南方水稻黑条矮缩病毒外壳蛋白p1O的原核表达和抗血清制备及应用

南方水稻黑条矮缩病毒(SRBSDV) p10蛋白由其基因组片段S10编码,根据SRBSD海南分离物S10序列(EU523360)设计特异性引物扩增编码p10蛋白的片段,并亚克隆至原核表达载体pET-28a+,以大肠杆菌BL21 plysS为宿主菌进行高水平表达,利用纯化的p10蛋白免疫兔子,制备了p10蛋白的特异性抗血...     

南方水稻黑条矮缩病毒外壳蛋白p1O的原核表达和抗血清制备及应用

南方水稻黑条矮缩病毒(SRBSDV) p10蛋白由其基因组片段S10编码,根据SRBSD海南分离物S10序列(EU523360)设计特异性引物扩增编码p10蛋白的片段,并亚克隆至原核表达载体pET-28a+,以大肠杆菌BL21 plysS为宿主菌进行高水平表达,利用纯化的p10蛋白免疫兔子,制备了p10蛋白的特异性抗血清.ELISA检测显示,p10蛋白的抗血清可与来自湖南不同地区的白背飞虱病汁液发生强烈的血清学反应,表明该抗血清适用于田间SRBSDV的快速诊断.     

双重RT-PCR法同时快速检测南方水稻黑条矮缩病毒和水稻黑条矮缩病毒

南方水稻黑条矮缩病毒(SRBSDV)和水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)在病害症状、传播介体及寄主等方面非常相似,田间很难对其进行诊断及鉴定.根据SRBSDV与RBSDV外壳蛋白(CP)基因核苷酸序列差异设计特异性引物,建立一种快速、准确的双重PT-PCR鉴别方法,为SRBSDV和RBSDV的流行监测提供技术支持.     

安徽水稻黑条矮缩病毒基因组片段S10的cDNA克隆及其序列分析

从采自安徽省肥西县发病的水稻材料中提取水稻黑条矮缩病毒dsRNA,利用RT-PCR获得了病毒基因组片段S10的cDNA克隆,并测定其全序列。结果表明:S10全长1801bp,含有一个ORF;核苷酸与氨基酸序列同源性比较表明,其与浙江的RBSDV(AY050488)最接近,分别为99.2%和99.6%;与日本的RBSDV(D00606)分别为95.1%和97.5%。     

抗水稻黑条矮缩病毒和南方水稻黑条矮缩病毒的双价RNA沉默载体的构建

为利用RNAi技术获取抗水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)和南方水稻黑条矮缩病毒(SRBSDV)植株,分别针对两种病毒的S6和S10基因构建RNA沉默载体。采用重组PCR方法将RBSDV S6基因片段(R6)和SRBSDVS6基因片段(SR6)进行融合,获得600 bp的R6-SR6融合基因;将RBSDV S10基因片段(R10)和SRBSDV S10基因片段(SR10)进行融合,获得600 bp的R10-SR10融合基因。融合基因以反向重复的方式连入pBS载体,并定向插入到pCAMBIA1301载体上,获取了含有发夹结构的植物表达载体pCAMBIA1301-hp(R6-SR6)和pCAMBIA1301-hp(R10-SR10)。抗RBSDV和SRBSDV RNA沉默载体的构建为利用RNA沉默进行植物抗病毒研究奠定了基础。     

水稻黑条矮缩病毒与南方水稻黑条矮缩病毒的检测及其在江西省的区域分布

为明确水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)和南方水稻黑条矮缩病毒(SRBSDV)这2种病毒在江西省的分布,首先从永修县、南昌县和大余县等8县市采集水稻疑似矮缩病株,用2种病毒一步检测法对这2种病毒进行RT-PCR检测.结果表明:永修县所有样品均检出RBSDV,检出率为100％;南昌县同时检出RBSDV和SRBSDV,检出率分别为90％和20％,其中南昌县的1个样品同时检出2种病毒,存在复合侵染;大余县、莲花县、崇义县、婺源县、万安县和井冈山市等6县的所有样品均检出SRBSDV,检出率100％.然后,对这2种病毒在江西省的分布特点进行分析.统计分析结果表明:江西省西南部和东北部只有SRBSDV分布,江西省北部只有RBSDV分布,而处于以上3个病毒重发区之间的南昌县同时有RBSDV和SRBSDV分布.同时基于S9序列和S10序列建立这2种病毒及其近缘种的系统发育树,分析其亲缘关系.     

