马立克氏病病毒pp38基因启动子和增强子的克隆和序列分析

参考GeneBank发表的马立克氏病病毒(MDV)国际标准强毒株GA的基因序列，设计合成一对引物，分别以RBIB，814，GD2(广东分离株)，J-1-E(北京分离株)，Md11，Md5，CV1988等不同毒株的MDV基因组DNA为模板，通过PCR扩增，获得了预期大小的PCR产物。该产物经pGEM-T-easy克隆后测序，将所得序列进行比较分析。结果发现：不同毒株间pp38基因的启动子和增强子序列间有缺失突变，序列的同源性大于95．9％，其中大多数的突变发生在MDV复制的原点附近。     

马立克氏病病毒Meq基因缺失株的保护性免疫作用

马立克氏病病毒(MDV)的致病性一直在不断增强中,甚至已出现了能抵抗CV1988/Rispens疫苗的特超强株。本实验室用BAC克隆技术构建了MDV中国野毒株的Meq基因缺失株,显示出在抗马立克氏病方面具有与美国Meq基因缺失株同样有效的保护性免疫效果,而且其自身没有明显的免疫抑制作用。对美国和中国的两个MDV的Meg基因缺失株的优缺点做了比较。     

马立克氏病病毒肿瘤Meq基因缺失株的保护性免疫作用

马立克氏病病毒（MDV）的致病性一直在不断增强中,甚至已出现了能抵抗CV1988/Rispens疫苗的特超强株。本实验室用BAC克隆技术构建了MDV中国野毒株的Meq基因缺失株,显示出在抗马立克氏病方面具有与美国Meq基因缺失株同样有效的保护性免疫效果,而且其自身没有明显的免疫抑制作用。对美国和中国的两个MDV的Meg基因缺失株的优缺点做了比较。     

马立克氏病病毒广西株G2囊膜糖蛋白gI基因的克隆和表达

根据马立克氏病病毒（MDV）强毒株GA的基因序列，设计并合成了1对引物，以强毒株G2基因组DNA为模板，通过PCR技术，扩增其囊膜糖蛋白gI基因阅读（ORF）中，除去其N－端编码水区165个碱基对（bps)以外的部分，将PCR产物按正确的阅读框架定向克隆到表性载体pGEX-6P-1中谷胱甘肽转移酶（GST）基因的下游，将重组质粒转化入大肠杆菌BL21株，在1.0mmol/LIPTG浓度和30℃的条件下诱导，gI-GST基因融合蛋白获了理想的表达，经聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western-blotting试验，验证其表达的融合蛋白产物大小为预期的63000，将表达产物回收后免疫小鼠，所得抗血清可与MDV感染的鸡胚成纤维细胞（CEF）在免疫光试验（FA）中，呈细胞膜阳性染色，试验结果表明，在大肠杆菌中表达的G2株MDVgI基因的融合蛋白至少保留了天然蛋白的部分抗原性。     

马立克氏病病毒pp38基因启动子和增强子的部分功能

通过 PCR技术 ,以马立克氏病病毒 (MDV) RB1B株基因组 DNA为模板 ,扩增了包括 pp38基因及其启动子 -增强子和终止子在内的 2 2 0 0 bp的核酸片段。将该片段用 Sac 和 Sph 酶定向克隆到 p U C18质粒中 ,构建成重组质粒 ;将重组质粒转染鸡胚成纤维细胞 (CEF) ,用小鼠抗大肠杆菌表达的 pp38血清作间接免疫荧光试验 ,验证 pp38基因的表达。结果 ,在转染的细胞浆中看到了绿色的荧光 ,证实了该启动子的单向启动活性     

马立克氏病病毒L-meq基因的原核表达及多克隆抗体的制备

从潜伏期感染马立克氏病病毒的鸡淋巴组织中提取基因组DNA,采用梯度PCR的方法获得了马立克氏病病毒的L-meq基因,与NCBI数据库已发表的序列(AB091109)相比,同源性达99%。将L-meq基因片段定向克隆到原核高效表达载体pET-28a中,构建pET-28a-L-meq重组质粒。将重组质粒转化受体菌Rosetta中,以IPTG对其进行诱导表达,SDS-PAGE电泳分析,结果表明L-meq基因在E.coli Rosetta中得到了正确表达,薄层扫描分析表明,表达蛋白占细菌总蛋白的18.8%,将表达蛋白进行初步的纯化,制备了L-MEQ蛋白的多克隆抗体。用ELISA方法对多克隆抗血清进行鉴定,结果表明其纯化的重组的L-MEQ蛋白具有良好反应原性和特异性。     

