烟草曲茎病毒AC4基因的原核表达与免疫定位

 利用PCR方法从烟草曲茎病毒(TbCSV) Y3 5分离物的病株中获得AC4基因,将其克隆到原核表达载体pET-30a上获得重组质粒pET-Y35AC4,重组质粒导入大肠杆菌BL21(DE3) pLysS中,IPTG诱导后SDS-PAGE发现,AC4蛋白已在大肠杆菌中获得了表达。利用Ni²⁺-NTA亲和树脂纯化了AC4重组蛋白,免疫家兔获得AC4蛋白的多克隆抗体。利用免疫胶体金技术对感病烟草中AC4蛋白进行定位发现,TbCSV AC4蛋白主要在细胞质的叶绿体和线粒体中积累。     

马铃薯Y病毒属三种病毒通用型单克隆抗体的鉴定

构建了马铃薯Y病毒属的大豆花叶病毒(Soybean mosaic virus,SMV)、马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)、三叶草黄脉病毒(Clover yellow vein virus,CLYVV)的原核表达载体pET28-SMV CP、pET28-PVY CP和pET28-CLYVV CP,经IPTG诱导、表达和纯化,获得SMV、PVY和CLYVV的CP蛋白。采用ELISA方法,用9株实验室制备的单克隆抗体对含SMV、PVY、CLYVV的病毒汁液和纯化的重组CP蛋白进行检测分析。结果表明,9株单克隆抗体均识别SMV病毒,2D3、4F9、4G12和6E7单克隆抗体能够识别PVY病毒,4F9和4G12能够识别CLYVV病毒,但PVY、CLYVV病毒与抗体的亲和力低于SMV病毒;对于重组表达的衣壳蛋白:SMV、CLYVV与抗体2D3、4F9、4G12和6E7反应强烈,PVY与4F9和4G12抗体反应稍强。综上,本研究鉴定出能识别SMV、PVY、CLYVV的通用单克隆抗体4F9和4G12。     

烟草脉带花叶病毒cp基因的原核表达及抗血清制备

 利用马铃薯Y病毒属病毒的简并引物, 通过RT-PCR技术获得了云南烟草病毒分离物YND的3'端约1.7 kb片段, 序列分析证明该分离物为烟草脉带花叶病毒(Tobacco vein banding mosaic virus, TVBMV)。将TVBMVcp基因克隆到表达载体pET-22b (+)上, 在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达出分子量为35.0 kD的融合蛋白。利用该融合蛋白制备了TVBMV的多克隆抗体, ELISA测定抗血清效价为1/4 096。Western blotting和DIBA分析结果表明, 获得的抗血清和原核表达的病毒蛋白及植物病汁液中的病毒均有特异性反应, 可用于TVBMV的快速检测。     

利用RNAi 介导的抗病性获得抗2 种花生病毒的转基因烟草

 分别以花生条纹病毒红安株系(PStV-Hongan)外壳蛋白基因(CP),花生矮化病毒轻型株系(PSV-Mi)和花生黄瓜花叶病毒(CMV-CA)复制酶基因2a为模板,通过PCR 方法分别得到PStV-CP 5′ 端,PSV-Mi 和CMV-CA 2a3′ 端150 bp 的片段,3 种片段混合物为模板经PCR 拼接得到450 bp 的片段,此拼接片段通过Gateway 系统重组至植物表达载体pK7GW1WG2,得到含反向重复拼接片段的植物表达载体pK450。冻融法导入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株GV3101 后,叶盘法转化本生烟(Nicotiana benthamiana),经PCR 检测,获得转基因植株。对T1 代转基因植株分别人工接种3 种病毒,66. 7% 的植株表现对PStV 免疫,9% 的植株表现对CMV-CA 的恢复抗性,全部植株对PSV 感病。siRNA 的Northern blot 结果表明,所有转基因烟草植株都含有病毒特异siRNA,siRNA 含量随接种后时间延长而衰减。     

利用RNA介导的抗病性获得高度抗马铃薯Y病毒的转基因烟草

 以马铃薯Y病毒坏死株系(PVY^N)的RNA为模板,应用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法,扩增出长度为801 bp的非翻译的马铃薯Y病毒外壳蛋白基因。将扩增的片段克隆到pBSK的BamHI和KpnI之间并进行了序列测定。用BamHI和KpnI从重组克隆载体上切下该基因并插入到质粒pROKII内得到植物表达载体pPVYCP。通过根癌农杆菌(LBA4404)介导的方法转化烟草NC89,经卡那霉素抗性筛选、PCR和Southern blot检测,获得82株转基因植株。Northern blot和Western blot分析表明,转基因植株只在RNA水平上得到了表达。抗病性试验表明转基因植株之间抗性水平存在着差异,其中有7株是对PVY^N高度抗病性的植株。转基因植株抗病特异性试验初步表明,对PVY^N表现高度抗病的植株对PVY^O也具有高度抗病性。     

