大肠杆菌肠毒素STI、STII、LTB融合基因植物表达载体的构建

产肠毒素性大肠杆菌(ETEC)LT和ST是导致人和动物腹泻的主要病原菌。利用PCR方法分别从pGEM-5Zf( )-STI、K88ab(LT ,ST )质粒中扩增到了STI、STII基因,然后通过三引物PCR实现了STI、STII基因的融合,再与LTB基因融合,并置同一阅读框。LTB基因的5′位于STII基因的3′端,并在ST基因和LTB基因之间插入7个氨基酸的连接肽。将融合基因STI-STII-LTB构建到带有核基质结合区序列(MARs)的植物表达载体pBI121-MARs中,并通过冻融法导入根癌农杆菌EHA105。     

仔猪产肠毒素性大肠杆菌的血清学鉴定

从吉林省某些猪场采集发生典型典白痢的仔猪粪便样品５５份，采用ＥＭＢ选择培养基进行分离培养，得到４３株大肠杆菌，用Ｋ８８、Ｋ９９、９８７Ｐ３种因子血清分别进行玻片凝集试验。结果阳性菌株有２３株，其中４株为Ｋ９９，占６０．９％；５株为９８７Ｐ，占２１．７％；３株含双粘附素（Ｋ９９、９８７Ｐ），占１３．０％；只有１株为Ｋ８８，占４．３％。     

产肠毒素大肠杆菌K88-STII-LTA2/LTB融合基因在烟草中的表达

融合保护性抗原的LT类全毒素具有传输抗原载体和免疫佐剂两重功效。利用基因工程技术，构建了带有信号肽的Pr1as-K88ac-STII-LTA 2/UP-LTB融合基因的双价植物表达载体。双价植物表达载体通过冻融法转化根癌农杆菌GV3101，并利用农杆菌介导技术叶盘法转化模式植物烟草。转基因烟草经PCR和RT-PCR初步检测，证明外源基因已经整合到受体植物基因组中，同时表明融合基因在转录水平上有表达。转基因烟草的获得，为进一步研制新型的抗腹泻植物口服疫苗奠定了良好的基础。     

产肠毒素大肠杆菌k88ac基因原核融合表达载体的构建

利用PCR技术扩增出菌毛K88ac基因片段,并将其插入到原核表达载体pET32a( )的多克隆位点上。测序结果表明:与Genbank中序列比对同源性达到99%以上,成功构建了原核表达载体。为进一步的研究工作,奠定了基础。     

检测产肠毒素性大肠杆菌粘附素抗体间接ELISA的建立

为了评价仔猪大肠杆菌病K88-K99-987P-F41 四价亚单位疫苗的免疫效果,利用纯化粘附素为包被抗原,建立了检测产肠毒素性大肠杆菌粘附素抗体的间接ELISA。初步确定了各种反应条件: K88、K99、987P、F41粘附素抗原最适包被浓度依次为1∶400、1∶80、1∶40、1∶40,相应粘附素抗体最佳稀释度依次为1∶400、1∶200、1∶200、1∶200。经交叉试验、阻断试验和重复试验证实,本方法具有良好的特异性和重复性。     

大肠杆菌VT噬菌体受体基因重组质粒的构建

取含有卡那霉素抗性（Kan^R)基因的自杀性质粒pJP55603和含vpr全长基因的pUC19phiΦRID质粒，分别采用粘性末端及平末端两种连接法，2种质粒Hinc II单酶切后进行平末端连接，经鉴定未得到重组质粒，pJP5603用Hinc II和Xma I消化，回收3kb的载体质粒，pUC19ΦRID用Hinc Ⅱ和Age I消化，回收778bp vpr目的基因，通过粘性末端连接，转化到感受态细菌CC118λpir，利用Kan^R进行筛选，获得的克隆经Acc I酶切鉴定和PCR检测，确定得到重质粒，即pYYvpr，将重组质粒的DNA转化到含有全长vpr基因的感受态细胞MC1061，筛选到的克隆经PCR检测，得到一株克隆既扩增出vpr基因，又扩增出Kan^R基因，初步鉴定该克隆为MC1061的vpr同源基因突变株，暂定名为MC1061Δvpr，从而为研究vpr基因的功能提供了重要的试验材料。     

