低温等离子体活化介质诱导真皮间充质干细胞凋亡研究

旨在探究低温等离子体（NTAPP）处理的PAM对DMSCs活性的影响,阐明PAM促进DMSCs发生细胞凋亡的机制,在体外提取小鼠原代真皮间充质干细胞（DMSCs）,并采用流式细胞术检测其表面Marker,油红O和茜素红检测其成脂成骨能力、流式细胞术测定凋亡情况以及活性氧（ROS）水平、蛋白质免疫印迹检测凋亡相关蛋白以及抗氧化蛋白表达水平。结果表明,成功提取DMSCs,并具有成脂成骨分化能力;与未处理组相比,低温等离子体活化介质（PAM）处理后可引起细胞内的ROS水平升高导致细胞凋亡,同时造成凋亡相关蛋白Bax表达水平上升、Bcl2表达水平下降,以及细胞内抗氧化蛋白Prx I、Prx V、GPX表达水平升高。研究表明,一定剂量的PAM能上调细胞内ROS水平,导致DMSCs细胞凋亡水平上升,研究结果可为今后筛选PAM诱导DMSCs增殖的最佳条件提供前期结果,也为丰富低温等离子体在干细胞领域的研究提供理论依据。     

S100A4蛋白的生物学功能研究进展

S100A4是S100蛋白家族成员之一,是一种具有EF双螺旋结构域的Ca2+结合蛋白。S100A4在多数成体组织细胞中不表达,在多种肿瘤和干细胞等增殖细胞内高度表达。相关研究表明,S100A4蛋白的表达与细胞的异常增生及肿瘤的发生、发展有关,并可促进肿瘤细胞的转移、侵入以及瘤区血管的生成。本研究组发现,S100A4在鹿生茸区骨膜(鹿茸发生的组织基础)和角柄骨膜(鹿茸再生的组织基础)的组织细胞中均大量存在。与肿瘤细胞不同的是,鹿茸干细胞并没有因为S100A4的表达而发生异常的侵入和转移,其增殖、生长直至分化为形状规则的完整鹿茸受到了严格的调控。鹿茸是哺乳动物中唯一可以周期性再生的复杂器官,其再生的机制引起了越来越多的关注,S100A4作为一种在快速增殖细胞中高度表达的多功能蛋白,为我们揭示鹿茸的发生与再生机制提供了一个新的研究方向。     

脐带间充质干细胞及其外泌体对宫颈癌HeLa细胞的作用初探

人脐带间充质干细胞是一种多能干细胞,可用于多种疾病的临床治疗。利用从人类脐带分离的间充质干细胞,以及从该间充质干细胞的培养液中分离提取的外泌体,通过与宫颈癌HeLa细胞共培养,研究间充质干细胞及其外泌体对HeLa细胞生物学表型的影响。结果表明:脐带间充质干细胞共培养均极显著抑制HeLa细胞的增殖、迁移及侵袭等表型,并极显著促进HeLa细胞凋亡。脐带间充质干细胞来源的外泌体处理HeLa细胞后,细胞增殖、迁移及侵袭也同样受到极显著抑制,并极显著促进细胞凋亡。这一研究提示脐带间充质干细胞及其外泌体并未在体外培养条件下促进HeLa细胞的生长、迁移,相反对HeLa细胞的表型具有一定的抑制作用。     

人脐带间充质干细胞源外泌体对黑色素瘤细胞生长的影响

为探讨人脐带间充质干细胞源外泌体对黑色素瘤细胞生长的影响,利用差速超速离心法提取人脐带间充质干细胞源外泌体,并用透射电子显微镜、Western blot方法鉴定外泌体形态、粒径和蛋白质;利用CCK-8法、细胞划痕试验、Transwell试验检测不同浓度人脐带间充质干细胞源外泌体对黑色素瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力的影响.结果表明:人脐带间充质干细胞源外泌体呈杯托状,平均粒径70 nm左右,表达标志性蛋白CD63和CD9.不同浓度人脐带间充质干细胞源外泌体对黑色素瘤细胞增殖、迁移和侵袭能力有促进作用,且呈时间、剂量依赖性,并在人脐带间充质干细胞源外泌体浓度为300μg·mL-1时达到最高,而在浓度为400 pg·mL-1时促进率开始明显下降.     