马立克氏病病毒６４８株囊膜糖蛋白gI基因的克隆和表达的研究

根据马立克氏病病毒（ＭＤＶ）强毒株ＧＡ的基因序列，设计和合成一对引物，以特超强毒６４８株基因组ＤＮＡ为模板，通过ＰＣＲ技术，扩增其囊膜糖蛋白gI基因阅读框（ＯＲＦ）中，除去其Ｎ－端编码疏水区的１６５个碱基对（bp)以外的蓁部分；将ＰＣＲ产物按正确的阅读框架定向克隆到表性载体pGEX-6P-1中谷胱甘肽转移酶（ＧＳＴ）基因的下游，将重组质粒转化进大肠杆菌ＢＬ２１株，在１．０mMIPTG浓度和３０℃的条件下诱导，gI-GST基因融合蛋白获得了理想的表达；经聚丙烯酰胺凝脉电泳，West-ern-blot试验，通信班下其表达的融合蛋白产物大小为预期的６３ＫＤ。将表达产物回收后免疫小鼠，所得抗血清可与ＭＤＶ感染的鸡胚成纤维细胞（ＣＥＦ）在免疫荧光试验（ＦＡ）中呈细胞膜阳性染色。试验结果表明，在大肠杆菌中表达的６４８株ＭＤＶgI基因的融合蛋白产物保留了天然蛋白的某些抗原性。     

鸡马立克氏病病毒广西株Meq基因的克隆与序列分析

为研究鸡马立克氏病病毒(MDV)广西流行株的遗传变异情况,本研究从广西发病鸡中分离鉴定了3株MDV。参照GenBank中MDV的核苷酸序列设计1对引物,利用PCR技术对分离毒株的Meq基因进行了克隆、序列测定,并与GenBank中发表的国内外参考毒株进行比对分析。结果显示, Meq基因序列全长为1020 bp,编码一条由339个氨基酸组成的多肽,分离株与国内外MDV参考毒株相比,不同MDV株的Meq基因序列相对较保守,它们之间核苷酸同源性为83.8%~99.9%,氨基酸同源性为88.4%~99.6%。3株MDV分离株Meq基因在相关报道中提到的与毒力相关的脯氨酸重复区存在点突变。3株分离株与国内参考株YL、GXY2关系较近,与参考株RB1B、GA、Md5、648A及疫苗株亲缘关系较远。该研究为中国MDV的流行、遗传变异及防控研究提供了材料。     

鸡贫血病毒细胞凋亡素基因的原核表达及其免疫学活性

将鸡贫血病毒 (CAV)细胞凋亡素基因克隆入表达性载体 p GEX- 5 X- 3,在大肠杆菌中以融合蛋白的形式获得表达。再以表达产物免疫小鼠 ,制备抗 CAV凋亡素的多克隆抗体。以其对 CAV感染的 MSB1细胞作间接免疫荧光试验(IFA)检测呈阳性 ,表明表达产物保留了其相关的天然抗原特性。     

Cloning and Sequence Analysis of Meq Gene of Marek's Disease Virus Guangxi Strain

To investigate genetic variation of Marek's disease virus(MDV) in Guangxi province, three isolates of MDV were isolated from infected chicken.One pair of primers for amplifying Meq gene of MDV was designed according to nucleotide sequence in GenBank, Meq gene of the isolates were amplified by PCR, and then cloned, sequenced and compared with reference MDV strains published in GenBank.The results showed that Meq gene from all of the MDV isolates consisted of 1020 bp, coding for 339 amino acids.Compared with reference strains published in GenBank, the sequences of Meq gene in different isolates were relatively conserved and the homologies of nucleotide and amino acid sequence of the isolates were 83.8% to 99.9% and 88.4% to 99.6%, respectively.The proline-rich repeats of Meq gene of the MDV isolates had site mutations, and it was related to MDV's virulence.The isolate were nearly related to YL and GXY2, and far away from RB1B, GA, Md5, 648A and the immune strain phylogenetically.The study would provide research materials for the prevalence, genetic variation, protection and control of MDV in China.     

犬瘟热病毒OP株囊膜糖蛋白H基因的克隆与表达

根据发表的犬瘟热病毒OP－CDV毒株序列设计两对引物，以犬瘟热病毒OP－CDV株感染Vero细胞收获病毒提取的RNA为模板，做RT－PCR扩增出H基因的5'端和3' 端大小为945bp、904bp的两个片段，两片段部分重叠，覆盖了H基因的全部编码序列。将PCR产物按正确的阅读框架定向克隆进pGEX-6P-1载体中谷胱甘肽－S－转移酶（GST）基因的下游，将重组质粒转化进宿主菌BL21中，在37℃ 1.0mM IRTG诱导下，H基因分段获得了良好的表达，表达产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定，确定其表达的融合蛋白质大小分别为59kDa、58kDa，将表达产物回收后混合免疫小鼠。IFA显示免疫小鼠血清能与病毒感染细胞呈现特异反应，表明体外表达H基因保留了天然蛋白部分抗原性。     

