长春花小叶病植原体质粒DNA克隆及其分子特征

为了测定长春花小叶病植原体质粒及分析其分子特征,扩增长春花小叶病植原体质粒片段,然后进行反向扩增,拼接得到质粒全序列,且预测质粒编码蛋白的跨膜区、亚细胞定位等。结果表明,获得的质粒全长为4 102 bp,A+T含量为75.18％,编码5个蛋白,且将该质粒命名为pPLLHn-1。其中ORF的2、3、4编码蛋白分别含有2、1、2个跨膜区,ORF3的信号肽（Singnal peptide,SP）的信号值为0.948,ORF3编码的氨基酸序列与洋葱黄化植原体质粒EcOYW1参与质粒拷贝数控制的蛋白（Copy number control protein）具有97％的同源性。此结果说明长春花小叶病植原体质粒pPLLHn-1编码的5个蛋白中,除与质粒复制有关的RepA和SSB外,另外3个均为跨膜蛋白,根据分泌蛋白的特征分析初步推断ORF3蛋白为分泌蛋白。     

海南长春花变叶病病原物的分子鉴定

本研究分别利用植原体16S rDNA和核糖体蛋白(ribosomal protein,rp)基因的通用引物对自然表现变叶症状的海南长春花样品总DNA进行PCR扩增,获得16S rDNA基因片段长为1 432 bp,rp基因片段长为1 211 bp。BLAST程序比较、系统进化树构建及iPhyClassifier分析表明:海南长春花变叶病是由植原体引起的,该植原体株系属于16S rⅠ-B亚组,与候选种Ca.Phytoplasma asteris相关,将其暂命名为长春花变叶病植原体海南株系(Periwinkle phyllody strain Hainan,PP-Hn)。     

海南黄灯笼辣椒小叶病病原物的分子鉴定

采用分子生物学技术对田间疑似植原体侵染引起的小叶症状的黄灯笼辣椒样品进行检测,以明确其病原分类地位。利用植原体通用引物对R16mF2/R16mR1和R16F2n/R16R2,对上述黄灯笼辣椒叶片DNA进行巢式PCR扩增。结果表明:获得约1.2 kb的特异片段,经序列测定、Blast同源性检索及进化树和iPhyClassifier分析,获得该特异片段长为1 248 bp,与植原体16S rⅡ组中的花生丛枝植原体(L33765)同源性最高,达99%,聚类在同一个进化枝上,相似性系数为1.00,归属于16S rII-A亚组。暂将其命名为黄灯笼辣椒小叶植原体(Capsicum chinense Jacquin little-leaf disease phytoplasma,CcJLL)。     

海南竹柏扁枝病病原植原体的分子检测鉴定

提取采自海南万宁热带植物园中表现典型扁枝症状的竹柏植株总DNA,利用植原体16S rRNA基因通用引物对P1/P7和R16F2n/R16R2进行巢式PCR检测。结果表明：扩增到大小约1.2 kb的植原体特异片段,通过对扩增片段进行克隆、测序和序列比对分析,结果确定为植原体感染。系统进化分析结果表明,该植原体（GenBank登录号：KP027298）为australasiae植原体候选种相关株系,与australasiae植原体候选种（GenBank 登录号：Y10097）的同源性为99.4％。进一步虚拟RFLP分析,结果表明该植原体属于花生丛枝植原体组（16Sr II）的一个新亚组,与其相似性最高的是16Sr II-A亚组（相似系数为0.97）。为指导竹柏扁枝病的防治奠定理论依据。     

海南苦楝丛枝病植原体的分子鉴定

利用植原体16S rDNA通用引物对Rl6mF2/R16mR1,通过PCR技术从表现典型丛枝症状的苦楝植株总DNA扩增到约1.4 kb的特异片段,将此片段克隆后进行序列测定、分析及系统关系树构建.结果表明,该片段与16Sr I组中的各植原体同源率均达到99%以上,其中与16Sr I中的白蜡树丛枝(Ash witches'-broom,AWB,AY566302),柳叶菜变叶(Epilobium phyllody,EP,AY101386)和苦楝丛枝江西株系(Chinaberry witches'-broom,CWB-JX,AY859543)的同源率最高,达到100%,而与其它组的植原体16S rDNA序列的同源率均低于97%.引起我国海南苦楝丛枝病的植原体应归属于16sr I组,将其暂命名苦楝丛枝植原体海南株系.     

