金银染色三抗体夹心法检测兔出血症病毒(RHDV)抗原

成功地建立了检测兔出血症病毒(RHDV)抗原的金银染色(SECGA)三抗体夹心法,并确定了试验流程中鼠抗RHDV-IgG(110)、兔抗RHDV-IgG(1160)、金标羊抗兔IgG(150)等三项的最佳工作浓度及最适显影时间(20 min).实验结果表明,本法除了具有Dot-ELISA的高度特异性外,还具有抗原量少、敏感性高、不参与3,3-二氨基联苯胺盐酸盐等有害物质、实验结果更可靠等优点,适合于现场推广应用,并为兔出血症的诊断提供可靠的实验手段.     

检测兔出血症病毒抗体间接ELISA方法的建立

为建立检测兔出血症病毒(RHDV)抗体的间接ELISA方法,应用杆状病毒表达系统表达的RHDV VP60包被酶标板,经间接ELISA的最佳反应条件优化试验确定:抗原的包被浓度为4.62μg/ml,标准阴、阳性血清稀释度为1∶200,封闭液选用2%明胶;羊抗兔IgG最佳稀释度为1∶4 000。阻断试验、特异性试验、敏感性试验、重复性试验结果显示,该方法具有较高的特异性、敏感性和重复性。用建立的ELISA方法与血凝抑制试验对临床血清样品进行检测,结果显示,ELISA与HI检测兔血清的RHDV抗体阳性率分别为84.7%(955/1 127)和76.0%(857/1 127),符合率为91.3%。该方法的建立为检测RHDV抗体提供了一种安全、特异、敏感、快速、操作简便经济的检测方法,为兔出血症免疫监测和预防控制提供了科学的技术手段。     

兔出血症病毒1、2型双重TaqMan探针荧光定量PCR检测方法的建立和应用

兔出血症(rabbit hemorrhagic disease, RHD)是由兔出血症病毒(rabbit hemorrhagic disease virus, RHDV)引起的欧洲兔(Oryctolagus cuniculus)的急性致死性传染性疾病。RHDV属于杯状病毒科(Calicivirus)兔病毒属(Lagovirus)。目前兔出血症病毒1型(GI.1)和兔出血症病毒2型(GI.2)2种基因型均有在我国流行。为了更好地进行流行病学调查、实时监测兔出血症发展趋势和临床诊断，建立了一种检测RHDV1型和RHDV2型病原的快速、简单、特异且敏感的TaqMan实时PCR。结果显示，稀释度为1×10⁸～1×10⁴ copies/μL标准品建立的标准曲线有良好的线性关系，决定系数r²为0.999;该方法对RHDV1型和RHDV2型具有高度特异性，与兔多杀性巴氏杆菌、兔支气管败血波氏菌等其他病原没有任何交叉反应；检测灵敏度为100～1 000 copies/μL;组内和组间变异系数在0.01%～1.61%之间。用该方法对60份...     

不同日月龄兔感染RHDV后圆小囊的比较病理学观察

为探讨圆小囊在免体全身抗感染免疫中的功能作用，采用组织病理学及免疫组织化学方法，对比观察了2日龄、1月龄及2月龄实验免感染RHDV后圆小囊的病理变化，同时采用ELISA方法对实验兔的血清及肝、肾、脾中的RHDV含量进行了测定，重点对实验兔圆小囊黏膜上皮内淋巴细胞(IEL)进行了统计比较，结果显示：2月龄以内兔人工感染RHDV后，临症表现、剖检及组织病理学观察均未见异常。血清及RHDV的靶器官肝、脾、肾中均未检测出RHDV抗原。2月龄以上兔感染RHDV后，无论从临床症状，还是大体剖检，组织病理学观察，均出现了明显的病理学改变，而且感染后血清RHDV抗原检测呈阳性反应。圆小囊、肝、脾、肾等组织器官都呈现RHDV免疫组化强阳性反应。2月龄以内的乳兔及仔兔感染RHDV后，圆小囊虽未出现明显的形态结构改变，免疫组化染色也未见RHDV抗原阳性反应物，但IEL明显增多，2日龄兔IEL由1．2％增加到4．2％；1月龄兔的IEL由10．1％增加到26．1％。1月龄仔兔还表现出固有层中淋巴细胞明显增多。     

