表达大肠杆菌K88ac-ST1-LTB融合蛋白工程菌株的免疫原性研究

已构建的能表达大肠杆菌K88ac-ST1-LTB融合蛋白的工程菌株BL21（DE3）（pXKST3LT5)及其表达产物经动物试验证实没有毒性反应。用从IPTG诱导的工程菌中提取的包涵体或经甲醛灭活的工程菌制成抗原，免疫小鼠，结果免疫小鼠至少能抵抗2MLD的大肠杆菌强毒株C83902（K88ac,ST^ ,L^ )的攻击，用提取的包涵体免疫家兔后，采集的血清能够中和天然ST1的毒性，这表明构建的工程菌株BL21（DE3）（pXKST3LT5)可以作为预防幼畜大肠杆菌性腹泻基因工程菌苗的候选株。     

大肠杆菌肠毒素ST1—LTB融合基因的高效表达

用限制性核酸内切酶Ｅｃｏ ＲⅠ和ＨｉｎｄⅢ双酶切含大肠杆菌肠毒素ＳＴ１－ＬＴＢ融合基因的质粒ｐＸＳＬＴ１,回收０．８４ｋｂ的ＳＴ１－ＬＴＢ融合基因,再将载体ｐＥＴ－２８ｂ（＋）用ＥｃｏＲⅠ和ＨｉｎｄⅢ双酶切,然后将其与ＳＴ１－ＬＴＢ融合基因连接,转化至受体菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中。经ＥｃｏＲⅠ,ＨｉｎｄⅢ,ＢａｍＨⅠ酶切反应鉴定重组子质粒,得到了理想重组质粒ｐＸＥＴ－ＳＬＴ１。     

表达大肠杆菌肠毒素ST1-LTB融合蛋白双价基因工程菌株的构建

重组菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＸＥＴＳＬＴ１）经ＩＰＴＧ诱导后,其表达产物经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和ＥＬＩＳＡ检测,结果表明重组菌株可以高效表达大肠杆菌肠毒素ＳＴ１－ＬＴＢ 融合蛋白,该融合蛋白占菌体总蛋白的３３．２１％ ,而且已失去天然ＳＴ１肠毒素生物毒性。用从ＩＰＴＧ 诱导的工程菌中提取的包涵体或经甲醛灭活的工程菌制成抗原免疫小鼠,结果免疫小鼠至少能抵抗１．５ＭＬＤ 的大肠杆菌强毒株Ｃ８３９０２（Ｋ８８ａｃ,ＳＴ＋ ,ＬＴ＋ ）的攻击。用提取的包涵体免疫家兔后,采集的血清能够中和天然ＳＴ１肠毒素的毒性。这表明构建的工程菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＸＥＴＳＬＴ１）可以作为预防幼畜大肠杆菌性腹泻基因工程菌苗的候选株     

大肠杆菌肠毒素ST1-LTB融合基因的高效表达

用限制性核酸内切酶ＥｃｏＲⅠ和ＨｉｎｄⅢ双酶切含大肠杆菌肠毒素ＳＴ１—ＬＴＢ融合基因的质粒ｐＸＳＬＴ１,回收０８４ｋｂ的ＳＴ１—ＬＴＢ融合基因,再将载体ｐＥＴ—２８ｂ（＋）用ＥｃｏＲⅠ和ＨｉｎｄⅢ双酶切,然后将其与ＳＴ１—ＬＴＢ融合基因连接,转化至受体菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中。经ＥｃｏＲⅠ、ＨｉｎｄⅢ、ＢａｍＨⅠ酶切反应鉴定重组子质粒,得到了理想重组质粒ｐＸＥＴＳＬＴ１。重组菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＸＥＴＳＬＴ１）经ＩＰＴＧ诱导后,其表达产物经ＳＤＳ—ＰＡＧＥ和ＥＬＩＳＡ检测,结果表明重组菌株可以高效表达ＳＴ１—ＬＴＢ融合蛋白,该融合蛋白占菌体总蛋白的３３２１％,而且无天然ＳＴ１生物毒性。     

