猪瘟病毒流行株的分离鉴定

猪瘟(CSF)是由猪瘟病毒(CSFV)引起的一种猪病毒性传染病，猪瘟兔化弱毒疫苗有效地控制了猪瘟在我国的急性发生和大流行。但是自80年代以来，我国开始出现了温和、非典型性猪瘟。究其原因，可能与CSFV出现了新的变异株等因素有关。尤其是亚临床感染猪，依靠常规方法很难确诊并剔除此类病猪，给CSF的防制工作带来新的困难。因此，有必要对现阶段猪瘟的流行情况进行调查，分离出流行的猪瘟病毒毒株，为猪瘟的防治奠定理论基础。     

猪瘟的流行与控制

猪瘟（Classical Swine Fever，CSF or Hog Cholera，HC）是由猪瘟病毒引起的猪的一种高度接触性传染病，被OIE列入A类传染病。早在20世纪50年代，我国便成功的培育出1株免疫原性好又安全的猪瘟兔化弱毒“C”株，它是目前国际上应用最广泛、我国惟一采用的猪瘟疫苗毒株，它的使用有效地控制了猪瘟在我国的急性发生和大流行，     

猪瘟病毒流行株与疫苗株主要抗原编码基因差异研究

从全国7个省市1200多份可疑猪瘟病料中分离出9个猪瘟病毒（HCV）野毒株，编号分别为HCV－01－09。将9株野毒分别通过PK15细胞分别通过PK15细胞传6代，测其毒价，并提纯做电镜观察，结果表明：毒价范围在10^2-10^7TCID50，电镜观察均可清晰地见到直径为25－70nm，略呈圆形的病毒颗粒，具有较完整的囊膜和纤突结构。从9株野毒中选取5株经猪瘟阴性猪各传3－4代，测其毒力、病原性、致死性，结果表明：各毒株在传代中其上述生物学特性上有变化和差别。用猪瘟兔化弱毒疫苗分别对这5株野毒做免疫保护相关性试验，结果证明：攻毒后的疫苗接种猪100％保护，而攻毒对照猪100％死亡，且对照猪在攻毒1周后便出现猪瘟野毒感染，而免疫猪在整个观察期均未见到野毒感染。用不同剂量的猪瘟兔化弱毒，表明猪瘟兔化弱毒不通过胎盘垂直感染仔猪。将猪瘟野毒株、石门系强毒株、兔化弱毒株及1982年分离的郑州野毒等毒株进行主要抗原编码基因差异研究，结果表明：猪瘟病毒可分2个基因组6个基因亚组，HCV－02、03、06、07等4个野毒株与国内的C株、石门强毒株、国外的C株、日本GPE株、ALD株、意大利Brescia株均属同一基困组，而HCV－08株及郑州株等2个野毒与法国的Alfor株同属另一个基因组。     

辽宁地区猪瘟病毒流行株E2基因序列分析

为了解近年来辽宁地区猪瘟流行毒株的遗传变异情况,本试验利用RT-PCR方法对2006年～2011年辽宁地区发病猪群中猪瘟病毒感染情况进行了检测并获得了20株猪瘟病毒E2基因部分编码序列的扩增片段,测序后得到276 bp的E2基因编码序列;并在此基础上利用DNAStar和MegAlign等软件对所测定的20株毒株与国内外参考毒株的相应序列进行了同源性分析及氨基酸序列比对.结果表明,20株猪瘟野毒株分别属于基因2.1、2.2亚型和1.1亚型,其中基因2.1亚型已经成为辽宁地区猪瘟病毒的优势流行毒株.属于基因2.1亚型的猪瘟野毒株与疫苗株之间的同源性在76.8％～80.5％之间,与经典强毒Shimen株的同源性在77.4％～81.1％之间.而病毒E2基因变异位点主要分布在所测序列的前30个氨基酸,与强毒Shimen株、疫苗株相比其变异率高达20％以上.说明近期流行毒株的变异呈现一定的多样性,并且多数毒株已向远离强毒Shimen株、疫苗株方向变异.     