抗兔病毒性出血症病毒单克隆抗体的制备

通过抗兔病毒性出血症病毒(RHDV)杂交瘤细胞株的筛选,其中一株连续克隆3次,在培养瓶中传代1个月,用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定,分泌单克隆抗体(McAb)性能稳定。杂交瘤细胞株的小鼠腹水滴度为1:1600～1:3200。利用McAb腹水作一抗,经免疫荧光检测RHDV感染的细胞片,可发现细胞核内有特异性荧光颗粒,滴度为1:200。杂交瘤细胞株染色体的分析,染色体数在98±10,符合杂交瘤细胞株的特征。经琼脂扩散法对McAb亚类的分析测定结果与抗鼠IgG和IgG_3出现沉淀线。     

兔出血症病毒VP60主要抗原表位的原核表达及其免疫原性

[目的]研究兔出血症病毒（RHDV）VP60主要抗原表位基因原核表达蛋白的免疫原性。[方法]采用RT-PCR方法扩增了RHDV衣壳蛋白VP60主要抗原表位基因。以pET-28b（＋）为表达载体,在E.coliRosetta菌株中表达重组蛋白。通过Western blot分析和接种家兔检测了重组蛋白的免疫原性。[结果]经Western blot检测,在相对分子量24.0k Da处出现特异性的反应带。以纯化的重组蛋白制备的抗血清可以与纯化的RHDV发生特异性的ELISA反应。[结论]RHDV VP60主要抗原表位的原核表达产物具有较好的免疫原性。     

兔出血症病毒新毒株RHDV2的流行与控制(综述)

兔出血症病毒(RHDV)可引起兔病毒性出血症(RHD)。RHD是一种急烈性、高度致死性兔传染病,给家兔养殖业造成巨大经济损失。2010年,研究人员在法国兔场发现一种新型兔出血症病毒RHDV2。与经典RHDV不同,该毒株能够感染幼龄家兔,甚至跨物种感染野兔,并突破经典RHDV疫苗的免疫防线,迅速在世界范围内流行。目前我国还未有RHDV2的报道,但随时面临发生该疫情的风险。本文综述RHDV2的病原学、流行病学特征、临床症状、诊断和防控等方面的研究进展,旨在提高对RHDV2的认识,加强对RHDV2的监测,提前做好防控措施。     

兔病毒性出血症Dot-IGSS检测方法的建立

[目的]建立一种检测兔病毒性出血症IgG抗体的斑点免疫金银染色法（Dot—IGSS）。[方法]选择抗原包被浓度20μg/ml,被检血清稀释度1：160;鼠抗兔IgG稀释度1：200、金标羊抗鼠IgG稀释度1：20的工作条件,用所建立的Dot—IGSS与血凝抑制试验（HI）对96头份被检血清进行平行检测。[结果]Dot—IGSS和HI的检测阳性率分别为94％和31％。[结论]所建立的Dot—IGSS是一种灵敏、特异和稳定的血清学捡测方法,适用于兔病毒性出血症的诊断和抗体检测。     

原核表达的兔出血症病毒衣壳蛋白对兔的免疫保护效果

 为了检验大肠杆菌表达的兔出血症病毒（RHDV）衣壳蛋白（VP60）对兔的免疫保护效果，将34只清洁兔随机分成3组：单用免疫佐剂对照组（8只）、单用重组VP60组（8只）和重组VP60加免疫佐剂组（18只），分别经皮下注射，VP60的免疫剂量为每只每次400 μg，免疫2次，间隔7 d。在第2次免疫7 d后，VP60加免疫佐剂组的兔血清抗体水平显著高于单用VP60免疫组（ELISA 1∶64 000 对比1∶4 000 / HI 1∶128 对比1∶16），表明免疫佐剂可明显加速重组VP60诱导抗体产生的进程，用RHDV NJ85强毒攻击，免疫佐剂对照组与单用VP60免疫组的实验兔均全部死亡（8/8和8/8），VP60加免疫佐剂组均全部存活，保护率为100%（18/18）。用RHDV血凝试验（HA）检测，死亡兔的肝脏组织液HA效价大于1∶512，而存活兔的肝脏组织液HA效价小于1∶2，肝脏组织触（涂）片检查和细菌培养均为阴性，证明病死兔系RHDV感染所致。用RHD重组亚单位疫苗在养兔场进行800只兔的田间免疫试验，安全有效，没有出现不良反应。对重组菌进行冻存、复苏、培养、诱导表达和质粒酶切分析，证明VP60基因在宿主菌内保持稳定。     