番木瓜环斑病毒融合基因植物表达载体的构建

利用PCR重叠延伸技术（gene splicing by overlap extension,SOE）将番木瓜环斑病毒（Papaya ringspot virus,PRSV）Vb株系的外壳蛋白（coat protein,CP）基因和Ys株系的复制酶（replicase protein,RP）基因构建成融合基因VY。同时对常规的SOE法进行了改进,并对改进的SOE的反应体系进行了优化,其中以Pyrobest DNA聚合酶和60℃的退火温度为最佳。将融合基因n’构建在植物表达载体pCAMBIA2300上,测序结果表明,该融合基因的序列与设计相符。融合基因VY植物表达载体的构建,可为进一步获得对PRSV广谱抗性的转基因番木瓜奠定基础。     

O型口蹄疫病毒VP1 T细胞、B细胞表位双拷贝基因与大肠杆菌LTB基因融合表达产物的免疫应答

[目的]为预防口蹄疫与幼畜腹泻、生产安全高效的基因工程联合疫苗提供试验依据。[方法]通过基因工程技术,把O型口蹄疫病毒VP1双拷贝21-40(20aa)与141-160(20aa)表位肽基因——2020VP1与产肠毒素大肠杆菌LTB连接到表达载体上,在大肠杆菌中表达出具有抗O型口蹄疫病毒与产肠毒素大肠杆菌双重作用的融合蛋白。[结果]运用基因工程技术构建了融合表达载体r2020-B-2020。转化宿主菌BL21(DE3)RIL后的表达产物经SDS-PAGE分析,结果显示,重组融合蛋白的分子量约为41 kD,表达量较高。动物实验表明,融合蛋白能够诱发兔体产生较强的抗FMDV中和抗体,免疫豚鼠在低浓度FMDV刺激下产生特异性T淋巴细胞增殖反应,说明融合蛋白可以诱导机体产生有效的抗FMDV细胞及体液免疫反应。融合蛋白能够与霍乱毒素CTB抗体特异结合,免疫雌鼠能够抵抗一定强度的大肠杆菌毒株攻击。[结论]融合蛋白可以同时诱导机体产生较好的抗FMDV及ETEC免疫应答反应,具有开发成为FMDV与ETEC基因工程疫苗的应用价值。     

猪大肠埃希菌肠毒素基因的多重PCR检测

以产肠毒素性大肠埃希菌(Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)耐热肠毒素(STa、STb)基因和不耐热肠毒素(LT)基因保守序列为靶序列,设计合成了3对可扩增目的片段为182、108和336 bp的引物,建立了检测ETEC耐热肠毒素基因和不耐热肠毒素基因的多重PCR方法.该方法对肠出血性大肠埃希菌(EHEC)EDL933、猪链球菌Streptcoccus、鼠伤寒沙门氏杆菌Salmonella typhimrium和猪肺疫巴氏杆菌Pasteurella pneumotropic的检测结果均为阴性,并且能检测到102cfu/mL稀释度的标准菌.对11株分离自广东佛山地区腹泻仔猪的待检菌株进行检测,结果为:含STa基因的菌株为5株;含STb基因为2株;含LT基因为3株,其中2株同时具有STb和LT基因.结果表明:该方法的特异性和敏感性较高,可用于ETEC的临床快速诊断和流行病学调查.     