北京油鸡胚胎肝脏间充质干细胞的生物学特性

从7日龄北京油鸡胚胎肝脏中分离间充质干细胞,原代培养并传代至15代,免疫荧光法检测造血祖细胞/肝卵圆细胞的表面标志物CD34、CK19呈阴性表达; RT-PCR检测CD29、CD44、CD71、CD73呈阳性表达。尝试不同培养条件对细胞生长曲线的影响,选取最佳培养方案,同时对细胞进行细胞周期测定。肝脏间充质干细胞通过不同诱导液被成功诱导分化成脂肪细胞、心肌细胞,结果表明,从鸡胎肝中分离获得的间充质干细胞具有和人类间充质干细胞相似的生物学特性及分化潜能,其所具有多向分化的潜能,为今后临床广泛应用提供了可能。     

牛脂肪间充质干细胞对金黄色葡萄球菌生长的影响

为探讨成体奶牛脂肪来源的间充质干细胞(bAD-MSCs)对奶牛乳腺炎来源的金黄色葡萄球菌生长的影响,首先分离纯化来自奶牛乳腺炎病例中的金黄色葡萄球菌,并通过比浊法测定其在细胞用培养基中的生长曲线,进一步通过将金黄色葡萄球菌与奶牛脂肪间充质干细胞共培养及体外平板计数法来探讨奶牛脂肪间充质干细胞对金黄色葡萄球菌体外增殖的作...     

Notch信号通路在体外培养的鹿茸干细胞中的表达

Notch信号通路是一条进化上十分保守的信号转导系统,在调节干细胞增殖、分化和凋亡方面起到重要作用。研究表明,鹿生茸区骨膜和角柄骨膜分别含有鹿茸发生和再生的干细胞。应用RT-PCR的方法对离体培养生茸区骨膜和角柄骨膜细胞进行检测,得出Notch信号通路各信号因子在2种细胞中的表达情况。结果:Notch-1、Notch-2、Notch-4、Dll-4J、agged-1J、agged-2、Hes-1等信号因子在这2种干细胞中均有不同程度的表达,说明Notch信号通路可能参与了他们的增殖、分化的调控。     

梅花鹿Thymosin beta 10基因的原核表达、活性鉴定和多克隆抗体制备

为研究梅花鹿Thymosin beta 10基因(Tβ10)在鹿茸快速生长过程中的作用,利用Gateway技术构建梅花鹿Tβ10基因的原核表达载体—pDEST17-Tβ10并诱导表达,对融合蛋白进行功能检测及多克隆抗体制备。结果表明:1)获得了190bp Tβ10基因开放阅读框序列,并获得重组表达载体pDEST17-Tβ10。2)pDEST17-Tβ10在宿主BL21-SI中诱导表达条件为0.3mol/L NaCL诱导2h,获得产物的最终浓度为0.50mg/mL。3)制备的Tβ10蛋白多克隆抗体血清效价在105之上,该抗体可以特异性结合天然和原核表达的Tβ10蛋白。4)离体检测发现,Tβ10融合蛋白一方面可以促进人脐静脉内皮细胞增殖,另一方面可以抑制鹿茸前成软骨区细胞的增殖。综上所述,本研究获得了具有生物活性的Tβ10融合蛋白,并制备了高度特异性的梅花鹿Tβ10蛋白多克隆抗体,为深入研究Tβ10基因的生物学功能奠定了基础。     

慢病毒介导的CRISPR/Cas9敲除TGF-β1基因对鹿茸软骨细胞增殖的影响

为探究TGF-β1基因在鹿茸快速生长期的作用,利用慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因编辑技术,设计并构建3条靶向梅花鹿TGF-β1基因第1外显子的gRNA寡核苷酸序列,在人胚肾细胞293T内进行慢病毒包装,通过neo抗性筛选稳转细胞株。提取稳转细胞株总蛋白,经BCA法测定总蛋白质量浓度,Western Blot检测TGF-β1蛋白的相对表达水平;MTT法检测TGF-β1基因敲除对鹿茸软骨细胞体外增殖的影响。结果表明:成功构建了靶向梅花鹿TGF-β1的CRISPR/Cas9基因敲除载体p BOBI-gRNA2。TGF-β1基因的缺失抑制了鹿茸软骨细胞的体外增殖。     

