小立碗藓代谢与发育研究进展

小立碗藓（PhyscomitreUapatens）是目前发现的唯一具有高频率同源重组特性的植物,是研究植物代谢和发育的理想的模式系统。本文从生育周期、代谢和发育方面综述了其研究进展。     

小立碗藓原生质体细胞壁再生过程观察

[目的]小立碗藓具有遗传背景清楚、活体观察方便、生活史短、再生能力强等特点,是研究发育的理想模式植物.[方法]应用0.5％的崩溃酶将生长7d的原丝体酶解,得到新鲜原生质体,先过滤再用8％的甘露醇洗涤,在含有为8％的甘露醇的BCDA液体培养基内培养2d和4d.采用新鲜原生质体、再生2d和再生4d的原生质体作材料,使用透射电镜,观察不同时期原生质体的细胞壁再生过程,并运用实时荧光定量PCR技术分析了细胞壁再生相关基因的表达.[结果]研究结果表明,原生质体培养2d后开始有微纤丝发生,在原生质体培养4d时形成细胞壁结构,细胞开始进行分裂.分析细胞壁再生相关基因的表达量,发现在新鲜原生质体中基因表达量最低,原生质体培养2d和培养4d后,基因表达量均比在新鲜原生质体中的表达量高.[结论]小立碗藓原生质体在液体培养基中培养2d微纤丝发生;原生质体培养4d形成完整的细胞壁结构.     

ABA在小立碗藓极端干旱胁迫中的作用机制

[目的]以模式植物小立碗藓为材料,研究脱落酸(ABA)在小立碗藓极端干旱胁迫中的作用机制.[方法]将培养6d的小立碗藓用50 μmol/L ABA预处理1d后(WA),再脱水处理1 d(WAD),然后复水30min (WAR).另外一组材料是将培养7d的小立碗藓(WT,未经ABA处理)直接脱水处理1 d(WD),然后复水30 min (WR).测定6个样品(WT,WA,WAD,WAR,WD,WR)叶绿素荧光光化学淬灭系数(qP,qL)、非光化学淬灭系数(qN)和光合系统Ⅱ的实际光合效率Y(Ⅱ),分析光合作用相关基因的表达.[结果]经ABA预处理的样品脱水-复水后(WAR)其qP、qL、qN、Y(Ⅱ)值可以恢复,而未经ABA预处理的样品脱水-复水后(WR)其qP、qL、Y(Ⅱ)值均为零.进一步分析光合作用相关基因的表达,结果表明,经ABA预处理的样品脱水-复水后(WAR)的光合作用相关基因psbH、psbN和petN相对于其脱水时的表达量上调,petB和petD下降幅度较小;而未经ABA预处理的样品脱水-复水后(WR)的光合作用相关基因psbH、psbN、petN、petB和petD相对于其脱水时的表达量均下调,而且psbH、petN、petB和petD四个基因下降幅度较大.[结论]在复水过程中,ABA可以促进小立碗藓光合作用的恢复,从而提高小立碗藓的抗旱能力.     

小立碗藓细胞重新编程过程中染色体重塑观察

小立碗藓(Physcomitrella patens)是研究植物发育的理想模式植物,也是目前发现的具有高频率同源重组特性的植物,其再生能力很强。此研究以生长7d的小立碗藓原丝体、培养0d的原生质体和再生2d的原生质体为材料,旨在了解小立碗藓细胞重新编程过程中染色体结构的动态变化。透射电镜观察发现原丝体染色体结构浓缩程度高;而当原丝体脱去细胞壁成原生质体状态时,异染色质开始解凝,染色体结构变得较为松散;原生质体再生2d时其染色体松散程度次之。通过进一步荧光定量PCR分析染色体重塑相关基因SWI/SNF的表达水平,发现这些基因在原生质体中表达量最高。     