大肠杆菌K88ac-ST1-LTB三价基因工程菌株的构建

利用PCR技术,从大肠杆菌C83902质粒中扩增出K88ac基因、ST1突变基因和LTB基因,通过分离、纯化、内切酶酶切、连接和转化,构建了含K88ac-ST1-LTB融合基因表达载体的重组菌株BL21(DE3)(pXKST3LT5).经酶切鉴定和DNA序列分析证实,构建的重组质粒pXKST3LT5中含有K88ac-ST1LTB融合基因,且基因序列和阅读框架均正确.免疫试验结果表明,K88ac-ST1-LTB融合蛋白能够诱发机体产生抗体,该抗体具有中和天然ST1肠毒素毒性的作用.用从IPTG诱导的工程菌中提取的包涵体或经甲醛灭活的工程菌制成抗原免疫小鼠,结果免疫小鼠至少能抵抗2 MLD的大肠杆菌强毒株C83902(K88ac,ST+,LT+)的攻击.由此表明,构建的工程菌株BL21(DE3)(pXKST3LT5)可以作为预防幼畜大肠杆菌性腹泻的基因工程菌苗的候选株.     

表达CPB—ST融合蛋白工程菌株的免疫原性研究

已构建的能表达产气荚膜菌β－毒素和大肠埃希氏菌ＳＴ融合蛋白的基因工程菌株ＢＬ２１（ＤＥ３,ｐＥＣＢ－ＳＴ１）及其表达产物经动物试验证实没有毒性反应。用从ＩＰＴＧ诱导的工程菌株中提取的包涵体和经甲醛灭活的工艺菌株全菌体制备抗原免疫小白鼠,攻毒试验结果表明,免疫小白鼠能分别抵抗１ＭＬＤ的Ｂ型产气荚膜梭菌强毒株和产ＳＴ的大肠埃希氏菌工程菌株ＨＢ１０１（ｐＳＬＭ００４）的攻击。     

产肠毒素大肠杆菌肠毒素LTB、STI和STⅡ融合基因的构建与表达研究

PCR方法扩增产肠毒素大肠杆菌（Enterotoxigenic Escherichia coli,FTEC)LTB、STI、STⅡ基因，将LTB、STI、STⅡ基因重组入pET32a质粒载体，对构建的重组质粒pBST进行酶切分析、PCR检测以及核苷酸序列分析，结果表明，插入片段LTB－STⅡ－STI的核苷酸序列与预期一致，且阅读框正确。pBST在宿主菌BL21（DE3）RIL中的表达产物经SDS－PAGE初步分析，显示重组融合蛋白的分子量约为40kD，其表达量约占菌体总蛋白的46％。     

产肠毒素大肠杆菌肠毒素LTB、STⅠ和STⅡ融合基因的构建与表达研究

PCR方法扩增产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)LTB、STⅠ、STⅡ基因,将LTB、STⅠ、STⅡ基因重组入pET32a质粒载体,对构建的重组质粒pBST进行酶切分析、PCR检测以及核苷酸序列分析,结果表明,插入片段LTB-STⅡ-STⅠ的核苷酸序列与预期一致,且阅读框正确.pBST在宿主菌BL21(DE3)RIL中的表达产物经SDS-PAGE初步分析,显示重组融合蛋白的分子量约为40kD,其表达量约占菌体总蛋白的46%.     

ST1肠毒素基因的合成,克隆及其融合蛋白的高效表达

用ＤＮＡ合成仪合成了编码ＳＴ１肠毒素第５８到７２位氨基酸残基的ＤＮＡ片段,并将其与表达融合蛋白的载体ＰＧＥＭＥＸ－１重组,转化受体菌ＪＭ１０９（ＤＥ－３）筛选出重组克隆经过１ＰＴＧ４小时诱导,ＳＴ１融合蛋白的产量超过细菌蛋白总量的４０％,最高达５９．９％。     

