产抑菌活性物质放线菌菌株的筛选

[目的]筛选产抑菌活性物质的放线菌菌株。[方法]以金黄色葡萄球菌、对青霉素和头孢菌素类耐药的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌作为指示菌,采用滤纸片扩散法对300株放线菌的发酵产物进行抗菌活性筛选,通过最小抑菌浓度法（MIC）对筛选的阳性菌株进行抗菌活性测定。[结果]筛选到抗菌活性物质产生菌111株,抑菌率为37.0%;其中对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和耐药金黄色葡萄球菌有抑制活性的菌株分别为111、10和47株。各菌株的最小抑菌浓度有很大差别,菌株174883对金黄色葡萄球菌的抑菌活性最强,其发酵样品稀释到2 048倍仍然表现出抑菌活性。用青霉素酶和头孢菌素酶作用于阳性菌株发酵产物,筛选到6株菌株代谢产物的抑菌活性变弱,菌株32349和kj0428的抑菌活性被抑制最明显。[结论]筛选得到的阳性放线菌菌株具有良好的抗菌活性,为新型抗生素的筛选提供了研究基础。     

基于重组毕赤酵母的鳜鱼β-防御素生物合成及其抑菌活性

鳜鱼β-防御素(Siniperca chuatsiβ-defensin,ScBD)多肽链由N端的信号肽和C端的成熟肽组成,通过构建产鳜鱼β-防御素的毕赤酵母重组菌株,以解决天然免疫小分子抗菌肽的来源问题。通过RT-PCR从鳜鱼脾脏中分离编码β-防御素成熟肽的基因ScBD,将其与表达载体pPICZαA连接后构建重组表达载体pPICZαA-ScBD并转入毕赤酵母X-33;通过含高浓度博来霉素的YPD平板筛选阳性转化子后,于28℃、250 r/min和pH 6.0的条件下,使用1%甲醇诱导表达96 h;经镍离子亲和层析对重组毕赤酵母菌株的产物进行纯化,并对纯化产物进行MALDI-TOF/TOF质谱鉴定;通过平板涂布法和浊度法检测该重组菌株产物的抑菌活性。结果表明:基于质谱分析的一级结构鉴定证明纯化产物为分子量6.35 ku的预期重组ScBD;抑菌实验显示重组菌株产物对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和副溶血性弧菌(Vibrio parahemolyticus)的抑制率分别为94.34%、86.97%和85.92%。本文构建的重组毕赤酵母菌株能有效合成具有生物学活性的重组ScBD,为鱼类来源天然小分子抗菌肽的进一步开发提供了技术途径。     

抗玉米大斑病生防菌株KD 16-13的诱变改良

利用紫外诱变技术,对高拮抗菌株KD16-13进行诱变改良,通过致死率和正突变率试验,确定诱变时间为3.00 min,诱变后得到12株菌株,对诱变菌株抑菌活性进行测定,筛选出高抑菌活性菌株UV-KD-9,对玉米大斑病菌抑菌率达到81.91%,对其稳定性进行了测定,转代10代,UV-KD-9仍对玉米大斑病菌具有较高抑菌活性。最终筛选出UV-KD-9进行下一步研究。     

猪α干扰素在毕赤酵母中的高效表达和纯化

为了研制新型的猪用抗病毒制剂,开展了猪α干扰素（PoIFNα）在毕赤酵母中的表达和产物纯化研究。将PCR扩增的PoIFNα基因插入pPIC9k的SnaBⅠ和EcoRⅠ位点,构建了表达转移载体pPIC9k/PoIFNα;经酶切和测序鉴定,转移载体构建正确。pPIC9k/PoIFNα以限制性内切酶SalⅠ线性化后电转化毕赤酵母GS115菌株,经抗性筛选获得4拷贝PoIFNα基因的重组菌株GS115/PoIFNα;重组菌株经BMMY培养基诱导后上清中有目的蛋白,表达量达136 mg/L。表达产物经过SP-Sepharose 阳离子交换层析,可以得到纯度较高的rPoIFNα,纯化产物在MDBK细胞上抑制VSV的活性高达2.27×108 U/mg。     

