半定量RT-PCR法检测原代培养脂肪细胞生脂基因mRNA转录表达

在原代培养脂肪细胞生脂机制研究中,为了检测生脂基因ACCl和FAS mRNA表达水平变化,细胞总RNA经反转录合成cDNA,以β-actin为内参照,分别与ACCl和FAS等基因同管扩增.通过探讨和优化PCR体系中引物设计、退火温度、MgCl2浓度和循环次数等参数,以及引物对间的扩增竞争,建立了检测脂肪细胞生脂相关基因mRNA表达的半定量多重RT-PCR体系.结果显示,RT-PCR产物经电泳后,β-actin及生脂基因电泳带清晰,与预期产物大小一致,引物对间无扩增竞争,其扩增效率和特异性与单重RT-PCR体系相同,实验重复性好.因此,该方法和体系可用于快速、灵敏、可靠地检测特异基因mRNA的表达.     

抑肌素基因mRNA在猪肌肉组织表达差异的研究

抑肌素基因(Myostatin，MSTN)是肌肉生长抑制素基因的简称，又称GDF-8(Growth and Differential Factor-8)基因，具有抑制骨骼肌生长的作用，是骨骼肌生长的负调控因子。该基因在动物分子水平定向育种、提高产肉性能上具有极大的应用前景。研究发现，在牛和绵羊的心肌、猪的乳腺及鱼类的多种组织中均发现有其表达。在调节脂肪积累、参与骨折愈合、调节排卵、心脏发育及心肌的组织修复、以及乳腺的发生和泌乳等过程中可能也具有重要作用。     

绵羊β3肾上腺素能受体基因在脂肪组织中的表达研究

旨在对绵羊β3肾上腺素能受体基因在脂肪组织中的表达进行研究。本研究通过real-time PCR和免疫组化的方法检测了2个绵羊群体皮下脂肪、大网膜、小网膜、腹膜后脂肪、肠系膜和肾周等6种脂肪组织中ADRB3基因mRNA及其蛋白的表达量与分布情况。结果表明:ADRB3蛋白位于脂肪细胞的细胞膜中。ADRB3基因mRNA及其蛋白在皮下脂肪组织的表达丰度最小(0.159和0.139),在腹膜后脂肪组织的表达丰度最大(2.911和2.225),深层脂肪组织中ADRB3基因mRNA表达量要显著高于皮下脂肪组织(P<0.05),表明皮下脂肪组织的脂肪分解率要低于深层脂肪组织。品种对ADRB3基因mRNA的表达没有显著影响,但对于ADRB3蛋白的表达影响显著。不同脂肪组织中ADRB3表达丰度的差异反映了山西肉用绵羊的遗传稳定性较差。本研究的结果与已知的ADRB3调节脂肪分解和产热的功能是一致的,为利用ADRB3基因作为候选基因进行绵羊新品种的培育提供理论依据。     

滩羊尾脂组织候选基因mRNA表达量分析研究

为进一步筛选与滩羊脂肪沉积相关的候选基因,对利用基因芯片扫描和选择信号检测得到的滩羊尾脂组织中与脂肪合成代谢相关的6个重要候选基因（PDGFD、CAVI、PPARG、HSL、PLA2G16、RETN）进行mRNA表达量研究。结果表明,6个基因在滩羊尾脂中均有表达,其中,HSL基因的mRNA表达量显著高于其他基因（P〈0．05）。研究结果为滩羊尾型选育及品种改良提供了参考。     

UCP3基因在巴马猪和藏猪脂肪组织中的表达和甲基化分析

为探究解偶联蛋白3（uncoupling protein 3,UCP3）基因在巴马猪和藏猪皮下脂肪组织中的表达和甲基化水平,试验采用实时荧光定量PCR技术检测UCP3基因在巴马猪和藏猪皮下脂肪组织中的mRNA表达水平;针对猪UCP3基因启动子区域（-3 580~+920 bp）,利用在线软件MethPrimer对该区域进行CpG岛预测,并采用亚硫酸氢盐测序法（bisulfite sequencing PCR,BSP）检测其甲基化水平,探究UCP3基因甲基化水平在巴马猪和藏猪中的差异。结果显示,巴马猪皮下脂肪组织UCP3基因表达量显著高于藏猪（P<0.05）;在UCP3基因启动子区预测到3个CpG甲基化岛,分别是CpG island1（-3 171~-2 928 bp）、CpG island2（-154~-2 bp）和CpG island3（+648~+806 bp）,其中CpG island1和CpG island3的甲基化水平在巴马猪和藏猪中差异较小,而藏猪CpG island2的甲基化水平（42.61%）高于巴马猪（24.49%）。本研究绘制了2个猪种CpG island2甲基化水平的黑白点图,其中CpG位点为4、8、9、10、11、12、15,藏猪甲基化频率分别比巴马猪高28.26%、17.39%、26.09%、26.09%、26.09%、23.91%和34.78%。在CpG island2处预测到3个转录因子结合位点（SP2、PPARγ和EGR1）。结果表明,巴马猪和藏猪皮下脂肪组织中UCP3基因mRNA水平的表达差异可能是由于CpG island2的甲基化水平不同所导致,藏猪DNA甲基化水平在一定程度上阻碍了转录因子与启动子调控区域的结合,从而抑制了UCP3基因的表达。     