表达dsRNA的细菌提取液可抑制黄瓜花叶病毒对烟草的侵染

 利用RT-PCR分别克隆了CMV P3613株系的RNA2片段、MP(movement protein)基因片段及CMV AN株系的CP(coat protein)基因片段。以CP基因为中间间隔序列,分别构建了含有RNA2片段和MP基因反向重复片段的原核表达载体。体外转录试验表明:两个载体转录后都能形成预期大小的dsRNA。经过IPTG诱导,在大肠杆菌HT115(DE3)菌株中可表达产生预期大小的核酸片段,经DNase和RNaseA消化处理,证实为dsRNA。将表达病毒基因dsRNA的细菌超声破碎后处理烟草,进行保护和治疗试验,结果表明:表达CMV MP基因和RNA2片段dsRNA的细菌破碎液能够诱导烟草对CMV产生抗性。接种病毒60d后,保护效果试验病株率分别为45%和60%,治疗效果试验病株率分别为75%和85%,而其他对照发病率均为100%。本研究结果证明了利用RNA沉默的原理,构建具有反向重复序列的原核表达载体,用细菌表达dsRNA的粗提取物可防治CMV对烟草的侵染。     

马铃薯Y病毒衣壳蛋白的表达、纯化与结晶条件筛选

为研究马铃薯Y病毒（potato virus Y,PVY）衣壳蛋白（coat protein,CP）在体外表达及CP重组蛋白的晶体生长条件,通过Eco R Ⅰ/Hind Ⅲ酶切及连接技术构建pET-32a-PVY CP原核表达载体,对PVY CP的诱导剂浓度进行优化,利用蛋白质纯化及脱盐技术对PVY CP进行纯化和脱盐,并分析PVY CP重组蛋白的晶体生长条件。结果表明,成功构建了pET-32a-PVY CP原核表达载体;PVY CP在大肠杆菌Escherichia coli感受态细胞BL21(DE3)原核表达系统中,于16℃下利用0.8 mmol/L异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside,IPTG）诱导表达可获得高浓度的PVY CP可溶性蛋白;PVY CP重组蛋白在二水甲酸镁处理下可生长出棒状结构晶体。     

烟草丛顶病毒RNA依赖RNA聚合酶(RdRp)介导的体外复制体系

通过重叠PCR扩增得到烟草丛顶病毒(Tobacco bushy top virus,TBTV)中国分离物RdRp的编码序列,构建以pMALC2X为基础载体的原核表达载体pMAL-TB-RdRp。0.5 mM IPTG诱导可特异性表达分子量约为120 kDa的MBP-RdRp融合蛋白。温度梯度实验显示,18℃下诱导表达的MBP-RdRp融合蛋白的可溶性比例较高,约17%;经亲和层析纯化的MBPRdRp可特异性识别TBTV正链和负链的3'末端序列,催化体外复制;对正负链的3'末端的体外复制效率存在差别,识别负链3'末端的体外复制效率明显高于正链3'末端。本研究创建的TBTV RdRp介导的体外复制体系为进一步研究TBTV基因组复制调控奠定了基础。     

马铃薯Y病毒CP基因的原核表达及免疫金标试纸条的研制

选取马铃薯Y病毒（potato virus Y,PVY）代表株（NC＿001616.1）外壳蛋白基因37～281区间，采用化学合成方法合成目标序列，将其连接到原核表达载体pET-32a（+），并转化至大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导表达出45 kDa融合蛋白，回收后免疫日本大耳白兔制备抗血清。Western Blot分析多克隆抗体特异性良好，后制备25 nm胶体金，标记PVY CP37-281多克隆抗体，制备胶体金免疫层析试纸条。结果表明，试纸条能在15 min内检出PVY,PVY病株汁液检测稀释限度可达106倍（W/V），使用常见复合侵染烟草检测，未出现交叉反应。由此可知，该试纸条操作简便，反应灵敏特异，适用于田间一线及种薯生产中马铃薯Y病毒的检测。     

