乙醇脱氢酶Ⅰ类基因全长cDNA的克隆与表达

Ⅰ类乙醇脱氢酶(ADH)在乙醇的肝代谢中发挥重要作用,由ADH1,ADH2和ADH3组成。根据序列数据设计一对引物,利用RT-PCR同时克隆乙醇脱氢酶Ⅰ类基因全长cDNA。测序后的cDNA被克隆在表达载体pTYB11上并在大肠杆菌中稳定表达。纯化获得的酶通过其在340 nm处吸光值的变化进行酶活性测定。经检测重组ADH1,ADH2和ADH3的酶活力分别为2.0±0.3,0.8±0.2,1.5±0.2 U.mg-1。     

限氧与通氧条件下米根霉ADH突变株的碳代谢特性

【目的】乙醇脱氢酶（ADH）是米根霉发酵生产L-乳酸代谢途径中的支路关键酶，选育米根霉ADH突变株，降低ADH活力，可以提高乳酸转化率。【方法】利用亚硝基胍（NTG）诱变米根霉As3.3462，在含丙烯醇的YPD选择培养基上筛选获得ADH突变株，研究了突变菌株在限氧与通氧条件下的乙醇、乳酸、ADH与L-乳酸脱氢酶（LDH）的特性。【结果】 获得11株ADH突变株，其中mut-2突变株在通氧和限氧条件下对乳酸的转化率比出发菌株分别提高了84.6%和175%，而对乙醇的转化分别下降了39.5%和59.8%。mut-2突变株的最大ADH活力在通氧和限氧条件下均比出发菌株降低，而LDH活力在限氧条件下显著增加，通氧条件下变化不明显。【结论】氧气的供给对米根霉发酵产L-乳酸的产物组成比例影响很大，限氧发酵条件下ADH活力提高，乙醇积累。结果还表明，通过筛选米根霉ADH突变株，是获得L-乳酸高产菌株的一种简单快速的有效手段。     

柴油降解酵母复合菌的筛选、鉴定及培养条件优化

以柴油为惟一碳源,用富集、驯化培养基从舟山港口柴油污染海水和海泥中筛选得到4株高效柴油降解酵母菌(Yeast)C_1、C_2、D_1、D_3,其柴油降解率为(70.49±2.50)%~(78.76±1.24)%。对4株菌进行3菌和4菌的相同比例的随机组合构建混合菌群,从中筛选得到最佳柴油降解复合酵母菌S1-5(C_2+D_1+D_3),降解率达到(85.30±1.29)%。再通过形态学观察、生理生化特征分析及16S rDNA、26S rDNA测序等方法对构成最佳降解复合菌的3株单菌进行鉴定。通过分子鉴定,得到酵母菌C_2、D_1、D_3都是耶罗维亚酵母属(Yarrowia),其中C_2和D_3是解脂耶罗维亚酵母(Yarrowia lipolytica)。在模拟污染水域实际物化条件的基础上优化培养条件,优化试验获得酵母复合菌S1-5的最佳培养条件为盐度30‰,NH_4NO_31.5 g/L,MgSO_4·7H_2O 0.3 g/L,KCl 1 g/L,FeCl_3·6H_2O 50 mg/L,在该条件下其降解率达到(82.79±1.38)%。     

一株DBP高效降解菌的筛选及降解特性研究

邻苯二甲酸二丁酯(DBP)属邻苯二甲酸酯(PAEs),DBP与基质间非共价键连接,是环境污染物。由于DBP性质相对稳定,微生物降解是其降解主要途径。试验从荒废污染设施土壤中成功筛选一株DBP高效降解菌,经16S r RNA比对与剑菌(Ens ife r sp.)相似度为99%,将其命名为DNB-S2。经研究发现DNB-S2最适生长条件为:温度35℃;p H 7.0;DBP浓度500 mg·L~(-1);转速125 r·min~(-1)。DNB-S2能利用高浓度DBP,在500 mg·L~(-1)DBP浓度下,48 h内降解率达95%。底物广谱性研究发现DNB-S2可降解PAEs家族中其他污染物邻苯二甲酸二甲酯(DMP)、邻苯二甲酸二乙酯(DEP)和邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(DEHP)。为PAEs污染的生物降解提供理论基础和技术支持。     