奶山羊乳腺上皮细胞与骨髓间充质干细胞混合培养下最适共培养体系的建立

[目的]研究乳腺上皮细胞与骨髓间充质干细胞混合培养促进细胞增殖作用的机制,提高奶山羊乳腺上皮增殖水平.[方法]采用分离培养的1月龄健康萨能奶山羊乳腺上皮细胞和骨髓间充质干细胞,分别设乳腺上皮细胞单纯培养组和不同比例的乳腺上皮细胞与骨髓间充质于细胞混合培养组,培养24、48、72、96、120和168 h时观察各组细胞的生长状态并检测细胞增殖率和贴壁率.[结果]混合培养组增值率和贴壁率比单纯培养组高,且细胞扁平时间晚于单纯培养组,混合培养体系可促进BMEC的增殖,减缓细胞凋亡.当BMEC与BMSCs以2∶1的比例混合培养到96 h时细胞的增值率和贴壁率最高.[结论]奶山羊乳腺上皮细胞和骨髓间充质干细胞共培养体系能够减缓乳腺上皮细胞的凋亡,促进乳腺上皮细胞增殖,提高细胞贴壁率.最佳共培养浓度为2:1,最佳作用时间为96 h.     

山慈菇提取液对小鼠4T1乳腺癌细胞抑制作用机制的研究

探索山慈菇提取液对小鼠4T1细胞抑制作用机制。采用水煎法制备山慈菇提取液,MTT比色法检测小鼠4T1细胞的增殖活性,Annexin V/PI双染流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡。结果表明,山慈菇提取液对4T1细胞有明显的增殖抑制作用(P0.05),并呈剂量依赖关系。山慈菇提取液诱导小鼠4T1细胞凋亡效果明显,并有剂量依赖性。山慈菇提取液对小鼠乳腺癌细胞有明显的增殖抑制和诱导其细胞凋亡的作用。     

IGF1对生长30d鹿茸的体外培养鹿茸生长中心干细胞的影响

【研究目的】利用细胞培养技术，探讨胰岛素样生长因子（IGF1）对生长30d的鹿茸体外培养不同代数梅花鹿鹿茸生长中心干细胞（鹿茸干细胞）的影响；【方法】原代分离、培养生长30d的鹿茸的梅花鹿鹿茸干细胞．将第2代、5代、8代鹿茸干细胞经含有不同浓度的IGF1（0，1，3，和10nM）作用后，在培养24h后用3H．胸腺嘧啶核苷测定法检测每分钟衰变数（DPM）值；【结果】取材于生长30d鹿茸的干细胞，全部IGF1处理组（1，3，10nM）都显著高于对照组（0nM）（p〈0．01）。3个不同浓度IGFI处理组的平均值和最高值都是离体培养2代的细胞最低（分别为2987和3743DPM／mg蛋白），而培养5代的细胞最高（分别为10320和12180DPM／mg蛋白）．第8代的细胞又开始下降（分别为8754和11568 DPM／mg蛋白）；【结论】IGF1能够促进鹿茸干细胞分裂增殖，生长30d鹿茸的干细胞在离体培养，不同培养时期的鹿茸干细胞对IGF1刺激的敏感度不同。     

番茄红素通过下调异柠檬酸脱氢酶1诱导胃癌细胞凋亡

目的 探究番茄红素对胃癌细胞增殖和凋亡的影响及其可能机制.方法 不同剂量番茄红素处理胃癌细胞株SGC-7901、MGC-803,用MTT法检测细胞增殖,Hoechst 33258染色、流式细胞仪检测细胞凋亡、线粒体膜电位(MMP)、活性氧(ROS),免疫印迹检测异柠檬酸脱氢酶1(IDH1)、IDH2蛋白表达.结果 番茄红素呈剂量依赖性抑制SGC-7901、MGC-803细胞增殖.大于25 μmol/L番茄红素诱导SGC-7901细胞凋亡,增加ROS水平;50 μmol/L番茄红素降低MMP,下调IDH1蛋白表达(P＜0.01或0.05).结论 番茄红素可抑制胃癌细胞增殖、诱导凋亡;促凋亡机制可能是通过下调IDH1,阻断细胞ATP生成和提高细胞内ROS.     