大豆凝集素基因lec-s转化烟草>增强对烟草花叶病毒的抗性

 将编码大豆凝集素的lec-s基因插入植物表达载体pBI121中,构建植物重组表达质粒pBI121:: lec-s。由根癌土壤杆菌EHA105介导的叶盘法转化烟草,获得了转基因烟草株系。PCR和RT-PCR检测证明lec-s基因已转入烟草植株中。接种烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus,TMV）进行抗病性试验结果表明,转基因烟草叶片上的病斑数显著减少,说明转基因烟草表现出对TMV的抗性。定量RT-PCR检测发现,接种TMV后,抗病防卫基因（PR-1a、GST1、Pal和hsr515）在转基因烟草叶片中显著上调表达。这些结果表明,大豆凝集素基因lec-s转化烟草可对TMV产生抗性,其作用机制可能在于lec-s基因参与了植物的防卫信号通路,诱导了抗病防卫基因在转基因植株体内的表达,增强了植株对TMV的系统抗性。     

沼泽红假单胞菌蛋白Rhp-PSP对烟草花叶病毒的系统抗性诱导及互作蛋白筛选

本文研究了蛋白Rhp-PSP诱导烟草抗TMV过程中相关防御酶的活性以及丙二醛（MDA）含量的变化，同时测定了抗病相关基因的表达情况。试验证明，蛋白Rhp-PSP处理烟草后，叶片中苯丙氨酸解氨酶（PAL）、过氧化物酶（POD）和多酚氧化酶（PPO）的活性显著提高，但降低了MDA含量。同时基因PR-1、PR-3、PR-5、PDF1.2表达显著上调，证明了蛋白Rhp-PSP具有诱导烟草产生抗TMV的活性。为阐明诱导抗性机制，利用酵母双杂交系统从烟草cDNA文库进行互作蛋白的筛选并验证，结果表明GPI锚定蛋白、VAN3结合蛋白及叶绿素结合蛋白A与蛋白Rhp-PSP互作。     

毁灭炭疽菌Colletotrichum destructivum诱抗蛋白对烟草抗病性的诱导

为明确毁灭炭疽菌Colletotrichum destructivum诱抗蛋白诱导烟草的抗病性及其作用,采用喷雾、摩擦接种方法及RT-PCR技术研究了诱抗蛋白的预防保护作用,以及烟草悬浮细胞经诱导后过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性及脯氨酸(Pro)含量和病程相关基因表达的变化。结果表明,接种3、5和7 d后,该诱抗蛋白对烟草炭疽病的诱抗效果分别为58.00%、48.99%和49.65%,对烟草白粉病的诱抗效果分别为83.26%、80.76%和78.60%,并可以抑制烟草普通花叶病毒的复制及在寄主体内的扩增;经诱抗蛋白处理后,烟草悬浮细胞POD、PPO、PAL活性及Pro含量明显提高;诱抗蛋白能够诱导烟草病程相关蛋白基因PR-1a、PR-1b以及抗病信号传导途径关键基因NPR1的表达。表明毁灭炭疽菌诱抗蛋白可诱导烟草产生抗病性,可能与烟草悬浮细胞中POD、PAL、PPO的活性及Pro的含量提高以及相关病程基因表达有关。     

激活蛋白PeaT1诱导烟草对TMV的系统抗性

枯斑三生烟草(Samsun-NN)经激活蛋白PeaT1诱导后接种烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV),对TMV产生了明显的系统获得抗性,枯斑抑制率达54.15%,枯斑大小也受到一定程度的限制。研究结果表明,PeaT1处理烟草植株下位三片叶不同时间后,其上部叶片中PPO、POD和PAL 3种抗病防御酶活性均比对照提高,第4 d酶活性达到最高值。实时荧光定量PCR检测结果显示,经PeaT1诱导4 d后烟草叶片中抗病相关基因PR1a、PR1b、NPR1在转录表达水平上较未诱导对照都有不同程度的上调。由以上结果我们推测PeaT1诱导烟草产生了系统获得抗性,本研究为进一步阐明PeaT1诱导植物抗病的信号传导途径奠定了基础。     