提高埃及糖橙遗传转化效率的研究

为提高农杆菌介导的甜橙遗传转化效率,以埃及糖橙实生苗上胚轴节间茎段为外植体,对实生苗生长过程中的光照条件和农杆菌侵染时的共培养条件进行优化,并将无核基因转入糖橙中。结果表明,暗培养20 d后光照10 d实生苗外植体的再生率和转化率均较高;乙酰丁香酮(AS)浓度是影响转化效率的主要因素,共培养基中加入质量浓度20 mg/L 的AS、共培养温度控制在19 ℃、共培养基pH为5.4~5.7时最有利于转化,经GUS染色分析,最高GUS阳性率可达29.4%;经PCR进一步分析,可以初步确证外源基因已经整合到糖橙基因组中。     

可循环利用ZnO薄膜的制备及其光催化降解甲基橙的研究

采用液相沉积法(LPD)在玻璃基底上制备了Zn5(OH)8(CH3COO)2·2H2O薄膜,然后经高温焙烧获得ZnO薄膜.利用热重(TG)、X射线衍射(XRD)、比表面积(BET)、扫描电子显微镜(SEM)和紫外-可见漫反射光谱(UV-Vis DRS)等技术对所制备的ZnO薄膜结构进行了表征.以甲基橙(MO)降解反应为...     

番木瓜炭疽病生防木霉菌株的初步筛选

为利用生物防治的方法抑制番木瓜炭疽病,通过测定并综合分析比较各木霉菌株的抗生作用、产孢量、不同培养基下的抑菌率、生长速度以及耐药性,从90株木霉菌株中初步筛选出拮抗番木瓜炭疽菌的优良木霉菌(Trichodermaspp.)T05-049、T8-R、T05-035和T05-044等4株菌株,其产孢量分别为1.42×109、5.45×108、4.16×108、1.38×109;在1.01 mg/L特可多的条件下,均生长良好;该4个菌株在25、20、15和10℃下生长正常,耐温性较好,对炭疽菌(Colletotrichumspp.)的抗生作用分别为3、1、1、5;分别在PDA和番木瓜培养基上于25、20和15℃下培养,木霉对胶孢炭疽菌(C.gleosporioides)的抑制率在57.05%以上,对辣椒炭疽菌(C.capcisi)的抵制率在47.87%以上.     

代谢木糖产乙醇酵母菌株的筛选研究

[目的]筛选代谢木糖产乙醇的酵母菌株。[方法]以木糖为唯一碳源,从自然环境中筛选了木糖利用酵母菌,并对筛得菌株进行了发酵性能的测试。[结果]共筛得4株菌株C4、C5、H5和M2,其中C4菌株24h发酵木糖为乙醇的效率最高（38％）,但M2茵株乙醇产量最高（0．438g／L）。由于酵母菌发酵木糖产乙醇随着发酵时间延长会消耗产物,导致原料转化率下降,因而发酵时间不宜过长。[结论]结合木糖转化率随发酵时间的变化趋势,以M2菌株的发酵性能最为优良。     

快速筛选小麦转化后代高蛋白突变株的加代技术研究

确立了一种快速筛选小麦高蛋白转化后代材料的温室加代技术。比较了不同的幼胚形态、春化时间及温室温度对小麦生长的影响后 ,确定下述加代流程 :用授粉后 1 2～ 1 6d的幼胚培养直接成苗 ,在 4～ 8℃条件下春化 2 5d ,移栽入温室 ,控制温度、湿度 ,促其在 35～ 40d内开花、授粉 ,继续进行下一轮培养。此法简便、快速 ,能在 70d左右完成小麦 1代生长周期 ,不间断连续培养 ,可 1年繁殖 5代 ,显著缩短小麦生育周期 ,适合进行大量高蛋白突变株的筛选。     