鹿茸干细胞内[Na+]测定及其影响因素鉴定

为探索鹿茸的形态发生与鹿茸干细胞(包括发生干细胞和再生干细胞)内[Na~+]的关系有关,以鹿茸干细胞为模型,研究不同干性的哺乳动物干细胞内[Na~+]的差异,并鉴定引起这种差异的电压门控性钠离子通道(NaV)因素。采集并培养具有不同干性的梅花鹿鹿茸干细胞,包括生茸区骨膜细胞(AP细胞,鹿茸发生干细胞)和角柄骨膜细胞(PP细胞,鹿茸再生干细胞,其干性低于AP细胞),以鹿普通脸部骨膜细胞(FP细胞)作为对照,并采用CoroNa染色方法,通过荧光强度来分析不同类型细胞内[Na~+]的差异,结合PCR方法鉴定转录水平上NaV基因的差异,并分别用睾酮和MS-222对细胞进行处理,观测其对细胞内[Na~+]的影响。结果表明:鹿茸干细胞内[Na~+]高于FP细胞,其中AP细胞内[Na~+]高于PP细胞;NaV1.1基因在AP细胞中特异性转录;睾酮对这3种细胞内[Na~+]水平没有显著影响;但是,MS-222处理能够在一定程度上降低细胞内[Na~+]。本研究发现:鹿茸干细胞内[Na~+]与其干性一致,干性高的AP细胞内[Na~+]也相对较高;NaV1.1基因在转录水平上的差异,可能是造成AP细胞内[Na~+]高的主要原因;干扰NaV的MS-222能够在一定程度上降低细胞内[Na~+]。说明哺乳动物器官的发生和再生可能与低等动物器官上的发现类似,都与细胞内[Na~+]有关。     

款冬花多糖对肺腺癌A549细胞生长及凋亡的影响

目的观察款冬花多糖对人非小细胞肺癌A549生长及凋亡的影响,探讨其体外的抗肿瘤效应。方法体外培养A549细胞,以不同浓度的款冬花多糖为实验组,并设对照组,CCK8法测细胞增殖抑制效应、荧光倒置显微镜观察药物对细胞凋亡的影响,流式细胞术检测A549细胞中P53和Bcl-2蛋白表达情况。结果不同浓度款冬花多糖作用A549细胞24h增殖抑制明显(P<0.05),其抑制效应具有剂量依赖的特点并可诱导A549细胞凋亡,同时上调p53基因表达、下调bcl-2基因表达(P<0.05)。结论款冬花多糖可抑制A549细胞的生长且增殖抑制效应具有剂量依赖性,并可诱导肿瘤细胞凋亡,其抗肿瘤效应可能与细胞凋亡相关基因表达的调控有关。     

大黄素抑制宫颈癌Hela细胞增殖与诱导凋亡的研究

研究大黄素对宫颈癌Hela细胞的增殖与凋亡的影响。通过MTT法检测Hela细胞的存活率,Annexin V-FITC/PI双染法及流式细胞术检测Hela细胞凋亡,蛋白质免疫印记法检测p-JNK、JNK、Bcl-2、pro-caspase-9、cleaved-caspase-3蛋白的表达。大黄素对Hela细胞的增殖抑制效果呈浓度依赖性。Annexin V-FITC/PI双染和流式细胞术结果表明大黄素能够诱导Hela细胞凋亡。蛋白质免疫印记法表明,随着药物处理时间的增加,p-JNK、cleaved-caspase-3的蛋白质表达量逐渐增加,Bcl-2、procaspase-9的蛋白表达量逐渐减少。在实验条件下,大黄素可以抑制Hela细胞的增殖,诱导细胞凋亡。     

甘草查尔酮A衍生物对结肠癌细胞增殖及凋亡的影响

探讨甘草查尔酮A衍生物4′-甲基-2,4-二羟基查尔酮对结肠癌细胞增殖抑制及诱导凋亡的作用,并分析相关作用机制。通过体外培养人结肠癌HT29、HCT116、COLO205和SW480细胞,取对数生长期各细胞,随机分为对照组和10、20、40μmol·L-1 4′-甲基-2,4-二羟基查尔酮试验组,用MTT法检测细胞增殖抑制率,并确定IC50。选取抑制效果最好的结肠癌细胞,利用Hoechst 33258荧光检测及流式细胞术检测细胞凋亡情况;利用蛋白免疫印迹法检测凋亡相关蛋白Fas、FasL、Caspase-8的蛋白表达水平。结果表明:与空白组相比,药物组各浓度均可引起结肠癌细胞的增殖抑制作用(P0.01,P0.05),其中对HCT116的抑制效果最好(IC50为14.24μmol·L-1)。Hoechst 33258荧光和流式细胞术检测结果显示,随给药浓度增高,HCT116细胞凋亡逐渐增多(P0.05),并可引起Fas、FasL和Caspase-8的蛋白表达增多(P0.05)。说明4′-甲基-2,4-二羟基查尔酮可抑制结肠癌细胞增殖并诱导凋亡发生,其作用机制与上调Fas/FasL通路蛋白表达水平有关。     