大肠杆菌K99-ST1双价基因工程菌株的构建及其免疫原性

为了有效预防肠毒素性大肠杆菌引起的犊牛和羔羊腹泻,利用基因工程技术构建了融合基因K99-ST1及其原核表达载体,并时融合蛋白进行了初步免疫原性分析.结果显示,将PCR获得的K99菌毛抗原基因和人工合成的ST1基因片段借助pUCm-T载体,成功构建重组质粒pUCm-K99-ST1,从而获得融合基因K99-ST1;使用EcoRⅠ+SalⅠ双酶切将该融合基因定向插入表达载体pET30a中,成功构建表达载体pET-K99-ST1;将该表达载体转入表达菌株BL21(DE3)中,经IPTG诱导得到大小约31 000的蛋白;Western blotting显示,融合蛋白可以特异的与K99阳性血清反应;将BL21(DE3,pET-K99-ST1)诱导表达后免疫兔,ELISA检测K99抗体水平较高,乳鼠灌胃试验显示该菌株免疫后产生ST1抗体.这表明本试验已成功构建大肠杆菌K99-ST1双价基因工程菌株BL21(DE3,pET-K99-ST1),该菌株具有良好的免疫原性,为大肠杆菌K99-ST1双价基因工程疫苗开发奠定了基础.     

表达大肠杆菌耐热性肠毒素1—β半乳糖苷酶融合蛋白菌株的构建

将含大肠杆菌耐热性肠毒素Ｉ（ＳＴＩ）结构基因的质粒ＰＢＳＴ２－６用限制性内切酶ＢａｍＨＩ和Ｂｇ１Ⅱ消化，经３％琼脂糖凝胶电泳分离、透析袋电洗脱法回收１４７ｂｐＳＴＩ基因片段，再将含ＬａｃＺ基因的载体ＰＵＣ１８用ＢａｍＨＩ消化、碱性磷酸酶处理、然后将处理的ＰＵＣ１８ＤＮＡ与１４７ｂｐＳＴ１ＤＮＡ通过Ｔ４ＤＮＡ连接酶酶性进粘末端连接。     

大肠杆菌肠毒素ST1—LTB融合蛋白工程菌株的免疫原性研究

已构建的能表达大肠杆菌肠毒素ＳＴ１ＬＴＢ融合蛋白的工程菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＸＥＴＳＬＴ１）及其表达产物经动物试验证实没有毒性反应。用从ＩＰＴＧ诱导的工程菌中提取的包涵体或经甲醛灭活的工程菌制成抗原,免疫小鼠,结果免疫小鼠至少能抵抗１５ＭＬＤ的大肠杆菌强毒株Ｃ８３９０２（Ｋ８８ａｃ,ＳＴ＋,ＬＴ＋）的攻击。用提取的包涵体免疫家兔后,采集的血清能够中和天然ＳＴ１的毒性。这表明构建的工程菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＸＥＴＳＬＴ１）可以作为预防幼畜大肠杆菌性腹泻基因工程菌苗的候选株。     

大肠杆菌肠毒素ST1—LTB融合基因的构建

用ＢａｍＨＩ和ＨｉｎｄⅢ双酶切含大肠杆菌不耐热肠毒素（ＬＴＢ）基因的质粒ｐＸＬＴ１－１,回收５０５ｂｐ的ＬＴＢ基因片段,再用ＢａｍＨＩ和ＨｉｎｄⅢ双酶切含大肠杆菌耐热肠毒素（ＳＴ１）基因的质粒ｐＸＳＴ１,与上述回收的ＬＴＢ基因片段连接,转化至受体菌ＪＭ１０９中。经ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄⅢ酶切反应鉴定重组子质粒,得到了理想重组子质粒ｐＸＳＬＴ１。ＥＬＩＳＡ检测到了ＳＴ１－ＬＴＢ融合蛋白,而且该融合蛋白无天然ＳＴ１生物毒性。     

鸡大肠杆菌异型外膜蛋白原生质体融合菌株的构建

以鸡大肠杆菌Wwl株(O78，OMP-3．Amp^R，K^5)和WD2株(O2，OMP-1，Amp^5．K^R)作为亲本菌株，采用溶菌酶-EDTA法制备原生质体，以PEG作为助溶剂，进行原生质体融合，得到4株双耐药融合菌株，融合菌株的形态、染色特性和生化特性均符合大肠杆菌的特性，且均能同时表达两个亲本菌株的外膜蛋白(OMP)抗原(OMP-3，OMP-1)和O抗原(O78，O2)．表明两个亲本菌株发生了融合和染色体重组。经多次传代证明融合菌株是稳定的。     