毕赤酵母发酵不同单糖产乙醇的研究

以毕赤酵母CBS 6054(Scheffersomyces stipitis)为试验菌株,用葡萄糖和半乳糖2种六碳糖,木糖和阿拉伯糖2种五碳糖分别作为惟一碳源进行发酵试验,测定毕赤酵母在不同培养基中的生长曲线、糖消耗情况、产物乙醇生成情况,由此研究该菌株发酵不同单糖的能力以及对应的产乙醇的潜力。结果表明该菌株对葡萄糖和木糖的发酵能力较强,且两者发酵情况相当;发酵半乳糖的能力居中;发酵阿拉伯糖的能力较弱。乙醇产量从高到低依次是葡萄糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖。     

四株虫生真菌代谢产物对植物真菌性病害的抑制作用

采用十字交叉法测定4株虫生真菌代谢产物对小麦纹枯病菌(Ceratobasidium cornigerum)、小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)、葡萄炭疽病菌(Glomerella cingulata)、梨黑斑病菌(Alternaria kikuchiana)、柑橘绿霉菌(Penicillium digitatum)的抑菌作用。结果表明,4株虫生真菌代谢产物对5种植物真菌性病害菌落生长均有一定的抑制作用,其中以卵胞白僵菌(Beauveria brongniartii)菌株BE-1对5种供试植物病原真菌菌落生长的平均抑制率最高。表明利用虫生真菌代谢产物对开发抗植物病原菌活性物质具有较大的开发潜力,值得进一步深入研究。     

一株转化葛根素大型真菌菌株的筛选鉴定及其转化产物

以七叶苷显色反应筛选β-葡萄糖苷酶的产酶菌株为基础,从90余大型真菌菌种中筛选出1株生长速度及菌丝状态较好,且可以有效转化葛根素的大型真菌菌株(编号1924),并鉴定确认该菌株为多孔菌科多孔菌属(Polyporus submelanopus),得到了较纯的粉末状葛根素转化产物.经高效液相色谱分析鉴定,该转化产物为3'-...     

海藻酸钠包埋的酵母菌转化人参皂苷Rb1的研究

为探索海藻酸钠包埋酵母菌转化人参皂苷Rb1的最佳条件,选用浓度为1.25×108个·mL-1的酵母菌菌悬液进行包埋,使用紫外分光光度计测定发酵液中人参皂苷Rb1含量变化计算生物转化率。通过单因素和正交设计试验分别考察海藻酸钠浓度、包埋时间、接种量和CaCl2浓度对所包埋的酵母菌转化人参皂苷的影响,最终获得了海藻酸钠包埋酵母菌转化人参皂苷Rb1的最佳条件为包埋时间45min,接种量7%,海藻酸钠浓度5%,CaCl2浓度10%。在该条件下,所包埋酵母菌对人参皂苷Rb1的最高生物转化率为31.51%,较以往未包埋的酵母菌转化人参皂苷Rb1的生物转化率提高约3%～5%。本研究首次利用海藻酸钠包埋酵母菌转化人参皂苷Rb1,解决了酵母菌种子不能重复使用等问题,简化了灭菌、菌种活化等步骤,为人参皂苷Rb1等苷类物质的高效生物转化提供了很好的思路和可借鉴的成功范例。     

用单性结实基因defH9-iaaM转化糖橙的研究

为建立糖橙的高效遗传转化体系,把无融合生殖基因DefH9-iaaM导入到糖橙中,以获得定向改良目的性状的糖橙新种质.以实生态糖橙节间茎段为材料,建立了糖橙的高效再生体系.结果显示,30 d左右苗龄的实生态糖橙茎段不定芽再生率较高;暗培养3~6 d有利于节间茎段不定芽的分化;不定芽再生的最佳培养基配方为MS附加6-BA 5.0 mg/L,平均每根茎段可以再生3.3个小芽;MS 6-BA 1.0 mg/L NAA 0.1 mg/L有利于不定芽的增殖;MS附加NAA 0.5 mg/L有利于再生芽的生根.用农杆菌介导法进行转化后,经PCR鉴定已获得6 株转基因株系.     