猪源大肠杆菌志贺样毒素2型突变体B亚基与LTB基因的融合与表达

猪水肿病的主要毒力因子是志贺样毒素的2型突变体(Stx2e),毒素的A亚基是有毒的酶活性单位,B亚基无毒,介导毒素与受体的结合。为了增加B亚基的免疫原性,采用重叠PCR将猪源志贺样毒素Ⅱ型突变体B亚单位(Stx2e B)连接至热敏肠毒素的B亚单位(LTB)成熟肽N末端,获得Stx2e B与LTB相连的融合蛋白基因Stx2e B-LTB。融合基因克隆到表达载体pQE30中,在IPTG的诱导下,融合基因在大肠杆菌中获得表达,表达量占细菌总蛋白的8%。融合蛋白的获得为猪水肿病基因工程亚单位疫苗的制备、猪水肿病的预防奠定了基础。     

大肠杆菌热不稳定肠毒素无毒突变体LTR72基因重组质粒的构建

用PCR方法扩增大肠杆菌LT基因，将LT基因重组入pET32a质粒载体，对构建的重组质粒pET-LT进行酶切、核苷酸序列分析，结果表明，插入片段LT的核苷酸序列与预期一致，且阅读框正确。并在影响LT毒性的关键氨基酸位点，用PCR方法引入点突变(丙氨酸→精氨酸)，成功构建了含有LTR72突变体基因的重组质粒pET—LTR72。     

MDV和AIV主要保护性抗原基因在鸡痘病毒中的联合表达

将强启动子Ps插入载体7S中构建成插入载体7SP，将鸡马立克氏病病毒（MDV）糖蛋白B（gB)基因和禽流感病毒（AIV）血凝素H9A基因共同克隆到插入载体7SP中，获得重且转移质粒7SPGA，通过酶切鉴定获得Ps-gB与P7.5-HA同向的转移质粒，再将报告基因盒PL11-LacZ插入转移质粒7SPGA得7SPLGA，将质粒7SPLGA与禽痘病毒疫苗株共转染鸡成纤维细胞，通过蓝白斑筛选纯化得到重组病毒rFPV-Ps-gB-P7.5-HA，以间接免疫荧光法证实gB基因和HA基因同时得到表达。该研究为探索新型基因工程苗打下了良好的基础。     

NOS/HuIFNa嵌合基因的构建及其与Ti质粒载体的拼接

将人α干扰素(HuIFNa)基因的全长cDNA克隆到nos启动子的下游,并在3＇端加上nos的3＇末端片段,得到人α干扰素基因插入方向同nos启动子一致的重组质粒pLQP24和方向相反的重组质粒pLQN2,并分别同Ti栽体pARCl2拼接。将NOS/HuIFNa引入到pARCl2的T区端臂内,构建成重组质粒pLPP3和pLNP20通过接合转移将这两个重组质粒引入到根癌土壤杆菌LBA4404。     

表达绿色荧光蛋白重组减毒鼠伤寒沙门氏菌的构建

应用DNA重组技术构建了表达绿色荧光蛋白 (GFP)的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌。用EcoRⅠ和NcoⅠ将pEGFP质粒中的绿色荧光蛋白基因EGFP切下 ,克隆进表达载体质粒pYA3334的EcoRⅠ和NcoⅠ位点之间 ,构建成重组表达质粒pYAGFP ,然后转化大肠杆菌X6 2 12、中间宿主X3730、终末宿主X45 5 0。X45 5 0于LB培养基上呈绿色 ,在荧光显微镜下观察 ,整个菌体发绿色荧光。构建的表达GFP的重组鼠伤寒沙门氏菌为减毒沙门氏菌活载体基因工程疫苗的研制提供一个良好模型。     

鹅副粘病毒F蛋白基因的克隆和序列分析

鹅副粘病毒分离株 YG97经 1 0日龄鸡胚增殖后纯化 ,提取病毒基因组 RNA,采用 RT-PCR一次性扩增出与预期设计的 1 .7kb大小相符的特异性条带。将扩增产物提纯后克隆入 p GEMR -T载体 ,经转化、筛选及酶切鉴定后 ,初步获得了含鹅副粘病毒 F基因的阳性克隆 ,并进行了序列测定。序列分析表明 :扩增的 F基因片段的长度为 1 695bp,共编码553个氨基酸 ,F蛋白裂解位点的氨基酸顺序为 1 1 2 R-R-Q-K-R-F1 1 7,与 NDV的强毒株特征相符 ,同时也与鹅副粘病毒分离株致病性试验结果相符。同源性分析表明 :与国内标准强毒株 F48E9的核苷酸同源性为 86%,与国内外部分发表的其他 NDV毒株的核苷酸同源性在 84 %～ 89%之间 ,说明该毒株相对于经典的 NDV在 F基因上已发生了较大的变异     

