环介导等温扩增技术检测克氏螯虾样品中的副溶血性弧菌

建立了环介导等温扩增技术检测副溶血性弧菌的方法。以副溶血性弧菌tlh基因作为靶基因,设计特异性引物,建立了环介导等温扩增(LAMP)检测方法,并分别采用LAMP检测方法和国家标准方法(GB/T4789.7-2008)对克氏螯虾样品中的副溶血性弧菌进行检测。结果表明,建立的LAMP方法最低检出限为1×101 cfu/mL;对6种细菌共8株菌进行LAMP法扩增,仅3株副溶血性弧菌得到阳性扩增。建立的LAMP检测方法与国家标准检测方法检测结果一致,准确度高。     

九种动物性食品致病菌通用前增菌方法的研究

为探索快速多重检测食源性致病菌的方法,对污染动物性食品的大肠埃希氏菌O157:H7(EnterohemorrhagicEscherichiacoli O157:H7),副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus),创伤弧菌(Vibrio vulnificus),伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi),金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus),小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica),单核细胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes),宋氏志贺氏菌(Shigella sonnei),荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)等九种致病菌进行了通用前增菌方法的研究。研究了培养基、培养温度和培养时间对九种菌前增菌效果的影响,结果表明:LB肉汤培养基,36℃培养18h,九种致病菌的增菌效果最好且数量级均衡一致,均达到108cfu·mL-1。     

PMA在副溶血性弧菌检测中的应用

在我国,副溶血性弧菌被认为是海产品衍生疾病的主要因素,因此急需一种能快速、灵敏、特异、准确地检测食品中副溶血性弧菌的方法。传统培养法一直是检测的金标准,但是其检测周期较长;分子生物学方法如聚合酶链式反应(PCR)、实时荧光定量PCR(qPCR)、环介导等温扩增技术(LAMP)已被广泛用于食品中副溶血性弧菌的检测,但是这些方法不能区分死菌和活菌的DNA,容易造成假阳性。而叠氮溴化丙锭(propidium monoazide,简称PMA)等核酸染料的使用可以有效地消除这一弊端。研究者们将PMA处理与PCR(qPCR)结合,应用于食品中多种食源性致病菌活菌的检测,但是关于PMA在副溶血性弧菌检测中应用的报道并不多见。因此,拟对PMA应用于食品中副溶血性弧菌检测的可行性进行分析,以便为进一步开展相关研究提供参考。     

环介导等温扩增法对虾酱中致病菌检测结果的分析

样品按照GB4789系列标准进行增菌后,提取致病菌核酸利用环介导等温扩增技术对检测虾酱中食源性致病菌进行快速检测。结果显示:5种致病菌沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌和大肠杆菌O157检测结果阴性,符合率100%,在副溶血性弧菌中有假阳性出现。环介导等温法检测虾酱时应考虑有干扰导致假阳性出现的可能。     

利用PCR技术快速检测水产品中副溶血性弧菌

[目的]对副溶血性弧菌的检测进行研究。[方法]采用聚合酶链式反应（PCR）,以标准菌株（单增李斯特菌、哈氏弧菌）作为阴性对照对3株副溶血性弧菌进行特异性扩增,扩增引物采用副溶血性弧菌如基因中的tlh-3和tlh-4,同时利用PCR对人工污染的白对虾中的副溶血性弧菌进行检出限测定。[结果]结果表明,通过PER扩增,副溶血性弧菌在约449bp处扩增出特异性条带,单增李斯特菌、哈氏弧菌均未出现任何条带,扩增片段表现出极好的特异性。菌液稀释到3．3×10^2cfu／ml时,将其污染到白对虾中作PCR仍可扩增出目的片断。[结论]该研究表明PER检测方法快捷、特异性好、敏感性高,可以作为副溶血性弧菌辅助检测方法。     

浙江省海产品中副溶血性弧菌污染情况分析

2011-2012年对浙江省11个市的消费市场中的缢蛏、海带、花蛤、泥蚶、蛤蜊等海产品,参照GB-T 4789.7—200方法进行副溶血性弧菌分离,并用双重PCR法确定该菌的携带情况。230批次样品检测结果显示,有85批次检出副溶血性弧菌,平均检出率为36.96%。     

水产品副溶血性弧菌不同增菌液增菌效果的比较

[目的]对用不同方法检测水产品副溶血性弧菌的不同增菌条件进行比较,以期寻找一种快速高效的增菌条件,为提高检测效率提供聋考依据。[方法]采用FDA、ISO、GB／T4789．7-2003、GB／T4789．7-2008、SN0173等方法中的培养基配方,时副溶血性弧菌进行杂种培养,并通过生长曲线测定方法比较验证使用培6-基的增菌效果。[结果]结果表明,含3％NaCl的碱性蛋白胨具有最好的增菌茵效果。[结论]该结果对于检测水产品中副溶血性弧菌具有重要的指导意义。     