冷应激条件下猪脂肪组织中脂联素及其受体 mRNA水平的表达变化

为了研究冷应激对脂肪代谢的影响,本试验分别在-15~-10 ℃、-10~-5 ℃、-5~0 ℃、15~18 ℃温度条件下采取猪颈部、背部皮下和内脏系膜脂肪组织,通过荧光定量RT-PCR方法检测脂联素及其受体mRNA的表达水平。结果显示,随着冷应激强度的逐渐加大,在颈部、背部皮下、内脏系膜Adiponectin mRNA的表达量逐渐降低,差异显著(P＜0.05);内脏系膜中AdipoR 1和AdipoR 2 mRNA表达量先逐渐升高后恢复正常,且差异极显著(P＜0.01);背部皮下AdipoR 2 mRNA表达量先逐渐降低后恢复正常,差异极显著(P＜0.01),AdipoR 1 mRNA表达量没有明显变化;颈部皮下AdipoR 2 mRNA的表达量先逐渐升高后恢复正常,差异极显著(P＜0.01),AdipoR 1 mRNA的表达量先升高后恢复正常,而后又升高,差异极显著(P＜0.01)。结果表明,脂联素及其受体参与冷应激过程,它们可能与冷应激条件下脂肪组织的重新分布有重要的关系。     

猪甘油三酯水解酶和激素敏感脂酶基因表达规律的研究

利用半定量RT-PCR法分析比较了甘油三酯水解酶(Triacylglycerol hydrolase,TGH)和激素敏感脂酶(Hormone-sensitive lipase,HSL)基因在不同猪种、不同发育阶段及不同部位脂肪组织中转录表达的差异,探讨其在猪脂肪组织的表达规律。结果显示,脂肪型个体TGHmRNA表达丰度显著低于瘦肉型和杂交型个体,成年猪较初生仔猪低,皮下、腹膜和内脏脂肪组织中TGH表达量依次递增;其变化规律与HSL相同。此外,对分离培养的原代前体脂肪细胞通过诱导分化和油红O染色区分分化状态,分析TGHmRNA表达的时序变化,发现TGH在前脂肪细胞中不转录表达,诱导分化后开始表达,且在诱导分化第4天表达量最高,分化第10天表达量下降,达到峰值的时间较HSL早。结果表明,TGH的表达与个体肥胖程度、年龄、脂肪组织部位以及脂肪细胞分化程度相关,同时,在脂肪细胞分化过程中,TGH表达峰值早于HSL,提示TGH在脂肪细胞发育过程中可能较早承担基础脂解作用。     

脂肪酸合成酶基因mRNA在马身猪和大白猪3种组织中的发育性表达研究

为探究脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,FAS)基因在猪不同组织中的发育性表达规律,本研究采用实时荧光定量PCR技术检测马身猪和大白猪7个阶段(初生、30、60、90、120、150和180日龄)肝脏、背最长肌和背部皮下脂肪3种组织中FAS基因mRNA的相对表达量。结果表明,品种间比较,FAS基因mRNA在马身猪和大白猪肝脏、背最长肌和背部皮下脂肪组织各生长发育阶段中的表达差异均达到显著或极显著(除肝脏组织初生阶段和背部皮下脂肪组织120日龄阶段)(P<0.05;P<0.01)。FAS基因mRNA在大白猪组织间的表达差异与生长发育相关,150和180日龄阶段,背部皮下脂肪组织中表达量极显著高于肝脏和背最长肌组织(P<0.01),初生、30日龄和90日龄阶段,背最长肌中的表达量极显著高于肝脏和背部皮下脂肪组织(初生阶段无脂肪组织样)(P<0.01);而马身猪整个发育过程中,背最长肌组织表现为优势组织,极显著高于其他2种组织(除120日龄阶段外)(P<0.01),脂肪组织表达量次之,肝脏组织中表达量较少。品种、日龄、组织及品种与日龄、组织与日龄的互作效应对FAS基因mRNA的相对表达量均有极显著影响(P<0.01)。FAS基因直接参与脂肪酸的合成,对猪肉质性状的遗传改良具有重要意义。     