草果疫病初步研究*

 从发病的草果茎杆上组织分离得到草果疫病病菌，用不同农药进行药剂筛选试验，经哈茨木霉（Trichoderma harzimum）不同菌株和病菌在PDA平板上对峙培养，结果表明：易保1000倍药液下病菌菌丝无法生长，百菌清600倍、易保1500倍、春雷霉素400倍药液对病原菌菌丝生长抑制率在60%以上；哈茨木霉不同菌株对草果疫病病原菌有很好的抑制力，且药物诱变和紫外线诱变的突变菌株抑菌效果比野生型菌株好。     

刺参机体酵母菌组成及其拮抗活性的研究

采用PDA、YPD、MEA培养基从刺参Apostichopus japonicus的体表、肠道和呼吸树分离出23株酵母菌,使用玻璃珠破碎方法提取其DNA,然后用酵母菌通用引物NL-1/NL-4从DNA中成功扩增出26S rDNA片段,将PCR产物迸行测序,将各菌株序列在GenBank数据库中进行检索,从Blast比对结果中取相似性最高的序列,用Mega 4.0软件对所有序列进行聚类分析,采用邻接法构建系统发育树.结果表明:从大连柏岚子海域刺参中分离出的菌株分别属于红酵母属、梅奇酵母属和丝孢酵母属,从大连市黑石礁海域刺参中分离出的菌株分别属于红酵母属、假丝酵母属、德巴利氏酵母属、有孢汉逊酵母属和毕赤酵母属;以8株刺参病原菌作为指示菌,采用双层琼脂扩散法对分离菌株的拮抗活性进行测定,获得拮抗酵母菌17株,占总测试菌株的73.9％,从刺参机体的体表、肠道和呼吸树可以筛选出不同得率的活性菌株,其抗菌谱和活性强度各不相同,其中C11菌株的抗菌谱最广,抗菌活性最强;从肠道分离出的拮抗菌C11、C14和C21菌株的胞外产物经硫酸铵沉淀后也具有抗菌活性,C14菌株胞外产物经65％硫酸铵沉淀获得的粗提物对热和蛋白酶K敏感,表明其拮抗物质为蛋白质.     

限氧与通氧条件下米根霉ADH突变株的碳代谢特性

【目的】乙醇脱氢酶（ADH）是米根霉发酵生产L-乳酸代谢途径中的支路关键酶，选育米根霉ADH突变株，降低ADH活力，可以提高乳酸转化率。【方法】利用亚硝基胍（NTG）诱变米根霉As3.3462，在含丙烯醇的YPD选择培养基上筛选获得ADH突变株，研究了突变菌株在限氧与通氧条件下的乙醇、乳酸、ADH与L-乳酸脱氢酶（LDH）的特性。【结果】 获得11株ADH突变株，其中mut-2突变株在通氧和限氧条件下对乳酸的转化率比出发菌株分别提高了84.6%和175%，而对乙醇的转化分别下降了39.5%和59.8%。mut-2突变株的最大ADH活力在通氧和限氧条件下均比出发菌株降低，而LDH活力在限氧条件下显著增加，通氧条件下变化不明显。【结论】氧气的供给对米根霉发酵产L-乳酸的产物组成比例影响很大，限氧发酵条件下ADH活力提高，乙醇积累。结果还表明，通过筛选米根霉ADH突变株，是获得L-乳酸高产菌株的一种简单快速的有效手段。     

抗真菌抗生素产生菌UEZC的~(60)Co-γ射线诱变育种

为筛选高产抗真菌抗生素菌株,用出发菌株UEZC经60Co-γ射线辐射诱变,以拮抗菌对峙法初筛,琼脂块法、管碟法复筛,筛选到高产突变株MUE-4,其抑菌活性较UEZC菌株提高了近1倍,遗传稳定性良好.     

产甲壳素酶菌株的筛选与诱变

以胶体甲壳素作为惟一碳源,从自然界微生物中筛选并诱导到一株产甲壳素酶活性较高的菌株,经16S r DNA鉴定为Aeromonas sp.。并以该菌株作为出发菌株,经过一次紫外诱变,酶活是初筛菌株的1.48倍。再经过二次紫外诱变或者紫外-Li Cl复合诱变,酶活分别是初筛菌株的3.16和3.87倍,最高酶活达到3.48 U/m L。最后通过连续传代培养,确定了菌株HMX-16经过紫外和复合诱变后突变性状稳定性良好。     