安徽省水稻黑条矮缩病毒和南方水稻黑条矮缩病毒的 分子检测和序列分析

近年来,水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)和南方水稻黑条矮缩病毒(SRBSDV)在安徽各稻区危害日益严重,生产上仅凭症状难以区分2种病毒。本研究建立的RT-PCR方法可以实现一次性检测和鉴定RBSDV和SRBSDV 2种病毒,根据RBSDV和SRBSDV S9保守序列设计3个引物,不仅可以从单独感染RBSDV或SRBSDV的水稻样本中分别扩增出1条大小不同的特异性条带,而且还可以从感染RBSDV和SRBSDV的混合水稻样本中一次性扩增出2条大小不同的特异性条带。从安徽省庐江县、郎溪县、怀宁县和宣州市4个地区水稻田采集表现明显矮缩病症状的水稻样本,RT-PCR检测结果表明,庐江和郎溪水稻样本受到RBSDV侵染,怀宁和宣州水稻样本受到SRBSDV侵染。选取庐江县、郎溪县、怀宁县和宣州市各1个水稻样本,利用RT-PCR扩增出特异性条带,再分别克隆和测序。序列分析表明,庐江、郎溪2个样本的核苷酸序列与RBSDV-Shandong和RBSDV-Zhjr S9部分片段序列相似性高达99.3%～99.8%,且与RBSDV的亲缘关系最近,说明庐江和郎溪样本感染的病毒是RBSDV的2个分离物;怀宁、宣州2个样本的核苷酸序列与SRBSDV-Shangdong和RBSDV-2 S9部分片段序列相似性高达99.5%,且与SRBSDV亲缘关系最近,说明怀宁和宣州样本感染的病毒是SRBSDV的2个分离物。     

广西南方水稻黑条矮缩病毒及水稻齿叶矮缩病毒的分子检测

[目的]探索南方水稻黑条矮缩病毒(SRBSDV)和水稻齿叶矮缩病毒(RRSV)的分子检测技术,了解两种病毒在广西的分布,为生产上开展两种病害的防治奠定基础.[方法]用RT-PCR技术检测采自广西各地的水稻、杂草及稻飞虱样品;用CF-11纤维素粉提取水稻茎叶组织中的dsRNA,1.5%琼脂糖凝胶电泳观察dsRNA图谱.[结果]从水稻、稗草、五节芒、李氏禾和白背飞虱样品中获得850 bp左右的SRBSDV序列,从水稻和褐飞虱样品中获得700 bp左右的RRSV序列;首次从五节芒和李氏禾中检测到SRBSDV.SRBSDV单独侵染、SRBSDV和RRSV复合侵染可见8条dsRNA条带,但带谱不一致;RRSV单独侵染可见5条dsRNA带.在供检测的181株水稻样品中,除了来自北海、贵港和梧州市的水稻样品外,其余样品均检测到SRBSDV;除了来白梧州、贺州、玉林、贵港和来宾的水稻样品外,其余样品均检测出RRSV;其中带SRBSDV的样品数占44.8%,带RRSV的样品占21.5%,两种病毒复合感染占11.0%.[结论]研究设计的特异性引物能用于RT-PCR检测SRBSDV和RRSV、水稻样品提取dsRNA能快速直观地鉴定SRBSDV、RRSV单独感染及混合感染水稻.用设计的引物首次检测出SRBSDV的两种新寄主五节芒和李氏禾.     

南方水稻黑条矮缩病毒S6编码一个沉默抑制子

 【目的】分析南方水稻黑条矮缩病毒（SRBSDV）基因组S6编码的SP6蛋白的抑制子活性,明确SRBSDV是否编码RNA沉默抑制子来干扰植物的沉默。【方法】将分别含有SP6与GFP质粒的农杆菌共浸润转GFP基因的16c本氏烟纯合系,观察SP6对局部沉默和系统沉默的抑制作用;将含有SP6,GFP和dsGFP质粒的农杆菌三者共浸润,观察SP6对由dsRNA引起的沉默的抑制作用;在同一植株不同部位接种GFP和SP6,观察SP6对RNA沉默信号传导的影响;通过马铃薯X病毒（Potato virus X,PVX）在本氏烟上表达SP6,观察SP6是否能增强PVX的致病性。【结果】SP6能抑制由GFP正义RNA介导的沉默,但其抑制作用较弱,仅能延缓局部沉默和系统沉默的产生。SP6能灭活RNA沉默信号,阻止沉默信号的长距离传导,回复GFP的沉默,但不能抑制由dsRNA引起的沉默。利用PVX在本氏烟上表达SP6能增强PVX的致病性。【结论】SP6是病毒编码的RNA沉默抑制子,在RNA沉默的起始和信号传导阶段起作用。     

南方水稻黑条矮缩病毒的新的自然寄主

2010年,由南方水稻黑条矮缩病毒(SRBSDV)引起的新水稻矮缩病在湖南省大面积爆发.为确定南方水稻黑条矮缩病毒的自然寄主范围,采集湖南省永州零陵、邵阳隆回、郴州宜章等地发病田块及附近的禾本科作物及杂草,提取RNA后,用自行设计的专利引物对,对其进行RT-PCR检测,发现高粱、野燕麦、牛筋草是新的SRBSDV自然寄主.     