猪瘟病毒贵州株E2基因序列分析

为了解猪瘟病毒贵州株GZPD E2基因变异情况,为贵州猪瘟疫苗的选择提供参考依据,试验采用RT-PCR方法对GZPD E2基因进行扩增,并对目的基因进行克隆、测序和序列分析。结果:(1)RT-PCR扩增获得大小为1 343 bp的基因片段,与预期扩增大小相符。(2)目的基因克隆、测序分析显示,GZPD与国内毒株shimen株、C株等在 E2基因上存在较高的同源性,为94.9%～99.9%;与国外毒株GPE、Koslov等的核苷酸同源性为95.1%～95.3%。(3)进化分析显示,GZPD与HuBei、C-ZJ-2008、C-strain、HCLV处于同一进化分支,而与shimen、CSFV-GZ-2009、Koslov、GPE处于不同的进化分支。结果表明:猪瘟病毒贵州株GZPD在 E2基因上存在一定变异,提示贵州猪瘟病毒存在一定的进化。     

北京部分地区猪瘟病毒流行株E2基因序列分析

为了解北京地区猪瘟病毒(CSFV)流行毒株的遗传变异情况,采用套式RT-PCR方法,对从北京部分地区近期分离的7株CSFV流行毒株的E2基因主要抗原编码区进行了扩增、克隆与序列测定,并应用DNA Star分析软件对所测定的7株毒株与国内外参考毒株的相应序列进行了同源性分析及氨基酸序列比对。结果表明,7株CSFV流行毒株之间核苷酸与氨基酸的同源性分别为96.3%～99.3%和95.6%～100%,与CSFV石门毒株(Shimen株)的核苷酸与氨基酸的同源性分别为81.7%～83.5%和82.4%～84.6%,与CSFV兔化弱毒株(HCLV株)的核苷酸与氨基酸的同源性分别为80.6%～81.7%和78.0%～80.2%,7株CSFV流行毒株均属于基因2群,且705、713、729和734位氨基酸发生置换。本研究初步揭示了北京部分地区目前流行的CSFV毒株与Shimen株和HCLV株在E2基因主要抗原区上存在较大差异。     

急、慢性猪瘟病毒分离株和疫苗株E2基因的序列分析

利用反转录（RT）及套式PCR（N-PCR）扩增并测定了6株具有不同表症近期甘肃省猪瘟流行野毒及C-株细胞疫苗毒的主要免疫原E2基因的核苷酸序列。序列分析比较结果表明，6株流行野毒与C-株疫苗毒的核苷酸同源性为82%-84%，流行野毒之间的核苷酸同源性在89%-99%之间，并且明显可分为二个组群，病毒株所属组群与其临床症状有一定的相关性。流行野毒与C-株毒在中和抗原决定簇上有部分氨基酸存在性质差异，可能影响C-株毒对流行野毒的中和滴度。     

猪瘟流行毒E2基因部分编码序列的分析与比较

利用PCT-PCR方法获得16个猪瘟流行毒株、5株弱毒疫苗株和外来的4株猪瘟E2基因部分编码序列的扩增片断，并对其进行测序，获得659bp含E2基因N段A、B、C、D四区域的编码序列。利用DNAstar软件对其中616bp的片段进行序列分析，并与Genebank中的Alfort、Brescia、HCLV、Shimen等毒株进行比较．结果20株病毒所测序列均为猪瘟E2基因序列，所有毒株碱基替换随机分布于整个序列．部分毒株出现碱基缺失现象。序列分析结果表明近期流行的毒株不仅与50年代流行的Shimen株、现用的疫苗株距离较远，而且流行毒株呈不同亚群方向演变。本研究所测的20株流行株E2基因N端6个与C端的2个半胱氨酸(Cys)均未发生变异．但其他位点的核甘酸变异与缺失．引起各区的抗原表位呈现不同程度的变异。     

中国猪瘟兔化弱毒株（C—株）兔脾组织毒主要保护性抗原E2（gp55）基因序列

利用反转录（RT）及套式PCR（N－PCR）方法扩增了中国猪瘟兔化弱毒株（C－株）兔脾组织毒主要保护性能抗原E2（gp55）基因，成功地将其克隆并测定了核苷酸序列，与国内外已发表的猪瘟病毒（HCV）E2基因序列比较的结果是：C－株兔脾毒与C－株细胞（SK6）毒、C－株疫苗（犊牛睾丸细胞，HCLV－C）毒、HCV－SM株（石门）毒、Brescia sri (荷兰）毒、Alfort株（德国）毒的E2核苷酸序列同源性分别为98.87%、98.34%、94.58%、91.00%、80.78％；氨基酸同源性分别为98.95%、97.37%、94.22％、91.60％、89.23％。对C－株兔脾毒与C－株细胞毒 、经典强毒及国内流行野毒E2上的A、B、C三个中和性抗原区的氨基酸组成进行了比较，其结果为：C－株兔脾毒与C－株细胞毒的差异很小甚至没有差异，而与流行野毒及经典强毒在B、C区有较大的差异。我国经典强毒石门毒与国内80年代和90年代流行毒之间有明显的差异，表明我国猪瘟流行毒株发生了变化。     