假丝酵母的诱变育种

[目的]通过诱变育种提高假丝酵母油脂的含量。[方法]以假丝酵母为出发菌种,利用紫外诱变、微波诱变及紫外和微波复合诱变分别对出发菌株进行诱变,筛选出生物量和吸光度均较大的菌株。[结果]酵母菌经紫外和微波诱变其生物量均比对照提高。在酵母产脂高产菌株的筛选中,微波与紫外线复合诱变是一种比较有效的方法,获得一高产酵母菌株Candida Yeast-1,其生物量比出发菌株提高率为43.3%,菌体油脂的吸光度比出发菌株提高率为32.1%。用索氏提取法测定其脂肪含量,脂肪含量提高了17.2%。[结论]对假丝酵母进行紫外、微波及复合诱变均能有效地提高其产脂率。     

低温淀粉酶高产菌株的诱变选育

以一株解淀粉芽孢杆菌（Bacillus a myloliquefaciens）A-4为出发菌株,采用紫外线（UV）和亚硝基胍（NTG）诱变,以期筛选出高产低温淀粉酶量诱变菌株;经紫外线诱变、亚硝基胍诱变、紫外线一亚硝基胍复合诱变,所得突变菌株经淀粉酶平板水解圈初筛、再经摇瓶发酵复筛,得高产低温淀粉酶突变株UNA46,其最大产酶量62．13U／mL,是出发菌株A-4的1．96倍;将UNA4-6连续传代6次,低温淀粉酶活性仍可达到第一代的99．7％,试验表明遗传稳定性好。     

侧孢短芽孢杆菌S62-9抗菌肽基因的初步定位

侧孢短芽孢杆菌S62-9可以产生高效广谱抑菌活性的细菌肽,为了确定该抗菌肽基因的遗传定位,本研究采用质粒消除和质粒转化进行正反论证。结果发现,电击法消除S62-9菌株的野生质粒pBLS62后,其突变株抑菌活性消失,而且对S62-9细菌肽的敏感性大大增强;而野生质粒pBLS62导入没有抑菌活性的枯草芽孢杆菌Wb800中,转化子Z4产生了抑菌活性,而且RP-HPLC结果表明Z4表达的抗菌物质与原始菌株S62-9抗菌肽为同一产物。从质粒消除和质粒转化与由此带来的表观性状的关系上,可以推断,侧孢短芽孢杆菌S62-9细菌肽及其免疫相关基因位于质粒而不是染色体上。     

1,3-丙二醇高产变异菌株的紫外诱变选育

在高效液相色谱同时检测多种组分的基础上,建立了高效液相色谱法测定克雷伯杆菌Klebsiella pneumomiae发酵甘油产物1,3-丙二醇(1,3-PD)含量的方法;同时应用单因素考查法确定较优的筛选高产1,3-PD生产菌株紫外诱变条件,并在逐步提高筛选平板培养基中甘油浓度(60～90g/L)的情况下经多轮诱变筛选,获得1株能够耐较高浓度甘油的高产1,3-PD的变异菌株.经考查,较优的紫外诱变条件为:紫外灯功率30W,照射距离34cm,菌体浓度108个·mL-1,稀释10-5倍后进行诱变筛选,较优照射时间为6min;经6轮诱变筛选,筛选出能够耐90g/L甘油的高产1,3-PD的变异菌株KVI-1,其1,3-PD的产量较原始菌株提高30%左右;变异菌株经6代遗传稳定性考察,甘油转化率均稳定在45%左右,1,3-PD产量稳定在40g/L左右,变异菌株KVI-1可作为生产工艺研究的出发菌株.     

高产壳聚糖酶菌株的筛选及诱变育种

目的]研究利用紫外线和硫酸二乙酯（DES）诱变得到产壳聚糖酶活性较高的菌株。[方法]利用以壳聚糖为唯一碳源的选择性培养基,从自然界中筛选得到1株产壳聚糖酶活较高的菌株,对其进行鉴定,并且利用紫外线和DES诱变方法来提高该菌株的产酶能力。[结果]经初步鉴定,大致判定产壳聚糖酶的Y-4菌株为烟曲霉（Aspergillus fumigatus）。经紫外线和DES诱变处理分别得到2株壳聚糖酶活性明显提高的突变株,其酶活分别为8.92和8.12 U/ml,分别是出发菌株Y-4（3.00 U/ml）的3.0和2.7倍。2株突变株经连续传代10次后均具有较高的产酶稳定性。[结论]紫外线诱变较DES诱变效果好。     