肠毒素性大肠杆菌K99-ST1融合基因的克隆及原核表达

为有效预防肠毒素性大肠杆菌（ETEC）引起的犊牛和羔羊腹泻,将PCR扩增获得的ETECK99菌毛抗原基因和人工合成的ST1基因片段,借助pUCm—T载体,构建了重组质粒pUCm-K99-ST1,从而获得了融合基因K99-ST1;使用EcoRⅠ＋SalⅠ双酶切将该融合基因定向插入表达载体pET-30a中,成功构建了表达载体pET—K99-ST1,将其转入表达菌株BL21（DE3）中,经IPTG诱导,获得31ku的蛋白;Western—blotting结果显示,该融合蛋白可与K99阳性血清发生特异性反应。     

大肠杆菌耐热性肠毒素ST1—LacZ融合基因的构建

利用含大肠杆菌耐热性肠毒素ＳＴ１基因的质粒ｐＢＳＴ２－６和含ＬａｃＺ基因（编码β－半乳糖苷酶）的载体ＰＵＣ１８，构建成ＳＴ１－ＬＡＣＺ融合基因。将质粒ｐＢＳＴ２－６用限制性内切酶ＢａｍＨＩ和ＢｇＩＩＩ消化、碱性磷酸酶处理，最后将处理好的ＰＵＣ１８ ＤＮＡ与１４７ ｂｐＳＴ１ ＤＮＡ通过Ｔ４ＤＮＡ连接酶进行粘性末端连接，转化不受体菌ＤＨ５Ａ中。通过菌落原位杂交筛选，共筛选出５３个为ＳＴ１基因探针杂交     

鸡大肠杆菌异型外膜蛋白原生质体融合菌株的构建

以鸡大肠杆菌Ww1株(O78,OMP-3,AmpR,KS)和WD2株(O2,OMP-1,AmpS,KR)作为亲本菌株,采用溶菌酶-EDTA法制备原生质体,以PEG作为助溶剂,进行原生质体融合,得到4株双耐药融合菌株,融合菌株的形态、染色特性和生化特性均符合大肠杆菌的特性,且均能同时表达两个亲本菌株的外膜蛋白(OMP)抗原(OMP-3,OMP-1)和O抗原(O78,O2),表明两个亲本菌株发生了融合和染色体重组。经多次传代证明融合菌株是稳定的。     

表达大肠肝菌耐热性肠毒素I融合蛋白基因工程菌株的免疫原性研究

已构建的能表达大肠杆菌对耐热怀肠毒素Ｉ（ＳＴ１）－β－半乳糖苷酶融合蛋白基因工程菌株ｃｏｌｉ ＤＨ５α（ｐＸＳＴ１）经乳鼠灌胃试验证实没有毒性反应。采用超声波粉碎法裂解菌体，再辅以氢氧化铝胶制备抗原，免疫接种ＢＡＬＢ／ｃ鼠，获得抗融全蛋白抗体，乳鼠灌胃中和试验结果表明，该抗体能中和天然ＳＴ１肠毒素活性，具有较好的免疫保护作用。以该菌株免疫的雌性ＢＡＬＢ／ｃ鼠产下的乳鼠吮吸初乳后，能够抵抗１个鼠活性     

ST1肠毒素融合蛋白的纯化及部分特性分析

用ＳＡｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－１５０凝胶和ＥＤ－３２离子交换层析,从重组菌ＰＧＥＭＳＴ２株内分离,纯化ＳＴ１,肠毒素融合蛋白,回收的ＳＴ１肠毒素融合蛋白占细菌总蛋白的３１．５％。ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳条件呈一条蛋白带。ＳＴ１肠毒素融合蛋白不溶于甲醇,乳鼠试验阴性。     

仔猪大肠杆菌K88—ST1—LTB三阶基因工程灭活疫苗的应用实验

对妊娠14－16周母猪颈部肌肉注射仔猪大肠杆菌K88－ST1－LTB三价基因工程灭活疫苗（以下简称三价灭活苗）的结果表明：三价灭活苗可以大大降低仔猪大肠杆菌的发病率和死亡率，差异极显著（P＜0．01）；对仔猪生长安全、无副作用；三价灭活苗的使用效果明显优于仔猪大肠杆菌K88－K99双价基因工程灭活疫苗（以下简称双价灭活苗）；疫苗现场应用免疫保护率明显高于双价灭活苗，差异极显著（P＜0．01）。