小立碗藓PpLBD20基因敲除载体的构建及功能研究

LBD(Lateral organ boundaries domain)是植物中特有的基因家族.前期研究发现灰霉菌处理小立碗藓导致配子体中的PpLBD20上调表达,但PpLBD20的功能尚不明确.因此提取小立碗藓DNA,PCR扩增PpLBD20基因的上下游片段,依次插入PTN182载体,利用同源重组原理构建敲除表达载体,酶切和测序验证插入序列的正确性.通过工作浓度为20％的PGE 6000介导小立碗藓原生质体转化,筛选鉴定得到敲除PpLBD20后的突变体植株,观察到敲除后小立碗藓不形成茎叶体结构且配子体成丝状.结果为深入探究PpLBD20在小立碗藓的形态建成调控病原菌侵染的抗性作用奠定基础.     

小立碗藓原生质体再生过程中蛋白质相互作用网络分析

[目的]探明蛋白质间的相互作用对于阐明细胞生命活动的分子机制具有重要意义.[方法]应用Cytoscape平台中MiMI插件,进行磷酸化修饰蛋白质之间的相互作用(protein-protein interaction,PPI)网络分析.采用基于DAVID分析系统对PPI网络中的蛋白质进行Gene Ontology (GO)富集分析.[结果]有5个磷酸化蛋白质(ATX1、AGL21、KNAT2、EOL2和VIP4)与其他33个蛋白质存在相互作用关系.这些PPI网络中的蛋白质主要参与分生组织的分生状态的维持,干细胞的发育以及基因的表达调控等生物过程.[结论]小立碗藓原生质体的再生机制可能与种子植物的胚后发育相似.     

小立碗藓细胞色素P450基因CYP73A49的克隆与功能分析

本研究克隆了一个小立碗藓（Physcomitrella patens）P450基因CYP73A49,其cDNA全长1629bp,预测编码542个氨基酸。为了进一步研究其生物学功能,利用同源重组技术对CYP73A49基因实施定点突变,成功构建了能诱导其功能缺失的载体,并获得了苔藓的功能缺失突变体。     

小立碗藓细胞色素P450基因PpCYP51G1的分离及转化载体构建

从小立碗藓（Physcomitrella patens）中克隆了细胞色素P450 CYP51基因PpCYP51G1的全长编码序列,编码区长1509bp,预测编码488个氨基酸,蛋白二级结构含有自由卷曲、伸展片段和α-螺旋,N端含有一个跨膜区域。构建了PpCYP51G1的功能缺失载体,并利用PEG介导的原生质体转化技术获得该基因的功能缺失转化体;同时,构建了印CYP51G1-GFP融合蛋白载体,亚细胞定位结果表明,PpCYP51G1定位在内质网中。     

小立碗藓PpCAD4基因敲除载体的构建及功能研究

木质素是植物抵御外界环境的重要成分,肉桂醇脱氢酶（cinnamic alcohol dehydrogenase,CAD）是木质素合成途径中的关键酶和限速酶之一。前期数据表明,在灰霉菌侵染下,PpCAD4基因上调表达,但PpCAD4功能尚未明确。本次研究利用同源重组原理构建PpCAD4.1-PTN182-PpCAD4.2敲除载体,从而破坏PpCAD4的alcohol dehydrogenase GroES-like domain（ADH_N）和zinc-binding dehydrogenase（ADH_zinc_N）结构域。利用PGE 6000介导小立碗藓原生质体转化,筛选并鉴定得到敲除PpCAD4突变体植株。qRT-PCR表明,敲除型植株中PpCAD4的表达量相对野生型减少了84%。通过对配子体的形态观察发现,PpCAD4突变株通过增加配子体中拟叶的数量,使得植株生物量增加,这表明CAD4在早期陆生植物的生长发育中起着重要作用。用灰霉菌侵染小立碗藓发现,0.5 d后野生型配子体菌丝入侵率为15%, cad4-ko菌丝入侵率为40%。侵染1 d后,Ppcad4-ko配子体菌丝侵入率是野生型的2倍。表明PpCAD4能够增加小立碗藓对真菌病原菌的抗性。     