海南长春花黄化病植原体的DAPI荧光显微检测

对感染黄化病的海南长春花植株,应用DAPI荧光显微技术对其嫩茎和叶柄进行了切片染色观察,结果表明：在感病植株的韧皮部筛管分子中存在大量特异性的植原体DNA荧光光点,而在健康植株的筛管分子则未发现有特异性的植原体荧光。另对其茎和叶柄中的植原体含量进行比较,结果显示茎中的含量要比叶柄中稍高。     

香蕉园土壤16S rDNA文库分析

以采自海南省福山香蕉园香蕉枯萎病发生地和正常种植园的土壤样品为试验材料,对这两类土壤的细菌多样性进行研究。通过构建2种土样的细菌16S rDNA基因文库,利用限制性内切酶HhaI对随机克隆进行酶切筛选,测定代表克隆的16S rDNA序列,并对2种土样的细菌种群进行了系统发育分析比较。结果表明正常香蕉种植区的土壤样品的细菌多样性较为丰富,其中变形菌门、厚壁菌门、酸杆菌门为主要细菌类群;而香蕉枯萎病发生地土壤以放线菌门和厚壁菌门为主要细菌类群。     

假臭草丛枝病植原体16SrDNA检测与PCR-RFLP分析

采用PCR技术对假臭草丛枝病原进行分子检测及巢式PCR扩增,得到1189bp的植原体16SrDNA片段,将该片段进行限制性片段长度多态性（RFLP）分析,并将与己知的植原体序列共同构建系统发育树,试图明确其与己知植物原体种类的关系,为进一步研究打下遗传基础。结果显示出所检测假臭草病株样品感染同种类型的植原体。直接PCR产物纯化后直接测序,序列显示出与16SrⅡ组植原体有较高的同源性,假臭草丛枝病与植原体16SrⅡ组中的花生丛枝病、番薯丛枝病和中国木豆丛枝病同源率最高,达到98．5％,因此可以认为假臭草丛枝病植原体属于16SrⅡ组,即花生丛枝病组（PnWB）。     

16S rDNA序列分析法对香蕉根部内生细菌种群多样性初析

采用16S rDNA序列分析法对香蕉根部内生细菌种群多样性进行初步研究,随机选择12个阳性克隆测序。结果表明,该序列与未培养及可培养的芽孢杆菌、雷尔氏菌、伯克氏菌、戴尔福特菌、肠杆菌等细菌的序列同源性在97%～100%之间,说明香蕉根部存在大量未培养及可培养的内生细菌。     

野茼蒿变叶病病原物的分子鉴定

利用植原体16S rDNA通用引物R16mF2/R16mR1对海南表现变叶症状的野茼蒿样品总DNA进行PCR扩增,获得约1.4 kb的特异片段,并对扩增产物进行核苷酸序列测定。通过BLAST程序比较、系统进化树构建及iPhy Classifier分析表明,海南发生的野茼蒿变叶植原体在分类上属于花生丛枝植原体组中的A亚组,即16Sr II-A亚组。这是我国首次在野茼蒿上发现植原体病害。     

海南槟榔黄化病病原物的分子鉴定

槟榔黄化病是槟榔上的一种重要病害,如何快速检测该病原菌是防治该病的重要基础。利用植原体16SrDNA通用引物对海南感染黄化病的槟榔花苞总DNA进行巢式PCR扩增,获得约1.2kb的特异片段,并对扩增产物进行核苷酸序列测定。通过BLAST程序比较、系统进化树构建及iPhyClassifier分析表明,引起海南槟榔黄化病病原植原体属于翠菊黄化植原体组(16SrⅠ组),且为该组中一个新的亚组,即G亚组,现将其暂命名槟榔黄化植原体(Arecanut yellow leaf phytoplasma,AYL)。     