富硒酵母的筛选鉴定及其作为鱼饲料的应用研究

将泡菜汁样品稀释后涂布到含1 g/L Na_2SeO_3的YEPD培养基上,筛选出一株耐硒菌株FXY-4,用不同Na_2SeO_3浓度的YEPD培养基培养,发现Na_2SeO_3的浓度为0.5 g/L时菌株富硒能力最强,为0.54mg/g(干重)。运用分子生物学和生理生化方法鉴定FXY-4为光滑假丝酵母(Candida glabrata)。将FXY-4添加在鱼饲料中喂食锦鲤,探究其对锦鲤的生长与血清酶学指标的影响,结果显示添加菌株FXY-4能提高锦鲤生长、免疫学指标和鱼肉中有机硒的含量。     

橙带蓝尺蛾的发生规律及防治措施

对橙带蓝尺蛾(Milionia basalis Walker)的形态特征、生活习性、发生及为害情况进行了详细的观察和研究,并分析其在粤东地区暴发为害的原因。结果表明,橙带蓝尺蛾是一种典型的寡食性害虫,主要取食罗汉松[Podocarpus macrophyllus(Thunb.)D. Don]和竹柏[Podocarpus nagi(Thunb.)Zoll. et Mor ex Zoll.]叶片。适宜的气候环境、罗汉松的大面积种植和疏于管理是暴发橙带蓝尺蛾虫害的主要原因。最后,针对该虫害暴发的原因提出综合防治措施。     

桑树PDS基因VIGS转化体系的构建与鉴定

[目的]建立桑树的病毒诱导基因沉默(VIGS)转化体系,为桑树功能基因的分析研究提供技术支持.[方法]以丰驰桑为试验材料,克隆含BamH I和Xba I酶切位点的八氢番茄红素脱氢酶(PDS)基因片段,经Xba I和BamH I双酶切后与烟草脆裂病毒(TRV)连接构建重组病毒载体pTRV2-PDS,转化农杆菌GV3101后通过压迫注射方式侵染桑树幼苗叶片.[结果]克隆获得的桑树PDS基因干扰片段346 bp,与改造后的TRV质粒连接可成功构建携带桑树PDS基因的重组病毒载体pTRV2-PDS.桑树叶片被侵染15 d后,接种重组病毒载体pTRV2-PDS桑树的第二轮真叶开始出现叶片白化现象,侵染20 d后,白化现象沿叶脉向四周逐渐扩散,叶片呈现明显的白化表型.实时荧光定量PCR检测结果显示,重组病毒载体pTRV2-PDS侵染的桑叶PDS基因相对表达量仅为阴性对照(pTRV2)的58%,二者差异极显著(P<0.01),表明桑树PDS基因表达被有效抑制.[结论]利用TRV构建的桑树VIGS体系能有效沉默PDS基因,使桑树叶片呈现明显的白化症状,即可用于后续的桑树功能基因鉴定.     

热休克蛋白对枯草芽孢杆菌抗逆性和乙醇产量的影响

[目的]研究热休克蛋白对增强枯草芽孢杆菌的抗逆性和增加乙醇产量的影响。[方法]运用基因工程技术,用大肠杆菌的Lac启动子、运动发酵单胞菌丙酮酸脱羧酶基因(pdc)和乙醇脱氢酶基因(adhB),构建在枯草芽孢杆菌中表达的BLAP操纵子,BLAP操纵子导入枯草芽孢杆菌可使其发酵糖生产乙醇。然后用超嗜热菌强烈火球菌(Pyrococcusfuriosus)的小分子热休克蛋白基因(sHsp)构建在枯草芽孢杆菌中表达的BLAPH操纵子。[结果]成功地构建了能表达小分子热休克蛋白,产生乙醇的枯草芽孢杆菌。[结论]小分子热休克蛋白的表达,使枯草芽孢杆菌在致死温度下的存活率显著提高,对温度及乙醇的耐受性显著增强。同时枯草芽孢杆菌的乙醇产量显著提高。     

一株野生酵母的SOD酶酶学特性的鉴定

对前期试验分离、筛选到的一株有较高SOD酶生产能力的野生酵母菌株YT-5,经发酵后提取、纯化其SOD酶。对纯化后的SOD酶的热稳定性、耐酸碱性及对蛋白酶耐受性、存放时间等酶学特性进行了研究,发现此菌株产生的SOD酶对热、酸、碱和蛋白酶都有较好的稳定性,也表现出一定的存放稳定性。从酶学特性方面初步鉴定,YT-5可用作微生态制剂生产菌株,且有一定的开发潜力。