向日葵病程相关蛋白HaPR1基因的克隆与功能研究

病程相关蛋白(pathogenesis-related proteins)经常被用作植物抗病反应的分子标记。本文在核盘菌诱导向日葵转录组文库的基础上克隆1个病程相关蛋白1基因HaPR1的cDNA全长序列,并进行了表达模式和功能分析。结果表明, 该基因cDNA全长开放阅读框为489 bp,编码162个氨基酸,分子量为17.52 kD,等电点为8.19,具有6个保守半胱氨酸,4个保守的allergen V5/Tpx-1结构域,GenBank登录号为KR071874。经比较HaPR1与多种物种PR1高度同源。实时荧光定量PCR检测结果表明,HaPR1相对表达量在向日葵叶中最高,根中其次,茎中最低。干旱、盐、草酸、核盘菌及其代谢物均可显著诱导其表达。利用农杆菌介导法将该基因导入烟草,提高了转基因株系对核盘菌的抗性。对抗性株系烟草防御酶活性及丙二醛含量测定发现转基因烟草叶片在核盘菌胁迫下显著提高了SOD、POD和CAT活性,降低了MDA含量。初步推断HaPR1具有抗核盘菌的功能。     

大薯病程相关蛋白1(PR1)基因及其启动子序列的克隆与分析

为了研究大薯Da PR1基因的表达模式及调控机理,本研究利用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,从高抗炭疽病大薯材料Da94中获得1个病程相关蛋白1(pathogensis-related protein 1,PR1)基因,命名为Da PR1。测序显示该基因包含长度为501 bp的完整开放阅读框(ORF),预测编码166个氨基酸。生物信息学分析表明该基因编码的蛋白具有典型SCP-PR1-like保守结构域,Blast比对表明Da PR1蛋白与多种植物的PR1蛋白高度同源。实时荧光定量PCR检测表明,Da PR1基因在高抗种质中受炭疽菌显著诱导,在侵染48 h时其相对表达量达到最大。通过巢式PCR扩增Da PR1上游转录调控序列的5'端,获得1 203 bp的Da PR1基因启动子,序列分析表明该区域除了含有基础的启动子元件CAAT-box和TATA-box外,还存在茉莉酸(JA)、赤霉素(GB)等激素响应元件及真菌诱导响应元件(W-box)。本研究通过克隆和分析Da PR1基因及其启动子序列,为进一步研究该基因的功能及其表达调控机制奠定了基础。     

病程相关蛋白-1a多克隆抗体的制备与应用

为获得效价高和选择性强的PR-1a抗体。根据NCBI GenBank中普通烟PR-1a一级结构信息,采用Blastn、Blastx和Expasy等软件进行序列同源性分析,获得1段序列特异性多肽,采用9-氟甲氧羰基固相合成法获得目的多肽,采用HPLC和LC-MS测定目的多肽的浓度和分子量。试验表明：目的多肽纯度达93.92%、分子量为2088.17;采用碳化二亚胺法制备获得Pep-KLH,并通过免疫新西兰大白兔获得多克隆抗体,采用间接-ELISA和Western blot测定其抗体效价和特异性,结果表明：抗血清在1:32000条件下,抗血清的吸光值(OD)约为1.0;经Western blot试验表明：抗血清和多克隆抗体可特异性识别烟草叶片组织内的PR-1a;同时,试验采用系统性获得性的免疫激活剂-BTH作用普通烟K-326,对作用后的0、6、12、24、48、76、144、96 h的烟草叶片总蛋白进行间接-ELISA,发现：BTH作用普通烟K-326 144 h后,PR-1a蛋白表达呈上调趋势;同时采用半定量RT-PCR试验也同样证实了BTH可诱导PR-1a基因表达上调,其表达上调趋势与间接-ELISA的研究结果相似。表明采用该方法制备的PR-1a多肽抗体具有较高的特异性和灵敏度,可用于免疫诱导剂等方面的研究。     