海南木豆丛枝植原体质粒全序列测定及分析

提取木豆叶片基因组总DNA,通过克隆,测序木豆丛枝植原体海南株系质粒(pPPWB-Hn)的完整DNA序列,并使用生物信息学软件对该质粒全长序列进行分析。分析结果显示:pPPWB-Hn质粒全长4 218 bp,含有4个开放阅读框,分别编码Rep、dnaG、threonine synthase和未知蛋白。其中,Rep是2次跨膜蛋白,dnaG是单次跨膜蛋白,Rep和dnaG均与质粒自主复制有关。Rep和未知蛋白可能分布在细胞质中,dnaG可能定位到细胞膜上或膜外,Threonine synthase可能定位到线粒体膜上或线粒体内腔。系统进化树显示:pPPWB-Hn与植原体16SrⅡ组的pPNWB(AY270152),pTBBperi(DQ119297)及pTBBcap(DQ119296)处在同一进化分支。     

海南槟榔黄化植原体分子检测及其系统发育关系研究

由植原体引起的槟榔黄化病是海南特色经济作物槟榔种植上的一种毁灭性病害。本研究通过PCR扩增测序、序列多重比对和系统发育分析,对海南部分代表性地区槟榔致死性病原植原体的序列信息与系统发育关系进行检测分析。结果表明：本研究检测的保亭、屯昌、万宁等海南部分代表性地区的槟榔黄化植原体的16S rDNA序列一致;BLAST分析表明各株系16S rDNA与16SrI组植原体同源性为100%。序列多重比对分析表明,本研究各槟榔黄化植原体株系与海南苦棟丛枝、长春花绿变、马松子变叶、辣椒黄化皱缩、蛇婆子丛枝、细圆藤丛枝和日本洋葱黄化、美国翠菊黄化等植原体同源性为100%;与已报道的海南万宁、印度、海南三亚的槟榔黄化植原体16S rDNA序列同源性分别为99.9%、99.9%、99.8%。系统发育分析表明,本研究槟榔黄化植原体与海南苦棟丛枝、长春花绿变、马松子变叶、辣椒黄化皱缩、蛇婆子丛枝、细圆藤丛枝等株系聚于一个分枝,支持率为100%。此外,在发病槟榔叶片、花穗、心叶等组织部位均可检测到植原体。研究结果表明,海南槟榔黄化植原体与海南苦棟丛枝、长春花绿变、马松子变叶、辣椒黄化皱缩、蛇婆子丛枝、细圆藤丛枝等植原体株系的同源性极高,槟榔黄化病很可能会以这些寄主植物作为病原传播载体进行传播扩散。     

3个木薯品种的叶绿体基因组16S rRNA-23S rRNA基因间隔序列的特征分析

以华南6、8、10号木薯为材料,通过PCR克隆3个木薯品种的叶绿体16S-23S基因间隔序列,与其他17种植物的该序列进行亲缘关系分析。从进化树可以看出,该序列进化分析符合Webster分类系统,同科植物可以很好的聚为1类。此外,3个木薯品种的16S-23S基因间隔序列相似性高达99.94%;大戟科间的序列相似性为97.52%;其他植物科内的序列相似性不低于96%。该研究还分析了3个木薯品种16S-23S基因间隔序列的基因分布,该序列的基因分布情况一致,包含16S rRNA 5′端,trnI基因,ycf68基因,trnA基因,23SrRNA3′端,ISR-B,发现该序列的保守性较强,个别碱基差异并不影响基因分布,该研究可为后期木薯叶绿体遗传转化体系建立提供理论依据。     

腐烂茎线虫rDNA-ITS序列分析

利用一对通用引物rDNA1/rDNA2扩增6个腐烂茎线虫供试群体的rDNA-ITS区域,获得序列长度不等的片段.Des-1、Des-2和Des-3群体扩增片断长度均为1 130 bp.而Des-5、Des-6和Des-7群体的扩增片段长度均为942 bp,与以上群体相比,在ITS区具有一个188 bp的缺失片段.序列比对后确定缺失片段位于ITS1区,而且该片段含有多个可重复小片段,这可能是造成碱基缺失的原因.根据遗传进化分析可将供试线虫分为两个大的群体.