人溶菌酶在毕赤酵母中的表达及体外抑菌活性研究

对重组人溶菌酶真核表达载体的构建筛选、表达与活性鉴定,经过双酶切和测序鉴定表明,重组载体正确。电转化毕赤酵母GWDL菌株,通过G418抗性平板筛选得到高表达高效价菌株,经诱导表达,检测蛋白含量,体外抑菌检测,表达产物15 ku和预期结果一致,筛选得到效价为1 907 U/mL,编号为SMD1168-pPIC9k-HLZ的高效价菌株;采用重组人溶菌酶制剂,检测样品GWDL对5种菌的最小抑菌浓度(MIC),藤黄微球菌的最小抑菌浓度较好,表明重组人溶菌酶在毕赤酵母中成功表达,活性较为稳定。     

具有抗菌活性红树林土壤放线菌BH0951的分离和鉴定

以广西北海红树林高盐泥样为材料,采用高氏1号培养基对其中的菌株进行分离纯化,通过抗菌试验筛选出1株放线菌BH0951,该菌株的发酵产物具有较强的抗菌活性,其最适生长温度为28℃,最适生长pH值为7.0。提取其总DNA,采用通用引物对其16S rDNA进行PCR扩增,并对扩增产物进行序列测定。结果表明,BH0951为链霉菌属（Streptomyces aurantiogriseus）AY999773的变种。     

小麦纹枯病生防菌株S 024的诱变育种研究

采用5种诱变方法(紫外线、微波、LiCl,LiCl 紫外线、LiCl 紫外线 微波)对出发菌株S 024进行了诱变处理.结果表明,几种诱变方法对S 024的诱变效果差异较大,紫外线(UV)照射和LiCl处理均未能筛选到正突变菌株;微波(MV)处理(50,100 s)可选育出高效菌株,LiCl和UV复合诱变处理的效果最好,共筛选到3个高效菌株(LiU-024-1,LiU-024-4,LiU-024-9),其中LiU-024-4菌株抑菌率比出发菌株S 024提高了34.44%;连续3代转代培养,其产生抗生素的能力基本稳定.用MV对3株高效菌株再进行诱变处理,其抑菌活性基本没有提高.     

三尖杉内生真菌S19次生代谢产物的结构与活性

为探明三尖杉内生真菌S19的次生代谢产物的结构与活性,采用形态学特征和ITS序列鉴定菌株,利用硅胶柱层析、Sephadex LH-20柱层析和重结晶等方法对该菌株的发酵产物进行分离、纯化,并结合所得化合物的理化性质和波谱数据鉴定其结构,通过测试菌对其次生代谢产物进行活性测试。结果表明：菌株 S19为黄曲霉（Aspergillus flavus ）,从其发酵产物中分离得到6个化合物,分别为5-羟甲基呋喃-3-羧酸（1）、麦角甾醇（2）、β-谷甾醇（3）、豆甾-7,22-二烯-3β,5α,6α-三醇（4）、胶霉毒素（5）和丁二酸（6）。黄曲霉（S19）可以大量产生5-羟甲基呋喃-3-羧酸（1）。化合物1对大肠杆菌抑菌活性较好,其 MIC 值为15．6μg／mL;化合物5对测试菌均有很好的抑菌活性。     

无花果内生真菌的抑菌活性筛选

以金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、大肠杆菌（Escherichia coli）为测试菌种,对无花果根、茎、叶中分离出的87株内生真菌进行活菌筛选,结果表明：无花果87株内生真菌中有36株对1种或多种指示菌有拮抗作用,其中对金黄色葡萄球菌有抑菌作用的有18株,对枯草芽孢杆菌有抑菌作用的有11株,对大肠杆菌有抑菌作用的有7株;活性菌株抗菌活性多以中等活性为主,高活性和低活性的菌株较少。从36株有活性的菌株中选出具有代表性的20株内生真菌的代谢产物进行抗菌活性筛选,结果表明20株菌株的代谢产物至少对1种供试菌株具有抑菌活性。     

农用抗生素产生菌No.24菌株诱变选育研究

以No．24菌株为出发菌株，采用紫外线、化学试剂、微波及超声波诱变法对其进行诱变。其中经微波诱变50s后，筛选得到一株高产菌株，命名为Ms-24菌株。在培养基中连续培养10代，其遗传性状非常稳定。Ms-24菌株发酵试验证明，其发酵产量比出发菌株提高23．25％；抗菌活性试验证明，其发酵液的抗菌活性比出发菌株提高了31．75％。