苹果类甜味蛋白编码基因Mdtl2克隆及功能的初步验证

植物类甜味蛋白(Thaumatin like proteins, TLPs)是一类具有抗菌活性和抗非生物胁迫作用的病程相关蛋白。本研究克隆获得富士苹果(Malus domestica cv. Fuji)TLPs家族蛋白Mdtl2编码基因,该基因开放阅读框全长为912 bp,编码303个氨基酸。生物信息学分析显示Mdtl2含有多个保守的半胱氨酸及TLPs家族保守序列片段,且具有TLPs典型的三维结构,属于TLPs家族的糖苷水解酶64家族(GH64-TLP-SF Superfamily)。在烟草中过表达Mdtl2能够显著抑制疫霉(Phytophthora infestans)的侵染。在苹果中过表达Mdtl2显著抑制苹果树腐烂病菌(Valsa mali)的侵染,并且能够诱导胼胝质的积累。上述结果表明,Mdtl2作为糖苷水解酶家族蛋白,能够通过诱导胼胝质的积累,提高植物对病原菌的抗性。     

天山野果林塞威士苹果和短距凤仙花叶斑病病原真菌的鉴定

为了解新疆天山野果林中塞威士苹果Malus sieversii与其林下伴生植物短距凤仙花Impatiens brachycentra两种植物叶斑病病原菌的多样性及同源性,采用组织分离法获得病原菌,基于rDNA-ITS序列构建系统发育树,并进行ITS序列BLAST同源性比对,对病原菌进行鉴定分类,并依据科赫氏法则测定致病性。结果显示,从新疆新源县天山野果林中的塞威士苹果及短距凤仙花病叶上共分离得到18株菌落形态各异的病原菌,分属于2属4种,绝大多数属于半知菌亚门。其中,链格孢属Alternaria sp.为塞威士苹果和短距凤仙花叶斑病病原真菌中的优势菌群。致病性测定结果显示,其中11株病原真菌对塞威士苹果具有致病性,7株病原真菌对短距凤仙花具有致病性;塞威士苹果所有的病原真菌对短距凤仙花均有致病性,而且短距凤仙花所有的病原真菌对塞威士苹果也有致病性。推测2种植物叶斑病可能由相同来源的病原真菌引发,短距凤仙花染病加剧了塞威士苹果叶斑病暴发,可能是野果林退化的重要原因。     

苹果树腐烂病菌转录因子VmSte12的鉴定及功能分析

 Ste12是最早在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中发现的一类转录因子。之后在部分丝状真菌中也发现了该类转录因子的存在,并证明其能够参与调控生殖生长以及病原真菌的致病力。然而,苹果树腐烂病菌(Valsa mali)中是否存在该类转录因子以及其功能尚不明确。本研究基于生物信息学鉴定苹果树腐烂病菌中Ste12的同源基因,采用烟草瞬时表达系统进行蛋白亚细胞定位分析,利用酵母单杂技术进行转录激活功能分析,进而利用PEG介导的原生质体转化技术构建基因缺失突变体,并对其进行表型观察与分析。结果表明,苹果树腐烂病菌存在Ste12的同源基因,我们将其命名为VmSte12。该基因编码701个氨基酸,包含Ste同源结构域和C₂H₂锌指结构域。VmSte12定位于细胞核,并具有体外转录激活功能。与野生型相比,VmSte12敲除突变体生长速率平均下降10.1%,分生孢子器数量平均下降94.6%,致病力平均下降27.4%。可见,VmSte12具有Ste12类转录因子特征,并且极有可能在腐烂病菌的生长、繁殖、致病等方面发挥重要作用。     