鹿茸干细胞p21基因表达水平及其对细胞周期的影响

为初步探讨p21基因在基于鹿茸干细胞的鹿茸再生过程中所起的生物学作用,本研究利用qRT-PCR以及流式细胞术,以鹿脸部骨膜细胞(FPCs)为对照组,对鹿茸干细胞的生茸区骨膜细胞(APCs)和角柄骨膜细胞(PPCs)中p21基因mRNA表达水平和细胞周期分布进行了检测。进一步通过RNAi干扰技术,抑制APCs中p21基因表达水平,验证其对细胞周期分布的影响。结果表明,鹿茸干细胞中p21基因mRNA表达水平显著高于对照组细胞(APCs PPCs FPCs,P 0.05);相对于对照组细胞,鹿茸干细胞周期分布没有显著差异;低表达p21基因的APCs细胞周期无显著变化,说明p21基因表达水平的变化对鹿茸干细胞周期无直接影响。本研究为深入揭示该基因在鹿茸干细胞中高表达所起的生物学作用奠定了基础。     

梅花鹿鹿茸细胞端粒酶活性及其mRNA表达的检测

[目的]研究鹿茸生长期端粒酶的表达,为揭示鹿茸生长发育的调控机制提供了新思路。[方法]在鹿茸快速生长阶段,采用改进的TRAP（端粒重复序列扩增技术）法检测鹿茸顶端增殖区的间充质层、前软骨层和软骨层细胞及下端成熟区的端粒酶活性。同时,采用RT-PCR的方法检测各组织细胞中端粒酶催化亚基（TERT）mRNA的表达水平。[结果]在顶端增生区各组织细胞中均检测到了不同程度的端粒酶活性,间质细胞、前软骨细胞和软骨细胞中的相对端粒酶活力分别为91.2、46.4和13.7,而在成熟区组织中则检测不到端粒酶活性。RT-PCR法检测的各组织细胞中TERTmRNA的表达水平与端粒酶活性检测结果一致。[结论]在鹿茸快速生长阶段,其增殖区表达端粒酶,并且端粒酶活性随组织层细胞的分化程度的增高而逐渐降低,说明端粒酶可能在鹿茸的生长过程中起重要的调控作用。     

microRNA介导的IGF1基因沉默对鹿茸软骨细胞增殖的影响

【目的】构建靶向梅花鹿胰岛素样生长因子1基因(IGF1)的microRNA真核表达载体,研究microRNA介导的IGF1基因沉默对鹿茸软骨细胞增殖的影响。【方法】根据IGF1mRNA序列设计并合成4对premicroRNA前体片段,定向克隆于pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR真核表达载体中,构建重组质粒pcDNA6.2-Gw/EmGFP-IGF1-miR-1、pcDNA6.2-Gw/EmGFP-IGF1-miR-2、pcDNA6.2-Gw/EmGFP-IGF1-miR-3和pcDNA6.2-Gw/EmGFP-IGF1-miR-4;测序分析插入序列的完整性,将重组质粒转染鹿茸软骨细胞,利用相对荧光定量PCR技术检测IGF1mRNA的表达量;在此基础上选择表达量最低的pcDNA6.2-Gw/EmGFP-IGF1-miR重组质粒转染鹿茸软骨细胞,Western blotting分析IGF1蛋白的表达水平,MTT法和流式细胞仪检测重组质粒对鹿茸软骨细胞体外增殖和细胞周期的影响。【结果】测序结果显示,构建的4组重组质粒插入片段的碱基序列完全正确。转染pcDNA6.2-Gw/EmGFP-IGF1-miR重组质粒后,鹿茸软骨细胞中IGF1mRNA的表达水平均有所下降,其中转染重组质粒pcDNA6.2-Gw/EmGFP-IGF1-miR-2组的表达水平最低,因而筛选重组质粒pcDNA6.2-Gw/EmGFP-IGF1-miR-2为最佳干扰质粒。与对照组相比,IGF1蛋白的表达水平降低;重组质粒pcDNA6.2-Gw/EmGFP-IGF1-miR-2转染组鹿茸软骨细胞的增殖受到抑制,细胞周期S期细胞百分比减少,表明鹿茸软骨细胞停滞在G0/G1期。【结论】梅花鹿IGF1的表达水平受miRNA的调控,表明在鹿茸快速生长过程中,miRNA具有重要的调控作用。