金黄色葡萄球菌氟喹诺酮耐药性与NorA基因mRNA表达水平的关系

提取金黄色葡萄球菌的总RNA，应用荧光定量RT-PCR对多药耐药转运蛋白NorA基因mRNA表达水平进行定量检测的结果表明：中度耐药（CIP）的菌株（4mg／L≤MIC≤64mg／L）NorA基因mRNA表达水平为敏感菌株的5～17倍．强耐药菌株（MIC≥128mg／L）为敏感菌的1～2倍。     

饲粮能量水平对乌金猪脂肪组织脂类分解代谢相关基因表达的影响

本试验旨在研究饲粮不同能量水平对乌金猪脂肪组织脂类分解代谢相关基因表达的影响.选取体重约15 kg的乌金猪54头,随机分为3组,每组3个重复,每个重复6头猪,分别饲喂消化能为11.74(低能组)、12.89(中能组)和14.22 MJ/kg(高能组)的饲粮,在体重30、60和100 kg时屠宰取皮下脂肪组织,提取总RN...     

饲粮能量水平对乌金猪脂肪组织脂类合成代谢相关基因表达的影响

本试验旨在研究不同饲粮能量水平对乌金猪脂肪组织脂类合成代谢相关基因表达的影响.选取体重约15 kg的乌金猪54头,随机分为3组,每组3个重复,每个重复6头猪,分别饲喂消化能为11.74(低能组)、12.89(中能组)和14.22 MJ/kg(高能组)的3种饲粮.分别在体重为30、60和100kg时屠宰,测定胴体脂肪率,...     

绵羊PDGFD基因克隆及其在不同部位脂肪组织中的表达

试验旨在获得绵羊血小板源性生长因子D （PDGFD）基因的编码区（coding sequence,CDS）全长序列,并了解其在体内不同部位脂肪组织中的表达规律。以阿勒泰母羊和中国美利奴母羊为研究对象,克隆获得了PDGFD基因CDS区全长序列并对其进行了生物信息学分析,利用实时荧光定量PCR方法对PDGFD基因在2个品种羊沉积在尾部、肠系膜、背部和肾脏周围4个不同部位脂肪组织中的表达水平进行定量分析。结果显示,绵羊PDGFD基因CDS区序列长度为1 113 bp,编码370个氨基酸;PDGFD基因CDS区序列及其编码序列与山羊的相似性最高,其次是牛、猪、马、人,与鼠的相似性最低,系统进化树分析结果与其一致;预测PDGFD蛋白属于稳定的亲水性蛋白,且无跨膜区,存在信号肽序列,属于分泌型蛋白;PDGFD蛋白含有1个糖基化位点、1个CUB结构域和1个PDGF结构域,PDGFD蛋白二级结构由α-螺旋、β-转角、延伸链、无规则卷曲构成,三级结构与结构域和二级结构分析结果基本吻合。实时荧光定量PCR结果显示,PDGFD基因在阿勒泰羊4个脂肪组织的表达量均高于中国美利奴羊,其中阿勒泰羊尾脂和背部脂肪的表达量显著高于中国美利奴羊（P<0.05）。本研究结果为进一步探究PDGFD基因在绵羊脂肪沉积中的作用机制提供参考。     

不同地方猪种背部皮下脂肪中miR-206差异表达研究

试验采用荧光定量PCR技术(QRT-PCR)对6个四川省地方猪种背部皮下脂肪中miR-206的差异表达情况进行测定和分析。结果表明:藏猪miR-206相对表达量最高,成华猪次之,青峪猪最低;藏猪miR-206相对表达量显著高于内江猪(P<0.05),极显著高于丫杈猪和青峪猪(P<0.01)。     

SQ RT-PCR检测不同品种猪脂肪组织SOCS-3基因表达

取4月龄八眉猪和大白猪背部皮下脂肪组织，提取总RNA，根据大鼠细胞因子信号转导抑制因子-3基因（Suppressor Of Cytokine Signaling-3，SOCS-3）设计并合成引物，以猪β-actin基因作为内参，优化反应条件和体系，半定量（Semi Quantitative，SQ）RT-PCR单管扩增猪SOC93基因，经琼脂糖凝胶电泳分离后，Dolphin-DOC凝胶图像分析软件分析，测定各条带的光密度值，检测八眉猪和大白猪脂肪组织中SOCS-3基因mRNA的表达差异。结果表明：八眉猪脂肪组织SOCS-3 mRNA的表达丰度极显著高于大白猪（P〈0．01）。这种差异可能是2种经济类型猪脂肪沉积能力不同的主要原因之一。     