常见病原菌基因组DNA快速提取试剂盒研制

以单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌等6种常见食源性致病菌为研究对象,优化试剂盒工艺参数,采用琼脂糖凝胶电泳及OD260/OD280分析基因组DNA提取效果。结果表明,试验试剂盒可在30 min内完成基因组DNA提取,对常见10类食品样品抗基质干扰能力强。与实时荧光PCR技术联用,检测染菌量1~10 cfu·25 g-1食品样品时,仅一次增菌可得阳性结果;市售食品样品检测与国标方法结果无显著差异。所研制病原菌基因组DNA提取试剂盒适用于食品病原菌快速检测。     

EMA-LAMP方法快速检测食源性副溶血性弧菌活细胞

将一种DNA染料叠氮溴化乙锭(EMA)与环介导等温扩增技术(LAMP)相结合,建立一种能快速检测食品中食源性副溶血性弧菌活细胞的新方法.结果表明,EMA-LAMP方法最低检测限为1×10 CFU/mL,PCR方法最低检测限为1×103 CFU/mL.与PCR方法相比较,EMA-LAMP检测方法具有快速、灵敏度高、操作简便等优点,并能检测鉴定副溶血性弧菌病原活细胞.     

实时定量PCR法快速检测水产品中的副溶血性弧菌

副溶血性弧菌是一种广泛存在于水产品中的食源性致病菌,可污染食物,引起严重的食物中毒。利用实时定量PCR方法建立一种快速检测水产品中副溶血性弧菌的方法,根据随机扩增多态性分析(RAPD)鉴定特异性片段,设计特异性引物。采用建立的实时定量PCR方法检测市售水产品20份,检出阳性食品6份,最小检测灵敏度为50 fg DNA,与传统微生物检测结果相比无显著差异。该检测方法特异性强,灵敏度高。     

虾源副溶血弧菌致病基因检测与ERIC-PCR分型

为了监测上海市养殖对虾中副溶血弧菌致病基因的携带情况及潜在致病株流行情况,采用PCR方法对上海地区不同对虾养殖单位中分离获得的19株副溶血弧菌分离株及1株标准菌株进行6种致病基因的检测筛查,并采用ERIC-PCR方法进行基因分型分析。结果发现:19株副溶血弧菌中未检测出携带tdh、ORF8基因,只有1株携带trh基因,而tox RS/new基因携带率较高,19株中有14株检出阳性,基因携带率为73.7%。对能够引起对虾急性肝胰腺坏死病(AHPND)的副溶血弧菌特异性质粒基因的检测中发现,AP1和AP2基因均有3株检测出阳性,基因携带率均为15.8%。通过ERIC-PCR分型技术将20株副溶血弧菌分成7个不同的类群,其分辨力指数DI值为0.811,表明ERIC-PCR具有较好的基因分型能力,分型结果发现该方法能够有效区分不同时间段获得的菌株,而对不同地理位置获得的菌株区分并不明显。以上结果表明从养殖对虾中分离得到的副溶血弧菌致病基因携带率总体偏低,但存在一定的流行风险,需要防范一些新的致病株的流行,这些可以为对虾养殖单位中副溶血弧菌致病流行株的预防控制提供相关参考。     

杀螟丹、螺虫乙酯和铜镉二元复合污染的联合毒性

针对农业活动中广泛使用的杀螟丹、螺虫乙酯和常见重金属污染物铜、镉,以费氏弧菌为受试生物研究污染物并存状态下的联合毒性。通过研究在不同暴露时间下二元复合污染对费氏弧菌的急性毒性效应,计算半数效应浓度EC_(50),并采用混合毒性指数法评价联合毒性。研究表明,铜、镉、杀螟丹、螺虫乙酯单一暴露于费氏弧菌15 min的EC_(50)分别为0.53、0.74、79.06 mg·L~(-1)和116.67 mg·L~(-1)。杀螟丹和重金属的混合体系对费氏弧菌的联合毒性主要表现为相加作用,当螺虫乙酯在混合体系中占比较低时,也表现为部分相加作用。杀螟丹和螺虫乙酯能够减缓金属离子进入细胞的速率,因此费氏弧菌急性毒性实验研究联合毒性时,暴露时间应延长至45 min以上。     