陆地棉开花相关基因GhFLP1的克隆与功能验证

为了明确陆地棉开花促进因子基因的作用,以中棉所36叶片基因组DNA和cDNA为材料克隆得到了开花相关基因Gh FLP1,分析了其特征及功能。该基因全长为537 bp,包含339 bp开放阅读框,编码112个氨基酸。预测分子量约为12.176 kDa,理论等电点为9.13。组织特异性表达分析表明,该基因在花蕾中优势表达,且在早熟品种(中棉所36、中棉所74)中表达量高于中熟品种(中棉所60、鲁棉研28)。启动子序列分析和外源激素处理实验表明该基因受水杨酸和赤霉素调控。农杆菌介导转化拟南芥发现,该基因能促使拟南芥莲座叶减少,开花期提前。荧光定量结果表明,在转基因拟南芥中,内源开花相关基因AtFT、AtLFY、AtAP1和AtSOC1表达量不同程度上调,AtFUL表达量基本不变,AtFLC表达量下调。研究结果显示该基因可能参与陆地棉开花时间的调控,为创制转基因早熟棉花新材料打下基础。     

向日葵HaLACS9基因的克隆与功能分析

长链酰基CoA合成酶(long-chain acyl-CoA synthetase, LACS)催化游离脂肪酸合成酰基CoA,在植物脂质代谢中发挥重要作用。本研究从向日葵中筛选并克隆得到1个LACS家族基因HaLACS9,同源比对表明HaLACS9具有LACS酶的保守结构域,与拟南芥(Arabidopsis thaliana)、莴苣(Lactuca sativa)和刺菜蓟(Cynara cardunculus) LACS9蛋白具有较高的相似性。亚细胞定位预测HaLACS9定位于叶绿体。HaLACS9启动子区含有多种逆境及激素响应相关元件。qRT-PCR分析表明, HaLACS9在向日葵多个器官中表达,在花后10 d的种子中优势表达。干旱、盐、外源脱落酸和赤霉素处理均能诱导HaLACS9基因在向日葵根、茎和叶中的表达。分析HaLACS9在向日葵种子发育不同时期的相对表达量发现, HaLACS9在向日葵种仁发育早期高水平表达,与籽油的快速积累密切相关。随着种子发育和籽油积累速率的减慢,HaLACS9转录水平呈下降趋势。缺陷型酵母互补试验证明HaLACS9具有酰基CoA合成酶活性,并且油酸是...     

棉花黄萎病相关基因GhAAT的克隆与功能鉴定

棉花黄萎病(Verticillium dahliae)是一种土传性真菌维管束病害,严重影响棉花的生产。本研究通过转录组数据分析筛选出一个与棉花黄萎病相关的氨基酸转运蛋白GhAAT基因,该基因在棉花根部响应黄萎病菌诱导表达。利用病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing, VIGS)技术研究其在棉花抗黄萎病中的功能。结果显示将该基因在棉花TM-1的叶片和根部沉默后,棉花对黄萎病抗性减弱,证明GhAAT基因参与调控了棉花抗黄萎病功能。发掘棉花抗黄萎病菌重要调控基因并揭示其分子机制对培育棉花抗病品种具有重要意义。     

花生病程诱导蛋白基因AhPIP1和启动子的克隆、序列分析及原核表达

本文采用RACE法克隆了花生病程诱导基因(pathogenesis-induced protein gene)全长,命名为AhPIP1,并在GenBank登录,登录号为EU860093.序列分析表明该基因的开放读码框579 bp,编码193个氨基酸.以YY20基因组DNA为模板PCR扩增获得AhPIP1基基因组序列长1 883 bp,包含3个外显子和长度分别为602 bp和600 bp的2个内含子.同源性比较发现AhPIP1与辣椒病程诱导蛋白CaPIP1(ABF72432,AAT35532)相似性达82%.采用Genome Walldng方法获得AhPIP1启动子,序列分析表明该启动子序列长513 bp,包含干旱胁迫、病程胁迫应答元件和生长素、赤霉素应答元件.构建pET32a-AhPIP1原核表达载体,转化表达受体菌Ecoli BL21,原核表达获得大小约40 kD AhPIPl融合蛋白,与推测的AhPIP1基因编码产物的大小一致,表明AhPIP1基因在大肠杆菌中能够表达.     