鸡贫血病毒衣壳蛋白基因的PCR扩增和克隆

通过聚合酶链式反应（ＰＣＲ）扩增鸡贫血病毒（ＣＡＶ）衣壳蛋白基因（１．４ｋｂ），并将此基因克隆进ｐＵＣ－１８载体中。通过原位杂交、酶切分析、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交及其标记成探针对ＣＡＶ基因组的特异性反应等试验证实所获得的克隆是含有ＣＡＶ衣壳蛋白基因的重组质粒克隆。此工作为下一步ＣＡＶ衣壳蛋白体外表达的研究奠定了基础     

慢性髓性白血病bcr-abl融合基因的克隆与表达

以慢性髓性白血病K562细胞总RNA为模板,采用RT PCR技术扩增包含bcr abl融合位点周围的基因片段,定向克隆到pGEX 6P 1载体谷光甘肽S转移酶(GST)的下游。将重组质粒转化大肠杆菌BL21菌株,以1.0mmol·L-1IPTG诱导bcr abl融合基因片段的表达,其产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定,结果证实该融合蛋白分子质量约42ku。用该表达产物免疫ICR小鼠,所制备的抗血清可与K562细胞中特异性抗原反应,表明该bcr abl/GST融合蛋白具有bcr abl基因产物的特异抗原性。     

生长抑素基因与乙肝病毒表面抗原基因融合体质粒(pUC12-ss/HBs)的构建

为了将生长抑索(Somatostatin,ss)基因融合到乙肝表面抗原(HBsAg 或 HBs)基因 C 末端 Acc Ⅰ 位点(aa223位置),先将质粒 pWR13-HBs/4的多接头区 Sal Ⅰ位点消除,因为它也可被 AccⅠ酶切。在AccⅠ位点加入 Bgl Ⅱ接头,用 Sac Ⅰ和 Bg Ⅱ切下 HBs 基因片段(700bp),并将其插入到 pUC12-ss/2中 ss 基因N 末端 Sac Ⅰ和 BamH Ⅰ位置.获得基因融合体质粒 pUC12-ss/HBs。经 DNA 序列分析,两基因融合处的阅读框架正确,且 HBs 基因的起始密码 ATG 和 ss 基因全序列都得以证实.     

H9亚型禽流感重组鸡痘病毒疫苗的免疫保护试验

应用表达H9亚型禽流感病毒(AIV)血凝素(HA)基因的重组鸡痘病毒疫苗及其传代后第20、30代疫苗免疫5日龄无特定病原(SPF)鸡群,于免疫后采血测定HI抗体效价,并于免疫后第21天攻毒,攻毒后2～13d进行泄殖腔棉拭子采样,接种鸡胚测排毒情况。各免疫组在免疫后7～20d的HI抗体效价逐渐上升,但不同剂量组间、不同传代代次间有差异;攻毒后第5天各免疫组排毒的鸡数与对照组相比显著减少,且不同攻毒毒株组间无差异。重组苗组在攻毒后第2天仅有8%排毒,第5天则无排毒;灭活油苗组在攻毒后第2、5、7天分别有52%、12%、4%排毒,直到第9天才不排毒;空白攻毒组在攻毒后2～13d排毒率由92%缓慢降至8%。结果表明:研制的表达H9亚型禽流感病毒HA基因的重组鸡痘病毒载体疫苗具有较高的免疫保护效力,不低于灭活油苗,且在抑制早期排毒、防止群内传播方面优于灭活油苗。