苹果叶片中吡唑醚菌酯残留的超高效液相色谱-串联质谱检测方法

为了解吡唑醚菌酯在苹果叶片中的残留动态,合理评估其持效期,比较了液液萃取、固相萃取以及QuEChERS（Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、safe）3种样品前处理方法对苹果叶片中吡唑醚菌酯添加回收率的影响,优化了基于超高效液相色谱-串联质谱（UPLCMS/MS）的检测条件与方法。结果表明:采用QuEChERS法提取时回收率较高,所需有机溶剂少,时间短,重复性好,适合苹果叶片中吡唑醚菌酯的萃取和净化;对于苹果叶片,萃取和净化步骤中的填料可减少为乙二胺-N-丙基甲硅烷（PSA）和石墨化碳黑（GCB）2种,其最佳用量PSA为0.025 g/mL,GCB为0.020 g/mL;苹果叶组织对样品检测具有微弱的基质增强效应。通过对QuEChERS方法的改进以及对色谱-质谱检测参数的优化,建立了苹果叶片中吡唑醚菌酯残留的检测方法,该方法的线性范围为0.01~50.0 mg/L,定量限为0.01 mg/kg。在0.01~10 mg/kg4个添加水平下,吡唑醚菌酯在苹果叶片中的回收率为9 2%~9 9%,相对标准偏差为2.2%~5.3%。田间实测结果表明:苹果叶片喷施1 000 mg/L的25%吡唑醚菌酯乳油,其残留消解动态符合一级反应动力学模型ct=79.87 e-0.053 3 t,半衰期为13 d。     

基于DNA条形码技术对镰刀菌属的检测鉴定

为筛选合适的基因序列对镰刀菌属Fusarium真菌进行检测鉴定,以从不同寄主分离获得的11种57株镰刀菌为材料,选择nr DNA-ITS、EF-1α、mt SSU和β-tubulin作为候选基因,将序列获得的难易程度和种内与种间遗传距离频率分布作为评价指标,对测序获得的有效序列进行研究,筛选出该属的DNA条形码。结果表明:EF-1α基因具有较高的PCR扩增与测序成功率,为98.2%,较mt SSU和β-tubulin基因更容易获得序列片段;且种内与种间遗传距离重叠部分较少,除木贼镰刀菌F.equiseti种内遗传距离为0.029,大于黄色镰刀菌F.culmorum和禾谷镰刀菌F.graminearum种间遗传距离0.021外,种间差异明显大于种内差异,优于其它基因,能更好地区分镰刀菌;利用EF-1α基因序列构建的系统发育树显示,相同种聚集在同一分支,不同种划分在不同分支,鉴别能力较好;EF-1α基因不能扩增出其它6株非镰刀菌属的主要植物病原真菌,而对镰刀菌的PCR扩增效果很好,电泳检测结果条带单一、明亮。表明EF-1α基因可作为镰刀菌属鉴定的DNA条形码。     

苹果树腐烂病菌染色质重塑因子Vmles4的功能研究

染色质重塑因子INO80是一类由多亚基构成的遗传学调控因子,调控多种DNA代谢,在基因的表达中发挥着重要的调控功能。但其在苹果树腐烂病菌（Valsa mali）中是否存在及其生物学功能并不清楚,为此,本研究从病菌基因组中分析鉴定到INO80的一个亚基基因Vmles4,利用qRT-PCR技术分析了Vmles4在病菌侵染过程中的表达模式,利用Double-joint PCR技术和PEG介导的原生质体转化方法进行了基因敲除,然后对3个突变体的营养生长及致病力进行测定和分析,并对病菌的非核糖体肽合成酶基因VmNRPS12及VmNRPS14在突变体中的表达进行定量分析。结果表明：Vmles4在侵染初期的表达显著上调,接种后6 h上调表达6.2倍。敲除突变体的生长速率平均降低28%且菌丝生长稀疏,在富士苹果品种（Malus domestic cv. Fuji）叶片和枝条上的致病力分别降低到22.5%和27.5%,VmNRPS12及VmNRPS14基因在Vmles4突变体侵染苹果枝条24 h后的表达量分别下调86.5%和50%;综上所述,Vmles4正调控腐烂病菌的营养生长、致病力以及次级代谢合成酶基因VmNRPS12和VmNRPS14的表达。     

丙森锌对苹果褐斑病的防治效果及其对叶片锌含量的影响

为揭示有机硫杀菌剂丙森锌对苹果褐斑病菌Marssonina coronaria的毒力,采用液体培养的菌丝干重、繁殖体产生数量、分生孢子萌发率研究其室内毒力,并在田间不同时间喷施药剂后调查病情,同时利用原子吸收法测定叶片锌含量。结果表明,丙森锌可抑制病菌分生孢子萌发和分生孢子盘产生,但对菌丝生长的抑制作用相对较弱,其EC50值分别为1.07、1.70和6.76μg.mL-1;两年的田间药效试验结果表明,丙森锌在施用浓度为875mg.L-1时对苹果褐斑病的防治效果达90%以上,与对照药剂代森锰锌(1000mg.L-1)相当,表现出较好的防治效果;在陕西省关中地区每个生长季节的4月下旬至6月上旬(花后至幼果期)喷施2～3次,可有效控制病害的发生和流行,防治效果达90%。喷施丙森锌2次后70多天内苹果叶片的锌含量由20.9mg.kg-1提高到75mg.kg-1。     

