达水平,即豆梨植物络合素以谷胱甘肽为底物,通过γ–谷氨酰半胱氨酸合成酶途经合成。     

苹果铁结合蛋白基因的克隆及表达特性

 根据已报道的植物铁结合蛋白基因( ferritin) 的保守区域设计引物, 用RT2PCR 的方法从‘嘎拉’苹果叶片中获得铁结合蛋白基因的全长序列。该基因cDNA共有1 043个碱基, 其中编码区834bp, 编码277个氨基酸残基的蛋白质, 终止密码子后有209 bp左右的3’端尾随序列区。Southern杂交结果显示ferritin基因在‘嘎拉’苹果基因组中至少有7个拷贝存在。0.5 mmol·L ^{- 1}的柠檬酸铁处理‘嘎拉’苹果试管苗不同时间后的定量RT-PCR分析表明, ‘嘎拉’苹果的铁结合蛋白基因随着诱导时间的延长表达量增加, 说明该基因可能在转录水平上受铁诱导表达。     

白菜亚硝酸还原酶基因BcNiR的克隆及表达分析

 以白菜品种‘苏州青’自交系叶片cDNA为模板, 采用RT-PCR、3′RACE和5′RACE技术, 获得了编码亚硝酸还原酶基因(NiR) 的cDNA全序列1 852 bp, 包含有1 749 bp的开放阅读框, 编码583个氨基酸, 命名为BcNiR。所推导的氨基酸序列与拟南芥NiR1、烟草nii2编码的氨基酸序列具有较高同源性, 分别为83%和76%。生物信息学分析表明, BcNiR具有完整的NiR蛋白结构, 含血红素蛋白β - 化合物区域, 一个明显的西罗血红素siroheme结合位点和4Fe-4S区域, 可以在SWiSS-MODEL数据库中搜索到与之相近的三维结构。RT-PCR结果显示, 该基因在叶片中的表达量远远高于根系, 在以0、10、20、30、40 mmol·L ^{- 1}硝态氮各分别处理0、2、4、6、8、12 h的试验中, 30 mmol·L ^-1处理4 h可使BcNiR的表达量达到最大; 5和10 mmol·L ^{- 1}铵态氮处理试验表明, 高浓度的铵抑制该基因的表达。     

根癌农杆菌介导的CG1-400-RNase基因转化创制锦橙转基因再生植株

【目的】为了快速有效地利用基因工程的方法获得柑橘无核新种质,【方法】以我国特色多核柑橘优良品种锦橙实生苗上胚轴切段为外植体,采用根癌农杆菌介导法进行能导致种子败育基因CG1-400-RNase的转化;为快速有效地筛选出转化子,在实生苗上胚轴切段转化再生过程中,根据不同发育阶段的组织或器官对抗生素的敏感程度不同采用不同的选择压。【结果】结果表明,在抗性芽再生过程中卡那霉素质量浓度设定为50 mg.L-1,获得的362个抗性芽转入卡那霉素质量浓度为100 mg.L-1的伸长培养基中进行伸长培养后,进行早期PCR检测,获得28个阳性芽;经过不定芽诱导生根或试管嫁接,获得22株完整植株。【结论】再生植株经PCR和Southern杂交检测,获得2株目的基因以单拷贝的形式插入锦橙基因组的转基因植株,为最终获得具有无核性状且可稳定遗传的柑橘新种质奠定了基础。     

中国野生葡萄病原菌诱导响应VqSAP基因的克隆及表达分析

【目的】为了验证SAP基因在葡萄抗病防御机制中的作用,【方法】在前期通过抑制消减杂交技术(SSH)获得中国野生葡萄毛葡萄株系‘商-24’衰老相关蛋白(SAP)基因EST序列的基础上,采用RT-PCR从毛葡萄‘商-24’中分离到SAP基因cDNA序列,并通过实时定量PCR和半定量PCR分析了SAP基因的表达特异性。【结果】序列分析表明该基因具有完整的的开放阅读框,序列长度为819 bp,编码272个氨基酸残基,相对分子质量为30.56 ku,等电点为8.78,将其命名为VqSAP。多重比较结果显示VqSAP基因与油棕、玉米、萱草、拟南芥、水稻等植物SAP基因的同源性为65%~74%。实时定量结果表明,在白粉菌诱导初期,抗病的毛葡萄株系‘商-24’和感病的华东葡萄株系‘湖南-1’VqSAP基因表达量均升高,这可能是因为它参与了病原菌诱导的细胞程序性死亡过程。水杨酸(SA)、茉莉酸甲酯(MeJA)、乙烯(Eth)处理表明衰老相关蛋白基因表达受激素分子调节,但在抗病和感病株系中基因的表达量有所差异。在嫩叶、嫩茎、花、果皮、卷须等不同葡萄组织中的表达表明VqSAP基因的表达具有空间差异性。【结论】这些结果暗示着VqSAP的表达响应病原菌侵染并受生物胁迫相关激素的调控,很有可能在葡萄防御病原菌侵染的机制中发挥重要作用。     

油菜素内酯和脱落酸调控葡萄果实花色苷合成的研究

【目的】为研究2,4-表油菜素内酯(2,4-epibrassinolide,EBR)和脱落酸(abscisic acid,ABA)处理对葡萄花色苷合成与可溶性固形物含量、果皮苯丙氨酸解氨酶(PAL)和类黄酮糖基转移酶(UFGT)活性以及果实内源ABA含量的影响,探索油菜素内酯调控葡萄果实成熟及花色苷合成的机理。【方法】以酿酒葡萄‘赤霞珠’(Cabernet Sauvignon)和‘烟73’(Yan 73)为试材,在葡萄转色前分别用0.1、0.4、0.8 mg.L-1EBR,1mg.L-1Brz(brassinazole,BR生物合成抑制剂)和200 mg.L-1ABA,均匀喷施于葡萄果实,在葡萄成熟过程中测定葡萄果皮花色苷含量及PAL和UFGT酶活性,同时测定果实ABA和可溶性固形物含量。【结果】在果实着色初期,‘赤霞珠’和‘烟73’葡萄果皮PAL和UFGT活性及果实内源ABA含量均逐渐升高,当果实接近成熟花色苷含量基本稳定时ABA含量开始降低。与对照相比,0.4mg.L-1EBR和200 mg.L-1ABA处理显著增加了果实内源ABA含量,提高了果皮PAL和UFGT活性,促进了果皮花色苷的合成和果实可溶性固形物的积累。0.1 mg.L-1和0.8 mg.L-1EBR处理总体增加了果实内源ABA含量,促进了花色苷的合成和可溶性固形物的积累,并提高了UFGT和PAL酶活性,但比0.4 mg.L-1EBR处理提高的幅度小,且差异显著。1 mg.L-1Brz处理使果实ABA的合成推迟,果实可溶性固形物含量、果皮PAL和UFGT活性以及花色苷含量均低于对照,但差异不显著。【结论】外源EBR和ABA处理促进了葡萄成熟和花色苷合成,在不同浓度EBR处理中,以0.4 mg.L-1处理效果较好;内源ABA可能参与了EBR对葡萄成熟和花色苷合成的调控。