中国株猪瘟兔化弱毒克隆毒的研究

采用终点稀释单细胞微量培养法对中国株猪瘟哆化弱毒（Ｃ株）进行克隆，获１０个克隆株；保持原Ｃ株的免疫原性和其他优良特性；在某些方面并有所提高。随机取６号克隆毒（Ｃ６）进行系列试验，结果表明：（１）对牛睾丸细胞敏感，共收毒批次和合格批次为１５／１９（７９．９％）（２）用兔增殖毒共归兔６４只，发率为９０．６％，用睾丸细胞增殖毒对３８只兔热反应率为８９．４７％，（３）按“规程”安检和增大一倍量对猪均无不良     

不同批猪瘟活疫苗中猪瘟兔化弱毒E2基因主要抗原编码区序列分析

对12批猪瘟活疫苗中的猪瘟兔化弱毒病毒，以RT-PCR获得了E2基因的主要编码区的大约250bp大小的节片，在DNAstar上对这些节片的211pb进行了测序，观察到这些节片的编码序列高度同源性，其核苷酸序列和氨基酸序列有98.1%-100%相同，其中9批完全一致，结果表明猪瘟兔毒疫苗株的分子结构极其稳定。     

猪瘟病毒野毒株和兔化弱毒疫苗株RT-PCR-RFLP鉴别检测方法的建立

本研究旨在建立猪瘟病毒野毒株和兔化弱毒疫苗株RT-PCR-RFLP鉴别检测方法。根据Shimen株设计1对特异性引物,建立猪瘟病毒RT-PCR-RFLP检测方法;对20份疑似猪瘟临床样品进行检测,并对检出的山东8株流行野毒株和2株疫苗株PCR产物进行克隆与序列分析,验证上述方法。结果RT-PCR扩增片段为825bp,产物经RFLP分析,野毒株的PCR产物能被ApaⅠ酶切为322bp和503bp 2个片段,兔化弱毒疫苗株则不能被酶切,检测出RNA的最低浓度为0.028 6μg.mL-1;8株流行野毒株都含GGGCCC序列(ApaⅠ酶切位点),2株疫苗株相应序列为GAGCCC,不能被ApaⅠ酶切;8株流行野毒株属于基因2群,2株疫苗株与HCLV遗传关系近,为基因1群。建立了可鉴别猪瘟病毒野毒株和兔化弱毒疫苗株RT-PCR-RFLP检测方法,为猪瘟的防控提供有效手段。     

近年猪瘟流行特点和猪瘟免疫注意事项

1猪瘟流行的特点猪瘟是由猪瘟病毒引起的一种急性败血性、接触性传染病,多以消化道感染,也可通过呼吸道感染,常呈现出血、坏死和梗死等病理变化,以高度的发病率和死亡率给世界养猪业造成巨大的经济损失,同时也影响到我国的养猪事业。猪瘟病一直是我国畜牧兽医工作者竭力攻克的难题,典型的猪瘟具有明显的临床症状和病理剖检变化,很容易诊断,特别是自从五十年代广泛使用我国的猪瘟兔化弱毒疫苗进行免疫预防后,世界许多国家和我国也基本控制了猪瘟流行,然而近年来猪瘟流行又出现了新的特点。1.1猪瘟趋向幼龄化,断奶前后和架子猪发病较多。1.2以…     

4株猪瘟流行野毒株病毒结构蛋白E2基因的核苷酸序列分析

应用RT－PCR和nPCR扩增由4株甘肃省近期（1997－1998）猪瘟流行野毒株的E2基因，将其克隆到pGEM-TEasy载体上，经转化、筛选、鉴定后，测定核苷核序列，4株流行毒株的E2基因核苷酸序列同源性为89．2％－99．7％，相应的氨基酸序列同源性为93．8％－99．0％，这4株流行毒株；与C－株（疫苗种毒）E2基因的核苷酸序列同源性为82．2％－84．3％，相应的氨基酸序列的同源性为87．9％－90．2％，表明近期猪猪瘟流行毒株与C－株的gp55蛋白之间存在一定的差异。     