不同浓度潮霉素对盐芥根生长的影响

为了研究不同浓度的潮霉素对盐芥根生长的影响,将春化后的盐芥种子种在潮霉素浓度分别为0、2.5、5.0、10.0、20.0 mg/L的1/2 MS培养基上,垂直培养,测量根生长的长度,以根长作为衡量盐芥生长的标准。结果表明,潮霉素对盐芥根生长有抑制作用,且浓度越高,抑制作用越明显。潮霉素浓度达20.0 mg/L时,根几乎不生长。     

潮霉素对拟南芥幼苗生长的影响

为揭示潮霉素与拟南芥幼苗生长发育的关系,研究了不同浓度潮霉素对拟南芥幼苗叶和根生长的影响.结果表明:拟南芥幼苗对潮霉素的抗性浓度约为30 μg/mL;在30 μg/mL潮霉素的作用下,拟南芥幼苗叶生长、主根伸长和侧根形成受到显著抑制,导致拟南芥幼苗较小.     

中华结缕草对潮霉素的敏感性研究

研究了中华结缕草3种不同外植体对不同浓度潮霉素溶液的敏感性。结果表明:中华结缕草不同外植体对潮霉素的敏感性存在差异,其中种子经50 mg/L潮霉素处理3周后,发芽率极显著减少,只有6%;愈伤组织经20 mg/L潮霉素处理3周后褐化率达到62%;离体叶片经50 mg/L潮霉素处理7 d后,黄化面积率超过85%。故中华结缕草的种子、愈伤组织、离体叶片在遗传转化中适宜的潮霉素筛选浓度分别为50、20、50 mg/L。     

中华结缕草对潮霉素的敏感性研究

研究了中华结缕草3种不同外植体对不同浓度潮霉素溶液的敏感性。结果表明:中华结缕草不同外植体对潮霉素的敏感性存在差异,其中种子经50 mg/L潮霉素处理3周后,发芽率极显著减少,只有6%;愈伤组织经20 mg/L潮霉素处理3周后褐化率达到62%;离体叶片经50 mg/L潮霉素处理7 d后,黄化面积率超过85%。故中华结缕草的种子、愈伤组织、离体叶片在遗传转化中适宜的潮霉素筛选浓度分别为50、20、50 mg/L。     

苔藓植物双向凝胶电泳蛋白样品制备的优化

比较了苔藓植物小立碗藓3种蛋白样品制备方法,结果分析表明,直接研磨法和三氯乙酸（TCA）/丙酮（acetone）沉淀法检测的蛋白点的数量相差不明显;直接研磨法提取蛋白所得到的2-DE图谱蛋白点模糊,分辨率低,横竖条纹干扰严重;三氯乙酸（TCA）/丙酮（acetone）沉淀法分离效果较好,分辨率有所提高.改良的酚抽提/乙酸铵沉淀法检测的蛋白点远远多于前两种方法,所得到的图谱质量最高,分辨率大大提升,蛋白点分布均匀清晰,横竖条纹干扰也很少,凝胶背景干净,是最佳的小立碗藓蛋白样品制备的方法.     

卡那霉素和潮霉素对芦竹不定芽诱导与生长的影响

[目的]研究组培条件下芦竹（Arundo donax Linn.）对植物基因工程常用抗生素卡那霉素和潮霉素的敏感性,为芦竹基因工程载体构建及转基因植株筛选奠定基础。[方法]芦竹外植体预培养3 d后接种于添加不同浓度卡那霉素或潮霉素的不定芽诱导培养基中培养,研究2种抗生素对芦竹外植体不定芽诱导及生长的影响。[结果]2种抗生素在一定浓度下对芦竹外植体不定芽诱导和生长都有影响。潮霉素浓度在5～50 mg/L时,随着浓度增大,对芦竹不定芽诱导及生长的抑制作用均增强;浓度达到50～100 mg/L时,外植体生长、分化逐渐停止直至死亡。卡那霉素浓度在5～100 mg/L时,对不定芽诱导产生促进作用。[结论]潮霉素在较低浓度下对芦竹外植体不定芽诱导和生长产生抑制作用,适合作为芦竹转基因选择标记。     