西北地区新城疫病毒分离株F基因的克隆与序列分析

从西北地区（陕西、甘肃、青海和新疆）1979～1999年发生新城疫鸡群中共分离和收集了15个毒株,经蚀斑纯化、SPF鸡胚增殖得到9株NDV分离株。致病力测定结果表明,除2株为中强毒外,其余均为强毒株。以异硫氰酸胍法提取病毒基因组RNA,RT－PCR扩增基融合蛋白（F）基因N端908bp的片段,经回收、鉴定后,克隆到pGEM-T载体上进行核苷酸序列测定。对各毒株核苷酸及推导的氨基酸进行序列和同源性的比较,结果表明所有毒株在该区段没有缺失和插入,但有多处碱基置换。各分离毒株之间同源性很高（平均96．8％）,与疫苗毒株同源性较低（82．5～85．8％）,而分离自青海省的3个毒株与其他毒株的同源性均较低（平均88．0％）。以389bp核苷酸绘制系统发育树,证实西北地区的新城疫是由基因型Ⅶc和一个新发现的基因型Ⅸ引起的。     

猪传染性胃肠炎病毒核衣壳(N)蛋白基因的克隆与表达

以猪传染性胃肠炎病毒亚基因组mRNA为模板根据文献设计一对引物，通过RT－PCR技术，扩增其核衣壳（N）蛋白基因的cDNA；将其按正确的阅读框架定向克隆到表达载体pProEXHTb中特异酶切位点；将重组质粒PHN转化进大肠杆菌TG1株，在浓度为1.0mM IPTG和37℃条件下诱导，PHN基因融合蛋白获得了表达；经SDS－PAGE，Western-blot试验，确定其表达的融合蛋白产物大小为预期的47kD。试验结果证明，在大肠杆菌中表达的TGEV N基因的融合蛋白产物的确具有天然蛋白的抗原性。     

减蛋综合征病毒六邻体蛋白基因的克隆和表达

根据Genebank中EDSV-AV127的序列设计一对引物，从EDSV四川株中扩增出六邻体蛋白基因并将其克隆到pUC18中，PCR、限制性内切酶分析和序列分析表明：所扩增、克隆的基因片段包括了EDSV六邻体蛋白基因的完整序列。将克隆的基因正向插入pBV220的PRPL启动子游的SmaⅠ位点，经SDS-PAGE、Western印迹和琼脂扩散试验表明：六邻体蛋白基因在大肠杆菌中获得了表达并具有免疫学活性。     

兔出血症病毒衣壳蛋白VP60基因克隆与序列分析

自感染RHDV致死的兔肝脏组织中提纯病毒，提取病毒总RNA，以RT－PCR方法扩增得到RHDV VP60基因全长片段，克隆到T载体中，经酶切分析及PCR鉴定后进行序列测定。同一毒株不同克隆产物进行3次测序，测序结果已输送到GeenBank中（注册号为AF453761）。将测得序列与GeneBank中记录的RHDV不同分离株进行比较。比较结果表明：各毒株间核苷酸的同源性为91％－98％，氨基酸同源性为94％－99％，氨基酸变异多发生在高变区，进一步证明了毒株的高度保守性，为明确我国RHDV地方株VP60蛋白的分子特征、分子诊断试剂及新型疫苗的研制奠定了基础。     

鸡传染性支气管炎病毒(IBV)干扰新城疫病毒(NDV)增殖现象的研究

ＩＢＶ毒株Ｈ１２０、Ｈ５２、ＭＡ５对ＮＤＶ－ＬａＳｏｔａ的干扰实验证明ＩＢＶ特异性干扰ＮＤＶ增殖。１）采取不同顺序的同胚接种法：ＩＢＶ接种之后再接种ＮＤＶ;或ＮＤＶ接种之后再接种ＩＢＶ,及ＩＢＶ,ＮＤＶ同时接种,ＩＢＶ均干扰ＮＤＶ的增殖。２）ＮＤＶ接种３６小时之内,干扰现象最为明显,Ｈ１２０,Ｈ５２的干扰能力稍强于ＭＡ５。３）ＮＤＶ血清中和实验结果显示,不同顺序同胚接种ＮＤＶ、ＩＢＶ时,ＮＤＶ－ＬａＳｏｔａ不影响ＩＢＶ的增殖能力。同胚增殖ＩＢＶ,ＮＤＶ的关键是控制ＮＤＶ、ＩＢＶ的接毒量及选择合适的收毒时间。