2种日粮对不同生长阶段乌金猪脂肪组织脂类合成代谢相关基因表达的影响

为探讨不同日粮对乌金猪不同生长阶段脂类合成代谢相关基因表达的影响,试验选取体重约23 kg乌金猪36头,公、母各半,随机分为2个处理组,每个处理组3个重复,每个重复6头。处理1组饲喂乌金猪日粮,处理2组饲喂NRC日粮。分别于30、60和100 kg体重时屠宰,通过Real-time PCR比较研究3个脂肪合成代谢相关基因在脂肪组织中表达的差异。结果显示,体重30 kg时,处理1组脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,FAS)的相对表达量显著低于处理2组(P<0.05),60和100 kg时,处理1组FAS基因的相对表达量高于处理2组,60 kg时达到显著水平(P<0.05);在各个体重时,处理1组固醇调节元件结合蛋白1c(sterol regulator element binding protein-1c,SREBP-1c)的相对表达量均高于处理2组,30和60 kg时达到显著水平(P<0.05);在各个体重时,处理1组二酰基甘油酰基转移酶1(diacylglycerol acyltransferase-1,DGAT-1)的相对表达量低于处理2组,100 kg时达到显著水平(P<0.05)。提示,不同日粮调控不同体重乌金猪脂类合成代谢相关基因表达存在着差异。     

鸡脂肪组织TCF21基因启动子区DNA甲基化与其表达的关系

旨在研究鸡脂肪组织中TCF21基因启动子区DNA甲基化水平与其表达的关系。以东北农业大学高、低腹脂双向选择品系（简称高、低脂系）第24世代7周龄肉鸡为试验材料,利用RT-qPCR检测高、低脂系肉鸡腹部脂肪组织中TCF21基因的mRNA表达水平;利用生物信息学和双荧光素酶报告系统分析TCF21基因启动子的结构与功能;利用Sequenom MassARRAY飞行质谱检测高、低脂系肉鸡腹部脂肪组织中TCF21基因启动子区CpG位点的甲基化水平;利用CpG甲基转移酶处理TCF21启动子报告基因质粒,分析DNA甲基化对TCF21基因启动子活性的影响。结果显示,高脂系肉鸡腹部脂肪组织中TCF21基因的mRNA表达水平极显著高于低脂系（P<0.001）;TCF21基因的启动子区存在40个CpG位点,且在启动子的近端和远端均有分布,但不存在CpG岛;将TCF21基因的启动子划分为5个功能区域,分别为R1区域（-2 000~-1 500 bp）、R2区域（-1 500~-1 000 bp）、R3区域（-1 000~-500 bp）、R4区域（-500~-200 bp）和Core区域（-200~-100 bp）;高脂系R2、R3和R2+R3区域的DNA甲基化水平显著或极显著高于低脂系（P<0.05或P<0.001）;R2、R3、R2+R3区域的DNA甲基化水平与TCF21基因mRNA表达水平呈显著正相关（R2区域：r=0.438,P<0.05;R3区域：r=0.371,P<0.05;R2+R3区域：r=0.489,P<0.05）;R2区域的DNA甲基化显著抑制其转录活性（P<0.05）。综上所述,TCF21基因在高、低脂系肉鸡腹部脂肪组织中的表达水平主要与其启动子R2区域的DNA甲基化水平有关。     

鸡BMP7基因组织表达特性及其在高、低脂系脂肪组织中表达差异研究

骨形态发生蛋白7(Bone morphogenetic proteins7,BMP7)是一类与骨骼发育密切相关的酸性多肽,属于TGF-β超家族,能够诱导血管周围及结缔组织中的间充质细胞向骨细胞方向分化。近期研究结果表明,BMP7在哺乳动物棕色脂肪组织发育过程中发挥重要作用。目前还没有关于鸡BMP7基因表达规律的研究。本研究以东北农业大学高脂系肉鸡为试验材料,采用半定量RT-PCR的方法检测BMP7基因在不同组织中的表达特性,发现BMP7在鸡23种组织中均有表达;采用半定量RT-PCR和Real-time PCR的方法检测BMP7基因在高、低脂系肉鸡脂肪组织间的表达差异,发现BMP7基因在高脂系肉鸡脂肪组织中的表达量显著高于低脂系(P<0.05)。本研究为进一步揭示BMP7基因与鸡脂肪组织发育之间的关系奠定了基础。