池塘养殖凡纳滨对虾幼虾到成虾阶段生长差异研究

为探究池塘养殖条件下凡纳滨对虾幼虾至成虾阶段不同个体间存在的生长差异,本实验采集了放苗后第28、38、48、58、68和73天的对虾样品。首先以28天对虾样品为例,计算不同体质量虾所占比例;按体质量排序的前10%(14只)、中位数附近10%(14只)、后10%(14只)定义对虾生长速率高、中、低3组,其次对对虾的体长、体质量分别进行幂函数拟合和线性回归,比较不同生长特性虾之间的差异。再分别计算所有样品及不同生长速率组虾的绝对日增长、绝对日增重和相对日增长率、相对日增重率。结果发现,相同生长时期的3组虾生长速率差异显著(P95%),将这些生长速率不同的虾作为一个整体来分析虾的生长情况可能会出现一定偏差。其次,体长对体质量的线性回归结果为:幂函数W_(所有样品)=1×10~(-5)L~(3.0051),直线方程y_(所有样品)=3x-4.92,不同生长速率组的直线方程分别为y_高=3.41x-5.71,y_中=3.21x-5.30,y_低=2.92x-4.78;直线方程中斜率与生长速率呈正相关,3组线性回归方程能更加确切地反映出3组虾的真实生长情况;同时发现,不同生长速率虾的绝对生长值与对虾的实际生长情况吻合,而相对生长值与对虾的实际生长情况不相符,建议以后分析对虾生长特性时参数选择绝对生长值更为适宜。     

A multiplex PCR method for detection of Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis with co-amplification of its host DNA

A multiplex PCR assay system was developed for the detection of Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Cmm), which combined two tests in one reaction mixture. Cmm-specific primers PSA-4/PSA-R and Solanum lycopersicum-specific primers NS-7-F/NS- 8-R (internal PCR control primer) were combined in one PCR reaction mixture with Cmm and plant DNA as template. The primer sets could amplify the target product successfully. Different combinations and concentrations of primers and annealing temperatures were tested, respectively. The detection level of the optimized multiplex PCR assay was up to 5×10² cfu·mL⁻¹. To verify the applicability of this system, it was employed to detect Cmm in tomato seeds and plantlet samples. Seeds mixed with Cmm and diseased plantlets were detected successfully. The multiplex PCR system will avoid false-negative results and provide a reliable method for the detection of Cmm.     

基于PLO基因的山羊化脓隐秘杆菌PCR检测方法的建立与应用

为建立特异的化脓隐秘杆菌PCR检测方法,基于化脓隐秘杆菌PLO基因设计4对引物,对12种细菌进行常规PCR扩增,以评价方法的特异性,并运用建立的PCR方法检测临床样本。结果显示只有使用F1/R1引物对的PCR方法能鉴别化脓隐秘杆菌,并能用于临床样本检测。     

克百威、镉和铜对费氏弧菌的联合毒性效应

通过费氏弧菌急性毒性实验,研究克百威、镉(Cd)和铜(Cu)三种受试样本及其混合样本(克百威-Cd和克百威-Cu的等毒性单位比为1∶1、1∶2、2∶1,克百威-Cd-Cu的等毒性单位比为1∶1∶1、1∶1∶2、1∶2∶1、2∶1∶1)对费氏弧菌15 min和30 min的急性毒性效应,计算克百威、Cd和Cu的单一和混合样本的半数效应浓度(Median effective concentration,EC50)。克百威、Cd和Cu暴露15 min的EC50值分别为101.29、13.11、47.06 mg·L~(-1),暴露30 min的EC50值分别为107.88、11.17、39.73 mg·L~(-1)。利用毒性单位(Toxicity unit,TU)法、相加指数(Additive index,AI)法和混合毒性指数(Mixtures toxicity index,MTI)法对混合样本进行了定性评价,结果表明:克百威与Cu和Cd两种重金属二元和三元复合作用后主要表现为部分相加和协同作用,说明二元和三元复合毒性较单一毒性增强,且不同混合比例下,联合毒性效应具有差异。TU法与MTI法的评价结果一致,而AI法的结果略有差异。     

