枣疯病和酸枣丛枝病植原体16S rDNA和tuf基因的序列同源性分析

 【目的】枣疯病是枣树上由植原体引起的一种毁灭性病害，遍布于中国华北、西北、华东、华南等25个省(市)的枣区，造成了巨大的经济损失。【方法】经PCR扩增，分别对中国陕西的彬县、阎良、武功、佳县、杨凌，河北沧州和山东德州7个枣区的枣疯病样品和杨凌4个酸枣丛枝病样品植原体16S rDNA基因保守序列和延伸因子tuf基因进行克隆和测序。【结果】获得枣疯病和酸枣丛枝病植原体的16S rDNA基因片段均为1 239 bp，tuf基因均为851 bp。通过序列同源性比较，结果表明中国陕西、河北、山东的枣疯病的病原一致，归属于植原体16S rⅤ-B组。由于枣疯病和酸枣丛枝病的植原体16S rDNA有5个碱基的差异，tuf基因的同源性为99.6%，推测为同一个种的不同寄主生物学型。【结论】首次报道了中国枣疯病和酸枣丛枝病植原体16S rDNA和延伸因子tuf基因的序列，确定了枣疯病和酸枣丛枝病植原体的分类地位，为研究枣疯病植原体的致病分子机理、遗传本质提供理论依据。     

海南苦楝丛枝病植原体核糖体蛋白基因片段序列分析

【目的】利用分子生物学方法分析采自海南儋州的苦楝丛枝病植原体核糖体蛋白(rp)基因,从亚组水平上确定苦楝丛枝病植原体的分类地位。【方法】利用植原体核糖体蛋白基因通用引物对rpF1/rpR1,应用PCR技术对苦楝丛枝病植原体的核糖体蛋白基因进行扩增,对其核苷酸序列进行测定并分析。【结果】通过PCR扩增得到约1.2 kb的特异片段,测序结果表明该片段长1 240 bp,包括rps19基因的3′区域,rpl22和rps3基因的全部区域。进一步分析发现,该片段与苦楝丛枝病贵州株系(Chinaberry witches’-broom,CWB-GZh)的亲缘关系最近,核苷酸同源性达99.9%。基于核糖体蛋白基因核苷酸序列,构建了海南苦楝丛枝病植原体与其他18个已知分类地位植原体的系统分类树状图,结果表明,引起海南苦楝丛枝病的植原体与16SrⅠ-B亚组植原体越南苦楝黄化、苦楝丛枝贵州株系和苦楝丛枝云南株系在同一条进化枝上。【结论】报道了海南苦楝丛枝病植原体的核糖体蛋白基因序列,海南苦楝丛枝病植原体属于16SrⅠ-B。     

secY和nusA基因在泡桐丛枝植原体亚组分类中的应用

【目的】利用分子生物学方法分析泡桐丛枝植原体转运蛋白secY基因及转录延伸因子nusA基因,从亚组水平上确定陕西泡桐丛枝植原体的分类地位。【方法】采集陕西杨凌、彬县、旬邑、永寿、周至和宝鸡等6个泡桐栽培区的泡桐丛枝样品,提取病样总核酸;设计引物对secY-F/R和nusA-F/R,对泡桐丛枝植原体secY、nusA基因进行PCR扩增及核苷酸序列测定与系统发育分析。【结果】获得了泡桐丛枝病植原体secY基因序列的全长,大小为1 358bp,编码414个氨基酸;获得了部分nusA基因序列,大小为946bp,编码315个氨基酸。序列同源性分析结果表明,陕西各县区泡桐丛枝植原体的secY、nusA基因序列均一致。一致性分析和系统发育分析表明,陕西泡桐丛枝植原体与台湾泡桐丛枝植原体的亲缘关系最近,secY、nusA基因序列的同源性分别为99.9%和99.6%。【结论】首次报道了泡桐丛枝植原体转运蛋白secY基因及转录延伸因子nusA基因的序列,并以其作为分类标准,将陕西泡桐丛枝植原体归属到16SrⅠ-D亚组。     

周年温度变化对泡桐丛枝病植原体分布和消长的影响

为探讨温度变化对泡桐树体内丛枝病植原体分布和消长的影响,利用巢式PCR和直接PCR研究了植原体在泡桐不同器官内的分布及相对含量的周年变化。结果表明,不同发病程度泡桐中丛枝病植原体的分布不同,发病程度相同泡桐不同器官内植原体含量也存在一定差异。在中等发病程度的泡桐中,丛枝病植原体全年存在于枝条内,并且其含量随温度升高逐渐升高,8月份达到最高,此后开始下降;叶片内植原体含量随温度升高明显增加,7月份含量最高,随后减少,10月份降到最低;根部植原体含量随温度升高也相应增加,在9月份达到最高,之后开始降低,全年含量变化较小,且含量最高值较叶片和枝条中低。表明泡桐丛枝病植原体在寄主体内的消长与温度的周年变化关系紧密。     

四川斑竹丛枝病植原体检测及16S rDNA片断序列分析

丛枝病是竹子的一类常见的重要病害,除瘤座菌外,很多报道认为植原体也是丛枝病的病原。笔者提取斑竹丛枝部位和健康组织中的总DNA,选用通用引物对植原体的16S rRNA基因进行巢式PCR扩增,得到一条约1.2kb的目的片段,而在健康植株内却没有此特异片断,表明患病植株中有植原体存在,将此植原体株系命名为PhB-WB。通过16S rDNA片断核酸序列同源性比较,结果表明斑竹丛枝病植原体是一种属于16SrⅠ组的植原体,基本确定了其分类地位。     