津田芜菁泛素化相关蛋白基因BrRUB1的克隆及表达分析

RUB1(related to ubiquitin 1)是植物和酵母中一种泛素类似蛋白质,是Cullin家族的一个成员。为阐释津田芜菁Br RUB1基因的表达特性,本研究克隆了津田芜菁RUB1基因的全长c DNA序列,命名为Br RUB1,Gen Bank登录号为KF501173。其ORF全长471 bp,编码156个氨基酸;亚细胞定位结果显示,Br RUB1-GFP定位于细胞核,表明Br RUB1蛋白可能在细胞核中发挥其功能。q RT-PCR检测Br RUB1的表达表明,该基因表达量在花蕾中最高,花瓣中次之,具有组织特异性。而且Br RUB1在芜菁根皮中的表达受长波紫外线(UV-A)诱导。     

萝卜扩展蛋白基因RsEXPB1克隆与表达特征分析

本文根据GenBank中扩展蛋白序列设计特异引物,从萝卜高代自交系"NAU-LVYH06"中克隆到一个扩展蛋白基因RsEXPB1(GenBank accession No.GQ387363,GQ387364).其编码区基因组序列长度为1 430bp,包括4个外显子和3个内含子;RT-PCR获得长度为898 bp的cDNA,开放读码框(ORF)为29～820 bp,推导编码263个氨基酸,含有1个组氨酸(His-Phe-Asp,HrD)功能域,ORF和推导蛋白序列与拟南芥AtEXPB3(GenBank accession No.NM118965)同源性分别为87%、92%.半定量RT-PCR检测到该基因主要在萝卜生育前期的幼叶、肉质根木质部和韧皮部中表达,且表达丰度可能与该部位细胞生长分裂状态相关,差异较明显.     

小麦热胁迫相关蛋白Hsa32基因的克隆

热胁迫相关蛋白Hsa32主要存在于陆生植物中,Hsa32参与植物获得性耐热性的维持。本研究以37℃热胁迫1h的小麦幼苗叶子为材料,提取总RNA,结合RT—PCR和RACE的方法克隆获得小麦Hsa32基因,该基因完整的开放阅读框全长885bp,编码294个氨基酸。编码的氨基酸与水稻中Hsa32（OsHsa32）同一性最高,达83％,与拟南芥中Hsa32（AtHsa32）有66％的同一性,与番茄中Hsa32（LeHsa32）有63％的同一性,由此将其命名为TaHsa32。Northern杂交结果表明,TaHsa32是一个诱导型热激蛋白。     

植物病程相关蛋白PR10研究进展

PR（pathogenesis related protein）蛋白产生与积累是植物体应答生物或非生物胁迫的主要特征之一。近年来大量PR蛋白被鉴定,根据它们的结构,亲源关系和生物活性,被分为17个功能家族。PR10蛋白具有核酸酶相似结构,一般为分子量16～19kD的酸性蛋白。近年来相关研究表明一些PR10蛋白具有核酸酶活性和体外抗菌活性,在植物防御反应中发挥重要作用,具有较为广泛的应用前景。本文就PR10蛋白的生理功能、基因结构、表达调控及其与植物抗病的关系等方面的最新研究进展作一综述,并结合本实验室工作展望其在植物抗性育种方面的应用前景。     

马铃薯晚疫病抗性相关基因StDIR1的克隆与表达

马铃薯是世界性粮蔬作物。致病疫霉引起的晚疫病则是马铃薯育种所面临的最严峻问题之一,因此,分离和利用马铃薯晚疫病抗性基因获得抗病新品种是马铃薯育种的重要目标。首先在连翘中发现的一类与木质素合成相关的Dirigent基因可能在植物抗病虫害过程中起重要作用。试验根据马铃薯的EST序列信息设计特异性引物,并通过RT-PCR和RACE技术获得了一条全长为729 bp的Dirigent基因cDNA序列,命名为StDIR1;该cDNA编码一个包含191个氨基酸的蛋白质多肽;系统进化分析表明,该多肽是一种Dirigent-like蛋白,属于DIR-b亚群,与陆地棉Di-rigent-like protein 1相似性高达76%,同一性为62%。利用半定量RT-PCR技术分析发现,致病疫霉、H2O2以及NO可以诱导该基因不同程度的上调表达。组织特异性分析表明,该基因在马铃薯根组织中表达量最高,而在茎、叶、花以及块茎组织中的表达量偏低。首次表明StDIR1基因与马铃薯对致病疫霉的侵染应答具有相关性。     

陆地棉GhBZR1基因的克隆及功能研究

[目的]BZR1是油菜素内酯(Brassinosteroid,BR)信号通路中关键的转录因子,去磷酸化后可直接调控BR信号通路下游基因的表达,影响植物的生长发育和免疫反应.明确其功能对了解棉花的抗/感病分子机制具有重要意义.[方法]分析未接种和接种黄萎病菌(大丽轮枝菌,Verticilium dahliae)的中植棉K...     