兔出血症病毒VP60蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

以纯化的重组兔出血症病毒核衣壳蛋白(VP60)为抗原,免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤细胞技术制备抗衣壳蛋白的单克隆抗体,获得了2株能稳定分泌抗VP60蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株(AE11和AH4).分别利用Western blot、间接ELISA和间接免疫荧光(IFA)等方法对单抗的免疫活性和特异性进行检测,结果证明,此两株单抗均能识别重组的VP60和天然病毒的衣壳蛋白,而IFA结果显示只有AE11能和RHDV反应,可观察到强烈的特异性绿色荧光,表明成功制备了抗RHDV的VP60特异性单抗.     

兔病毒性出血症灭活疫苗的制备、保存、使用方法及注意事项

1 病况概述 兔病毒性出血症(俗称兔瘟)是由兔出血症病毒(RHDV)所引起的一种兔的急性、败血性传染病。本病具有潜伏期短、发病急、传播迅速、流行面积广、发病率和致死率均很高等特点。我国于1984年首先在江苏发现并报道本病,以后相继在全国各地流行。给养兔生产造成了重大损失。本病一年四季均可发     

兔出血症病毒衣壳蛋白VP60主要抗原域基因的克隆

从人工感染兔出血症病毒(Rabbithemorrhagicdiseasevirus, RHDV)致死的兔肝脏组织中粗提病毒,采用SDS 蛋白酶K法提取RHDVRNA作为扩增摸板,根据Genbank已发表的RHDV的核酸序列,自行设计了 1对引物,进行RT PCR扩增,获得RHDVVP60的主要抗原域片段。经琼脂糖凝胶电泳分析其大小约为1 393bp,将扩增产物提纯后克隆至PET 32α( )载体质粒中,经转化和进一步筛选,酶切鉴定证实获得了RHDVVP60主要抗原域基因的克隆,从而为该基因的表达和基因工程疫苗的研制奠定了基础。     

免病毒性出血症、巴氏杆菌病二联蜂胶灭活苗的研制

应用兔出血症病毒(RHDV)和巴氏杆菌(Pm)联合研制而成的蜂胶佐剂灭活苗，用1mL免疫试验兔，免疫后第5d，对RHDV保护率达100％(5／5)；免疫后第14d，对巴氏杆菌的保护率达100％(4／4)，第7d即产生较强的免疫力。T细胞总玫瑰花环形成率(Et率)、活性玫瑰花环形成率(Ea率)的测定结果表明：蜂胶具有提高机体细胞免疫功能的作用；通过HI法监测兔病毒性出血症抗体水平，结果表明：蜂胶苗产生抗体时间较早，第7d抗体效价可达到较高水平(2^6.8)，第21d达到高峰(2^8.8)。     

简述兔出血症疫苗的生产流程

正目前用于预防兔出血症的疫苗主要有兔病毒性出血症组织灭活疫苗、兔出血症-巴氏杆菌二联灭活疫苗和兔出血症-巴氏杆菌-魏氏梭菌三联灭活疫苗。兔出血症-巴氏杆菌二联灭活疫苗最常用。1兔出血症组织灭活疫苗1.1种毒从自然发病死亡兔中分离鉴定。0.5ml能使青年兔100%死亡。HA效价14log2以上。具有兔病毒性出血症的典型特征。1.2制造要点选择非免疫的健康青年兔,人工接种RHDV强毒,接种剂量0.5ml/只,肌肉注射。无菌采取死亡兔的肝脏、脾     

兔出血症病毒单克隆抗体的抗原识别位点分析

通过ＥＬＩＳＡ迭加试验对５株抗兔出血症病毒（ＲＨＤＶ）单克隆抗体（ＭｃＡｂ）的抗原表位进行了分析。抗体反应增值结果表明，６株单抗分别针对３类不同的抗原决定簇。ＣＧ４－１、ＣＨ３－１和ＡＡ８－１针对病毒结构多肽上的同一决定簇，ＣＦ２－１和ＲＭ－１７针对另一决定族，而ＲＭ－１４针对第３种决定簇；其识别表位可能与ＡＡ８－１非常接近。单抗的识别表位与其生物学活性密切相关。     