转基因及常规水稻穗期对潮霉素的敏感性

研究带潮霉素磷酸转移酶基因的转基因水稻及常规水稻穗期施用潮霉素B溶液后的反应.结果发现,常规水稻在穗苞期注射50,75, 100 mg·L-1潮霉素B溶液后,注射穗抽穗后分别出现26.3％,27.9％,32.7％的枯死穗粒,且分别有5％,15％,20％的穗苞枯死株,抽穗期喷施50,75,100 mg·L-1潮霉素B溶液后,穗部毒性症状表现为颖壳黄褐色,黄褐色颖壳穗粒分别为9.70％,14.6％,16.2％;而带潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)的Bt转基因稻均未出现上述毒性症状.     

不同栽培基质对大羽藓生长的影响

以黄沙、沸石、废菌糠和泥炭(浸出液和固态)为基质在光照培养箱内对大羽藓进行栽培,利用分枝长度、分枝数、生物量等指标评价了大羽藓的生长状况,探讨了不同基质栽培对大羽藓生长的影响.结果表明:液态栽培中,废菌糠浸出液栽培大羽藓生长效果最佳,其次是泥炭、黄沙、沸石,蒸馏水效果最差;废菌糠浸出液栽培大羽藓60d其分枝长度为5.13cm,一级及二级分枝数分别为3.27和2.30个,鲜质量及干质量分别增长34.09和17.22倍.固态栽培中,泥炭(固态)栽培大羽藓生长效果最佳,其次是黄沙、沸石、废菌糠,林下土壤栽培效果最差;泥炭(固态)栽培大羽藓60d,其分枝长度为4.11cm,一级及二级分枝数分别为3.17和1.73个,鲜质量及干质量分别增长46.49和19.56倍.     

植物细胞重编程机制及其在苔藓植物中的研究进展

重编程在植物组织培养和干细胞治疗等领域有潜在的应用价值。目前,影响陆生植物重编程的分子机制还不清楚,而且缺少从进化-发育角度对重编程的研究。通过建立模式生物小立碗藓的再生体系,研究共有因子Pp CSP1/Lin28调控高等植物重编程的作用机制,并对今后的研究进行展望。     

菊花对潮霉素敏感性的研究

[目的]探讨菊花对潮霉素的敏感性,为菊花的遗传转化提供理论依据。[方法]以菊花品种45、34、30、44、20、35的愈伤组织为材料,采用MS培养基附加6-BA、IAA、KT,以不同浓度的潮霉素进行处理。[结果]随着潮霉素浓度的增加,全部试材的褐化率均增大,体积增殖均减小。菊花35对潮霉素最敏感,在潮霉素浓度为10 mg/L时,其褐化率为56.67%。在潮霉素浓度小于20 mg/L时,菊花愈伤组织的体积增殖平均为3 mm;在潮霉素浓度大于20 mg/L时,其体积增殖平均为0.5 mm,且其褐化率达70%~80%。作为菊花筛选标记时,潮霉素的适宜浓度为20 mg/L。[结论]菊花对潮霉素的敏感性在基因型间存在差异。来自同一基因型菊花不同部位的外植体对抗生素的反应不同。     

pH值及营养元素对泥炭藓属植物生长的影响

为了对遭受破坏的泥炭藓湿地进行人工恢复与重建,以及人工条件下培养泥炭藓植物属(Sphagnum)提供理论依据,笔者对泥炭藓植物在人工栽培条件下的最适pH值和对营养物质的需求情况进行了试验研究。结果表明:泥炭藓(S.palustre L.)在pH 6.0时生长最好;人工种植所使用的化学试剂对泥炭藓具有抑制作用或毒害作用;含P元素化学试剂使大量蓝藻生长,附着于泥炭藓植物体表,造成泥炭藓死亡,并在枝叶的顶端出现颗粒状晶体(钠盐和磷酸盐)。说明,泥炭藓属植物的生长对水质有较严格的贫营养化条件要求。