基于Iclp的拟态弧菌OmpUAP真核表达重组质粒的构建及其免疫效果初步评价

为了探明鱼类恒定链类似蛋白(Iclp)能否作为免疫载体,提高基因疫苗的免疫效果,以拟态弧菌OmpU蛋白的黏附功能域(OmpU_(AP))为疫苗靶点,构建真核表达重组质粒pcDNA3.1-OmpU_(AP)和基于草鱼Iclp的pcDNA3.1-Iclp-OmpU_(AP)。用2种真核表达重组质粒分别免疫草金鱼,同时设置空质粒pcDNA3.1(+)对照组与PBS对照组。于免疫后不同时间(7、14、21、28和35 d)采用PCR和RT-PCR方法检测重组质粒在鱼体不同组织中的分布与转录水平的表达情况,使用双抗体夹心ELISA检测血清抗体水平,并于免疫后第35天进行攻毒保护性实验,检测其免疫保护率。结果显示,免疫后第7天在肌肉、鳃、头肾、肝脏和脾脏中均有重组质粒分布,并在35 d内持续表达。pcDNA-OmpU_(AP)免疫组草金鱼的血清抗体水平缓慢上升,除第21天外,其余检测时间点的抗体水平与空质粒对照组无显著差异。pcDNA3.1-Iclp-OmpU_(AP)免疫组草金鱼在免疫后7 d即有血清抗体产生,随着免疫时间延长,抗体水平不断上升,至28 d达到峰值,随后抗体水平开始下降;除第7天外,其余各检测时间点的血清抗体水平均显著或极显著高于pcDNA3.1-OmpU_(AP)免疫组与空质粒对照组。攻毒后pcDNA3.1-Iclp-OmpU_(AP)和pcDNA-OmpU_(AP)免疫组草金鱼的相对免疫保护率为别为46.7%和20%,而空质粒对照组和PBS对照组的实验鱼全部发生死亡。表明Iclp可以作为免疫载体,提高鱼类基因疫苗的免疫效果。     

凡纳滨对虾繁育相关基因Allatostatin-AR的克隆与表达分析

咽侧体抑制素主要抑制昆虫咽侧体保幼激素的分泌,是昆虫体内重要的神经肽,在甲壳动物体内可能参与繁殖发育的调节。本研究利用RACE PCR技术对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)A型咽侧体抑制素受体(Allatostatin-A receptor,AST-AR)基因进行克隆,获得全长为2 650 bp的cDNA,包括1 425 bp的开放阅读框,1 170 bp 5''非编码区,55 bp 3''非编码区,编码474个氨基酸,形成具有7个跨膜区的不稳定亲水性蛋白。同源性和系统发育分析结果表明凡纳滨对虾AST-AR基因与斑节对虾(Penaeus monodon)、美洲龙虾(Homarus americanus)同源性最高,亲缘关系最近。氨基酸多重序列比对结果显示AST-AR氨基酸TM7后C末端精氨酸在不同物种之间高度保守。实时荧光定量PCR结果显示,AST-AR基因在雌、雄凡纳滨对虾多个组织(眼柄、脑、胃、肝胰腺、鳃、性腺、肠、肌肉)中均有表达,除脑组织外AST-AR基因在雌性凡纳滨对虾中相对表达量高于雄性。在幼体发育中,AST-AR基因的相对表达量随发育阶段上升,同时该基因在不同群体仔虾生长对比实验中表达量差异显著。据此推测AST-AR基因参与凡纳滨对虾的繁殖、幼体发育、幼虾生长到成虾,基因表达基本贯穿凡纳滨对虾的一生。     

TaqMan-LNA探针荧光定量PCR快速检测对虾

【目的】建立快速、特异、灵敏检测对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒（IHHNV）的TaqMan-LNA探针荧光定量PCR方法,为IHHNV的临床诊断和疫情监测提供更简便的检测技术。【方法】根据GenBank已发表的IHHNV毒株序列,在IHHNV保守区序列设计特异性引物和TaqMan-LNA探针;对荧光定量PCR反应条件进行优化以缩短检测时间,提高特异性和灵敏度;应用TaqMan-LNA探针荧光定量PCR对广西地区的300份凡纳滨对虾样品进行检测,验证方法的实用性。【结果】TaqMan-LNA探针荧光定量PCR检测IHHNV的灵敏度高,约为10个病毒粒子/反应,定量范围宽,在1.6×101～1.6×108拷贝/μL的范围内具良好的线性关系;与SPF凡纳滨对虾组织、WSSV、副溶血弧菌的DNA和TSV的RNA均无反应,特异性好;组内变异系数为0.53%～1.75%,组间变异系数为0.81%～1.14%,重复性和重现性均较好,结果稳定可靠;临床应用结果表明,300份凡纳滨对虾样品检出193份阳性,阳性率为64.3%,表明广西沿海地区养殖的凡纳滨对虾IHHNV感染率较高。【结论】利用TaqMan-LNA探针建立检测IHHNV的荧光定量PCR方法具有快速、特异、灵敏、重复性好、能定量等优点,可用于对虾IHHNV的检测。     

出口冻虾仁中多次检出溶藻弧菌的报告

[目的]了解和掌握奉化地区出口冻虾仁的溶藻弧菌污染情况。[方法]采集冻虾仁标本按照SN0173-92分离溶藻弧菌。[结果]从35批冻虾仁出口样品中,检测出溶藻弧菌菌株21批,检出率高达61.76%。[结论]冻虾仁中溶藻弧菌携带率很高,应引起相关部门重视,企业应采用切实有效的杀菌方法,谨慎选择原料捕捞季节和海区。