苹果小吉丁虫微卫星开发及其种群遗传结构分析

为研究苹果小吉丁虫Agrilus mali Matsumura的种群遗传结构,采用磁珠富集法以生物素标记探针(AC)_(12)和(AG)_(12)构建苹果小吉丁虫微卫星文库,根据阳性克隆测序获得的微卫星侧翼序列设计引物,筛选和开发苹果小吉丁虫多态性微卫星标记,并利用开发的微卫星标记对其不同地理种群的遗传结构进行分析。结果显示,从微卫星文库中的300个阳性克隆中筛选得到248个含有微卫星片段的克隆子,阳性克隆率为82.7%,其中完美型微卫星131个,占52.8%;不完美型90个,占36.3%;混合型27个,占10.9%,表明磁珠富集法开发新微卫星标记的效率较高。从获得的248个苹果小吉丁虫微卫星中筛选获得7个多态性微卫星位点,这7个位点在苹果小吉丁虫8个地理种群样本中的等位基因数为10~23个,有效等位基因数为1.674~12.218个,多态信息含量为0.304~0.796。8个苹果小吉丁虫种群的观测杂合度为0.095~0.676,期望杂合度为0.469~0.755,Shannon指数为0.791~1.621,遗传距离为0.071~0.788。采自新疆维吾尔自治区的7个苹果小吉丁虫种群之间遗传相似度较高,但其与辽宁省种群的遗传相似度较低。     

黄顶菊种子萌发过程中DNA甲基化的MSAP分析

为明确入侵植物黄顶菊Flaveria bidentis生长发育与DNA甲基化之间的相互关系,采用甲基化敏感扩增多态性(methylation sensitive amplification polymorphism,MSAP)方法研究了黄顶菊种子萌发过程中DNA甲基化的动态变化。结果表明,DNA甲基化与去甲基化两者共同调控黄顶菊生命初期的生长发育,且去甲基化的变化在种子萌发过程中占主导。筛选出的12对引物共扩增出998条MSAP条带,其中多态性条带为951条,多态性百分比为95.37%。黄顶菊种子萌发过程中胞嘧啶发生甲基化主要以双链甲基化形式为主,位点数为94个,而单链甲基化位点数仅为50个;多态性位点数占总位点数比率为48.95%,表明有近一半的位点发生了DNA甲基化和去甲基化的变化;发生去甲基化变化的多态性片段有73个,而发生甲基化变化的有21个,说明黄顶菊种子萌发阶段DNA甲基化的变化主要以去甲基化形式为主,且在萌发第4天后去甲基化数目持续快速上升。     

晋西黄土区苹果花生间作系统小气候效应

苹果花生间作是晋西黄土区主要的农林复合配置模式,但常常因为间作系统结构设计不合理而导致间作系统内作物生长和产量受到影响。为了定量解析果农间作系统对小气候,进而对其间作作物生长发育和产量的影响,本文深入研究果农间作系统的小气候状况,为优化当地果农间作系统结构提供理论支持。以晋西黄土区吉县7年生苹果(Maluspumila)+花生(Arachis hypogaea)间作系统及花生单作系统(对照)为研究对象,首先在果树与作物间布设根障,以消除果树地下部分对作物的影响。在此基础上,对距树行不同距离处作物行的小气候因子(光合有效辐射(PAR)、大气温度、空气相对湿度和风速)及作物生长进行监测,经数学模拟分析得出:(1)苹果+花生间作系统的光合有效辐射相对指数为49.39%~88.07%,大气温度相对指数为92.74%~97.32%,空气相对湿度相对指数为112.36%~123.72%,风速相对指数为70.58%~74.22%,且距树行越近小气候效应越显著;(2)果农间作系统对小气候的影响进而造成对间作系统中花生生长发育及产量的负面影响,间作系统内花生的净光合速率和产量均低于对照的单作花生,且表现为距树行越近下降越多;(3)各小气候因子对花生生长的影响程度不同,光合有效辐射、大气温度和空气相对湿度对花生净光合速率和产量的贡献率分别为62.48%、20.71%、16.45%和53.48%、16.45%、30.07%。