家蚕糖转运蛋白BmST1基因的克隆与序列分析

糖转运蛋白运输葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖等透过细胞膜为机体提供能量。根据GenBank已登陆的其它物种的糖转运蛋白序列与家蚕基因组框架图和EST序列获得家蚕同源糖转运蛋白基因BmST1。基因编码区长1 392 bp (GenBank登录号：FJ373021),编码463个氨基酸,预测蛋白分子质量为51.635 kDa。序列分析显示基因有2个外显子,含有11个跨膜结构域。RT-PCR表明该基因仅在本文所检测的家蚕丝腺中表达。     

玉米半乳糖代谢相关酶蛋白基因的克隆及表达

随着全球气温的逐年升高,玉米的生长发育在部分地区常遭受高温胁迫危害,严重影响了玉米的产量和品质,而玉米半乳糖代谢相关酶基因的表达又与高温胁迫相关.为了了解玉米半乳糖代谢通路中相关的酶基因的结构及表达信息,在高温胁迫条件下,以具有不同耐受高温胁迫能力的两个玉米品种为材料,基于转录组测序技术,对其花粉细胞中与半乳糖代谢相关...     

海岛棉DELLA蛋白编码基因GbGAI的克隆与功能初步分析

赤霉素在棉花纤维发育过程中起着重要作用。DELLA蛋白是赤霉素信号传导通路中的一类重要负调节因子。通过同源克隆的方法,克隆了新疆特有棉花栽培种海岛棉中DELLA蛋白的同源基因GbGAI。序列比对分析表明GbGAI编码的氨基酸序列具有DELLA蛋白的典型结构域。构建其过量表达载体,通过农杆菌侵染花序的方法转入野生型拟南芥中,观察表型。转基因株系表现出晚花,株高变矮等赤霉素不敏感突变体的表型。     

谷子DnaJ蛋白基因的克隆

DnaJ蛋白是近年研究较多的同热激等胁迫反应相关的基因。本研究用0.8%NaCl胁迫下的谷子幼苗提取RNA,用反转录酶M-MLV扩增得到第一链cDNA,再以第一链cDNA为模板进行PCR扩增,克隆获得了完整的谷子DnaJ蛋白基因,该基因cDNA全长1 260 bp,编码419个氨基酸,具有DnaJ蛋白分子伴侣系统的3个保守结构域。将谷子DnaJ蛋白基因构建入表达载体pGFP,获得了谷子DnaJ基因的表达载体。该基因的克隆和表达载体构建,为谷子DnaJ蛋白基因的功能分析以及谷子耐热抗旱机理研究有重要意义。     

巴西橡胶树雄性不育相关基因HbGEX1的克隆与表达分析

蛋白配子表达1项目(Protein GAMETE EXPRESSED 1, GEX1)是一种膜蛋白,在植物物种中非常保守。本研究前期利用转录组测序技术筛选得到了与橡胶树雄性不育相关的差异表达基因GEX1序列,但其相关功能并未得到验证。本研究通过RT-PCR方法从巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)中克隆得到一个GEX1的全长c DNA序列,命名为HbGEX1,其ORF长度为1 785 bp,编码594个氨基酸,理论等电点为5.51,相对分子质量为68.66 k D,总平均亲水性GRAVY为负值,为疏水性蛋白,亚细胞定位预测结果表明定位于细胞核中不是分泌蛋白,Hb GEX1具有信号肽,且信号肽的剪切位点位于第19和第20号氨基酸之间,具有3个跨膜螺旋结构,进化树显示HbGEX1与木薯(Manihot esculenta)的HbGEX1蛋白聚为一类,亲缘关系较近。荧光定量PCR结果显示,HbGEX1在巴西橡胶雄花中的表达量比较高,在不育品种中基因的表达量高于可育品种,在橡胶树雄花的3个不同发育时期(小孢子母细胞时期,四分体小孢子时期,单核花时期)中可育品种与不育品种的表达均呈...