The Efficiency of Southern rice black-streaked dwarf virus Transmission by the Vector Sogatella furcifera to Different Host Plant Species

Southern rice black-streaked dwarf disease is a new rice disease that severely affects rice production in South China.To understand transmission capacity of the vector Sogatella furcifera to Southern r...     

鸡传染性法氏囊病病毒BJ-10株VP2基因的克隆及原核表达

【目的】克隆鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)BJ-10株VP2基因,构建其原核表达载体,并在大肠埃希菌中进行高效表达。【方法】根据IBDVVP2基因序列设计1对特异性引物,应用RT-PCR技术克隆IBDV BJ-10株VP2基因;将目的基因插入pMD18-T连接载体,筛选出阳性重组质粒;将该质粒克隆至原核表达载体pET-32α中,转化入JM109,经IPTG诱导表达,对产物进行SDS-PAGE电泳分析,确定IPTG的最佳诱导表达时间和浓度。【结果】克隆到了全长1 356bp的IBDV BJ-10株VP2基因;PCR、酶切鉴定分析表明,成功构建了重组质粒pET-32α-VP2;SDS-PAGE电泳分析表明,在宿主菌JM109中成功表达了约为60ku的VP2蛋白;IPTG诱导表达时间以4.5h为宜,诱导最佳浓度为0.8mmol/L。【结论】成功克隆了IBDV BJ-10株VP2基因,并在大肠埃希菌中表达了VP2蛋白。     

猪流行性腹泻病毒COE基因的原核表达和免疫原性分析

为研究猪流行性腹泻病毒中COE基因的原核表达情况及免疫原性,从感染猪流行性腹泻病毒的猪体内采集肠内容物、肠段及肠系膜淋巴结,参照GenBank中所收录的猪流行性腹泻病毒（PEDV）CV777株的COE基因序列设计1对特异性引物,通过RT-PCR扩增出COE基因,克隆到原核表达载体pET-32α上,并构建重组表达质粒pET-32α-COE,在大肠杆菌Rosetta中进行表达,并进行Western blot检测。结果显示,重组蛋白获得了高效的表达,并能与多抗血清发生特异的免疫印迹反应。COE基因是猪流行性腹泻病毒的中和抗原位点,具有良好的免疫学活性。     

H9N2亚型禽流感病毒NS1基因的原核与真核表达

【目的】构建H9N2亚型禽流感病毒(AIV)NS1基因的原核和真核表达载体,将其分别在大肠杆菌和293细胞中进行表达,为进一步研究NS1蛋白的功能及其与宿主的相互作用,以及鉴定禽流感疫苗免疫禽和野毒感染禽ELISA诊断试剂盒的制备提供理论依据。【方法】用RT-PCR方法扩增H9N2亚型AIV的NS1基因,将其定向克隆到原核表达载体pET-32a(+)中构建NS1基因的原核重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)后,用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达;同时,将NS1基因克隆到真核表达载体pEGFP-C1中,构建NS1基因真核重组质粒,将其瞬时转染293细胞,48h后收集感染细胞,对大肠杆菌表达产物和293细胞表达产物进行Western-blotting分析。【结果】成功构建了NS1基因的原核表达载体pET-32a-NS1和真核表达载体pEGFP-C1-NS1。Western-blotting结果表明,大肠杆菌和293细胞的表达产物均能检测到特异性条带(大肠杆菌的表达产物在约44ku处出现阳性条带,293细胞表达产物在约55ku处出现特异条带)。【结论】NS1基因在大肠杆菌和293细胞中得到成功表达,获得的NS1蛋白具有良好的抗原活性。     

百合水通道蛋白LotNIP5-1基因的克隆及表达分析

为研究NIP5-1基因(Nodulin26-like intrinsic protein)在百合生长发育方面的作用机理,利用RACE技术克隆得到百合NIP5-1基因的全长cDNA序列。运用多个软件进行生物信息学分析;采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)及RT-PCR技术检测其表达特性。结果表明:1)百合NIP5-1基因全长为1 492bp,包含1个900bp的完整开放阅读框(Open reading frame,ORF),共编码299个氨基酸;2)百合NIP5-1蛋白属于跨膜通道蛋白MIP超家族。具有6个跨膜区;在B、E环分别具有NIP5-1蛋白特有的NPS、NPV模体,具有该蛋白Ar/R filter分子筛特有的AIGR模体;与小果野芭蕉、香瓜、葡萄、黄瓜、番茄的相似性分别为86%、83%、84%、83%和82%;3)荧光定量结果显示,百合NIP5-1基因在茎中表达量最高,在花瓣中表达量较低,在叶、鳞茎、根中表达量均极低。RTPCR半定量检测显示,其在"湿"柱头上表达量显著高于"干"柱头,这与转录组测序结果相符合。上述研究暗示,百合NIP5-1可能是硼酸通道蛋白,在促进茎生长及生殖活动中发挥作用。