兔出血症病毒YL株衣壳蛋白VP60基因在原核系统中的高效表达

为了在原核系统中高效表达兔出血症病毒(RHDV)衣壳蛋白VP60,应用RT-PCR方法从兔出血症病毒(RHDV)西北分离株YL中克隆出了衣壳蛋白VP60基因并测序,结果显示,YL株VP60基因全长1740 bp,GC含量为55.3%,已在GenBank中注册(登录号为DQ530363),VP60基因与中国RHDV最早期分离株WX84的VP60基因核苷酸序列同源性为93.0%,氨基酸序列同源性为95.8%。构建成功YL株VP60基因原核表达载体VP60-pET32a,转化到大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中。1 mmol/L IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测结果显示,VP60融合蛋白分子质量约为75 ku,其表达量占总菌体蛋白的39.8%。Western blot检测结果表明,VP60融合蛋白可以和RHDV抗血清发生特异反应。本研究结果显示,兔出血症病毒在干旱半干旱条件下的遗传变异和免疫学特征无较大变化。     

兔出血症病毒浙江分离株核衣壳蛋白基因的克隆及遗传变异分析

【目的】探讨兔出血症病毒的遗传变异情况,为兔病毒性出血症的防治提供理论资料。【方法】对1989~2006年7株兔病毒性出血症病毒(RHDV)浙江分离株的核衣壳蛋白基因(VP60)进行了克隆与测序,同时利用分子生物学软件将其与国内外RHDV的基因组序列进行了比对和分析,并绘制了系统发生树。【结果】此7株RHDV的VP60基因均由1 740个核苷酸组成,编码580个氨基酸,其与参考序列之间的氨基酸同源性为94.0%~99.8%;系统发生树分析显示,所选的RHDV分离株可分为2个基因群,每个基因群又可分为两个亚群,其中中国分离株主要位于C亚群,与欧洲分离株的遗传距离较近,基因群之间的遗传距离有逐渐加大的趋势。【结论】RHDV在长期流行与演化过程中存在一定的遗传变异趋势。     

兔出血症病毒2型的VP60基因保守区人工合成及RT-PCR检测方法初探

为建立用于兔出血症病毒2型(RHDV2)的快速检测方法,根据GenBank已公布的RHDV和RHDV2 VP60基因,设计合成2对特异性引物和10条末端重叠引物,通过重叠PCR 人工合成RHDV2 VP60基因中保守区片段,构建重组质粒,并以其为模板,经过反应条件优化、敏感性试验、特异性试验和35份样品检测应用,初步建立RHDV2 RT-PCR检测方法。实验成功合成RHDV2 VP60基因的435 bp保守片段并构建了pMD-19T-RHDV2重组质粒, 初步建立的RHDV2 RT-PCR方法具有良好的特异性和敏感性,RHDV2的检测限度可达到230个拷贝的靶基因片段,检测RHDV、pGM-T-EBHSV(已构建)、兔巴氏杆菌、兔源大肠埃希菌和沙门氏菌均无特异性扩增,样品检测结果显示样品中RHDV2核酸阴性。该研究为中国及时进行RHDV2的防控提供技术储备。     

兔病毒性出血症、巴氏杆菌病二联蜂胶灭活苗的研制

应用兔出血症病毒(RHDV)和巴氏杆菌(Pm)联合研制而成的蜂胶佐剂灭活苗,用 1 mL 免疫试验兔,免疫后第 5d,对 RHDV 保护率达 100%(5/5);免疫后第 14d,对巴氏杆菌的保护率达 100%(4/4),第 7d 即产生较强的免疫力。T 细胞总玫瑰花环形成率(Et率)、活性玫瑰花环形成率(Ea率)的测定结果表明:蜂胶具有提高机体细胞免疫功能的作用;通过 HI 法监测兔病毒性出血症抗体水平,结果表明:蜂胶苗产生抗体时间较早,第 7d 抗体效价可达到较高水平(26.8),第 21 d 达到高峰(28.8)。