瑞香素对烟草青枯病的防治效果及其作用机理

为探究植物次生代谢产物瑞香素对烟草Nicotiana tabacum青枯病的防治效果及其诱导抗性作用,通过室内和田间试验评价瑞香素对烟草青枯病的防治效果,利用高效液相色谱（high performance liquid chromatography,HPLC）和实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR,RT-qPCR）技术分析其对烟草体内酶活性、木质素含量、激素水平和抗性相关基因表达量的影响。结果表明,叶面喷施瑞香素对烟草青枯病有较好的防治效果,其中2.85 mg/L处理的防治效果最佳,其次是5.70 mg/L和11.40 mg/L处理,接种后14 d的相对防效依次为66.93%、42.52%和48.03%。瑞香素处理可显著提高烟草体内过氧化物酶、苯丙氨酸解氨酶和多酚氧化酶的活性,处理后12 h分别较对照显著提高了3.56倍、1.68倍和1.82倍;瑞香素处理后4 d和7 d烟草根部木质素含量分别较对照显著提高了1.33倍和1.54倍;瑞香素处理后6 h烟草体内茉莉酸和脱落酸含量分别较对照显著提高了35.98%和34.55%,而水杨酸含量较对照显著降低了25.56%。同时,叶面喷施2.85 mg/L瑞香素后显著抑制了茉莉酸途径拮抗基因JAZ3的表达,处理后6 h的表达量较对照下调了9.19倍,同时显著促进病程相关基因PR1的表达。提前喷施2.85 mg/L瑞香素能有效控制田间烟草青枯病发生,相对防效达到52.22%~75.54%,显著高于对照药剂苯并噻二唑的相对防效33.50%~53.00%。表明瑞香素能提升烟草体内酶活性和根部木质素含量,促进抗性基因表达,对田间烟草青枯病有稳定的防治效果,具有开发为防治烟草青枯病的植物激活剂的潜力。     

平菇蛋白粗提液诱导烟草对TMV的抗性与细胞中防御酶活性的关系

用200 μg/mL的平菇蛋白粗提液处理枯斑三生烟后接种烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus, TMV）,在不同时间测定了烟草植株叶片中苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonialyas, PAL）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）、过氧化氢酶（catalase, CAT）和过氧化物酶（peroxidase, POD）的活性。结果表明,平菇蛋白粗提液处理枯斑三生烟后,TMV的侵染率下降了70.16%;接种TMV后,平菇蛋白粗提液处理的烟草叶片中的PAL、SOD、CAT和POD活性要明显高于清水对照植株,接种后12 h PAL活性最高,平菇蛋白粗提液处理为清水对照的1.57倍;接种后24 h SOD和POD活性最高,平菇蛋白粗提液处理分别为清水对照的1.55倍和1.51倍;接种后36 h CAT活性最高,平菇蛋白粗提液处理为清水对照的1.6倍。以上研究结果表明,平菇蛋白粗提液诱导烟草抗TMV的活性与烟草叶片内防御酶活性的提高有关。     

丁香酚对烟草抗烟草花叶病毒的诱导作用初探

为探讨植物源化合物丁香酚对烟草抗烟草花叶病毒(TMV)的诱导作用,初步研究了丁香酚对接种TMV的烟草叶片中叶绿素和丙二醛(MDA)含量,防御酶苯丙氨酸解氨酶(PAL)、过氧化物酶(POD)和超氧化物岐化酶(SOD)活性,以及病程相关蛋白基因 PR-1 、PR-3 、PR-5 表达的影响。结果表明:丁香酚处理可促进叶绿素的合成,减轻烟草体内MDA的积累,提高PAL、POD和SOD的活性,增强 PR-1 、PR-3 、PR-5 基因的表达。表明丁香酚可提高植物的诱导抗病性,进而减轻TMV对烟草的危害。     

BTH诱导花椰菜对菌核病的抗性研究

 利用苯并噻二唑BTH处理菌核病抗性不同的花椰菜品种幼苗, 采用营养生长期活体叶片菌丝块接种鉴定法评价菌核病抗性诱导效果,结果表明经BTH处理的植株菌核病病情指数明显下降, 对感病品种和抗病品种的诱抗效果分别达到81.5%和63.8%。对于花椰菜重要的防御酶活性变化研究结果表明,BTH诱导处理的花椰菜植株过氧化物酶（POD）、抗坏血酸酶( SOD )、过氧化氢酶（CAT）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）和多酚氧化酶( PPO)的活性均有所提高。同时病程相关蛋白几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶的活性也增加。 利用半定量RT-PCR方法检测防御反应基因表达,结果表明BTH诱导首先激发了植株 PR-1等基因参与的水杨酸信号传导防御反应途径的发生,同时PDF1.2 基因的上调表达说明BTH诱导也影响了茉莉酸信号传导途径。