云南一株猪瘟流行毒株的分离鉴定

<正>猪瘟(Classical swine fever,CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引起的猪的一种高度接触性传染病,其流行广、传染性强、致死率高,所以国际兽疫局将之列为A类传染病。我国从20世纪50年代起广泛应用猪瘟兔化弱毒疫苗预防注射,基本上控制了猪瘟的流行。近年来,猪瘟的流     

猪瘟病毒的分离鉴定及其E2基因序列分析

2004~2005年上海和江苏3家猪场发生仔猪急性死亡,用ELISA鉴别试剂盒证明为猪瘟感染。用PK15细胞分离病毒,传代至第3代无细胞病变,RT-PCR扩增E2基因为阳性,扩增片段经纯化后克隆入T载体并进行序列测定。通过DNAStar软件对3株病毒的基因序列进行了比较,同时构建了系统进化树,结果表明,三株病毒分离株均扩增出269bp片段并且核苷酸序列100%同源,这3株与Alfort、Shimen株、兔化弱毒株(HCLV)和Brescia4个标准毒株核苷酸序列同源性均在90%以上,说明在江苏、上海地区分离得到的3株猪瘟病毒与流行毒株在基因序列上没有发生大的变异。     

非典型猪瘟病因、诊断及其防控净化

猪瘟(Hog Cholera,HC),又称烂肠瘟或猪霍乱,是猪的一种重要的病毒性、高度接触性传染病,给养猪业造成极大经济损失,但是,猪瘟兔化弱毒疫苗的研制和应用,猪瘟一度受到控制,但近年来,我国猪瘟又有逐渐回升势头,且非典型猪瘟呈多发性,使猪瘟的防治更复杂,再度成为威胁养猪业的重大问题之一。针对于此,对该病病因、诊断及其防治进行阐述,为杜绝该病的发生流行提供依据。1 病原学及其理化学特性     

猪瘟病毒四川分离株E2基因克隆及生物信息学分析

利用Gen Bank登录的猪瘟病毒(CSFV)参考株(登录号:NC_009089.1)的E2基因序列设计特异性引物,PK-15细胞培养增殖CSFV四川分离株提取RNA,采用RT-PCR技术扩增CSFV疫苗株E2基因,将PCR扩增产物克隆入Pet-32a-BL21载体构建重组质粒门Pet-32a-E2,并进行测序鉴定。测序结果显示,构建的Pet-32a-E2质粒含有1个开放阅读框(ORF),全长1119 bp,共编码373个氨基酸,与Gen Bank登录的CSFV参考株NC_009089.1的E2蛋白的核苷酸同源性为98.8%,氨基酸同源性为98.9%;与石门株兔化弱毒E2蛋白株的核苷酸同源性为94.4%,氨基酸同源性为93.9%。对E2基因及其编码蛋白进行生物信息学分析,结果显示,E2蛋白分子质量为41.6 ku,等电点PI为5.72,是弱酸性蛋白;E2蛋白不含信号肽序列,为可溶性蛋白,有跨膜区,主要定位于细胞质内。通过生物信息学分析预测,为后期CSFV E2蛋白表达,开展蛋白功能研究奠定了基础。     

多次传代和致细胞病变猪瘟病毒石门株E2基因序列分析

根据已发表的猪瘟病毒基因组序列，设计合成了2对引物，以脾毒和细胞毒总RNA为模板，利用反转录聚合酶链式反应（RT—PCR）、套式聚合酶链式反应（nPCR）及测序技术，对多次动物传代和致细胞病变的猪瘟病毒的主要外膜糖蛋白E2基因的核苷酸序列进行了测定，用DNA star软件比较分析了E2基因的核苷酸和氨基酸序列的同源性。结果发现，脾毒和标准石门株的核苷酸序列同源性为99．4％，氨基酸序列同源性为99．0％，细胞毒标准石门株的核苷酸序列同源性为98．3％，氨基酸同源性96．7％。由此说明猪瘟病毒经猪多次传代和致细胞病变后均保持遗传的稳定性。     

养猪场猪瘟流行原因及治理措施

<正>猪瘟又称烂肠瘟,是由猪瘟病毒引起的一种急性、热性、高度接触性传染病,属一类动物传染病。在我国,由于猪瘟兔化弱毒疫苗的研制和应用,猪瘟曾一度受到控制。但由于我国养猪以散养、中小型养猪户(场)居多,综合防