小麦蓝矮植原体免疫膜蛋白（Imp）基因的克隆和分子特性分析

 【目的】探讨小麦蓝矮植原体免疫膜蛋白在介体-病原-寄主互作的分子机理。【方法】通过植原体免疫膜蛋白基因序列两侧的保守区设计引物对Imp 1051/Imp 2265,用PCR方法扩增小麦蓝矮植原体免疫膜蛋白基因;对扩增片段的最大开放阅读框和基因的同源矩阵、系统发育树分析;对克隆基因所编码蛋白进行跨膜区、亲疏水区和前导信号序列分析。【结果】从小麦蓝矮病病株和接种长春花中均扩增到约1.0 kb的特异片段,其中小麦蓝矮植原体免疫膜蛋白基因长495 bp,推导的编码蛋白含有164个氨基酸。与10种植原体的免疫膜蛋白基因进行序列同源性分析,小麦蓝矮与三叶草绿变植原体同源性最高,核苷酸和编码的氨基酸序列的同源率分别为98.4％和95.1％。蛋白质结构分析结果表明：小麦蓝矮免疫膜蛋白N端有一个跨膜的前导信号序列,C端为跨膜锚定区,中间为膜外亲水区。【结论】小麦蓝矮植原体与三叶草绿变、翠菊黄化、洋葱黄化和泡桐丛枝植原体的免疫膜蛋白为同型蛋白。     

云南小驳骨丛枝植原体的分子鉴定及相关基因序列分析

【目的】确定采自元谋地区自然表现丛枝病的小驳骨(Gendarussa vulgaris Nees)植株是否感染植原体。【方法】通过利用植原体16S组和亚组通用或半通用特异性引物分别对植原体16S rRNA、rp和secY基因序列进行PCR扩增、克隆及测序分析;此外还对secY蛋白的蛋白特性及其结构进行了分析和预测。【结果】本研究获得了基因片段长度分别为1 248 bp的16S rRNA基因(nested PCR)、1 171 bp的rp基因和1 425 bp的secY基因。基于rp和secY基因核苷酸序列的同源性比对及构建的进化树推断的植原体遗传分化关系几乎与16S rRNA基因的推断相一致,均与植原体16S rⅡ-A亚组各株系的遗传进化关系最为接近,但rp和secY基因序列比16S rRNA基因序列能够呈现出更大的遗传变异程度;此外,对secY蛋白进行了生物信息学分析和初步探讨,发现它具有10个明显且分布相对均匀的跨膜螺旋区域,无信号肽。【结论】小驳骨丛枝病(Gendarussa vulgaris witches’-broom phytoplasma,GvWB-YNym)是由植原体侵染而发生,该植原体株系被划分到16S rⅡ-A亚组,相关的候选种为Candidatus Phytoplasma aurantifolia;secY蛋白生物信息参数的分析表明:secY蛋白在感病小驳骨植株中以疏水性稳定跨膜蛋白的形式存在,含10个明显的疏水跨膜区域,该蛋白不存在信号肽。     

云南蔓草虫豆丛枝植原体16S rDNA和secY基因序列分析

【目的】为确定在云南元谋地区蔓草虫豆上发生的疑似丛枝病的病原种类。【方法】利用植原体16S rDNA基因及secY基因通用引物对蔓草虫豆感病植株总DNA进行直接PCR和巢式PCR扩增、克隆和测序,分别获得1.8 kb和1.7 kb的16S rDNA、secY基因片段。【结果】16S rDNA片段i PhyClassifier在线虚拟RFLP及系统进化分析表明:蔓草虫豆丛枝植原体属于16SrII-A亚组成员(相似系数为1.00),与候选种Candidatus Phytoplasma australasiae相关。基于secY基因同源性比对及构建的系统进化树,表明该株系与来源于云南、台湾的花生丛枝植原体组各株系的亲缘关系最近,确定了该株系属于16SrII-A亚组成员。该分类结果与基于16S rDNA基因的分析结果一致。【结论】本研究首次采用分子生物技术确定了云南元谋蔓草虫豆丛枝病的病原是植原体,明确了其分类地位,该结果可为该病害的早期诊断、检测提供理论依据。     

硫酸二甲酯对白花泡桐丛枝病幼苗形态变化及DNA碱基序列的影响

利用巢式PCR和SSR技术研究了0,15,25,50,75,100,125,150 mg·L-1的硫酸二甲酯(DMS)对白花泡桐幼苗形态、植原体和DNA碱基序列的影响.结果表明,15 mg· L-1DMS处理3h可使丛枝病幼苗转变为形态上健康幼苗,但其幼苗内仍有丛枝病植原体的存在;25～125 mg· L-1 DMS处...     

苦豆子丛枝病植原体的分子检测与鉴定

[目的]对苦豆子丛枝病植原体做出分子检测与鉴定.[方法]通过PCR扩增技术,分别利用植原体16S rRNA基因,16S-23S rRNA间区及tuf基因序列的通用引物对表现丛枝病症状的苦豆子总DNA进行扩增,得到约1.2、0.3和0.8 kb特异片段.将所得片段分别进行克隆、测序及序列同源性分析.[结果]苦豆子丛枝病植原体(SAWB)上述3序列与榆树黄化组B亚组(16SrV-B)的枣疯病植原体(JWB)相应序列的同源性最高.[结论]苦豆子丛枝病植原体为16Sr V-B亚组成员.     

许昌泡桐丛枝病植原体的分子鉴定

对采自河南许昌的表现丛枝症状的泡桐样品进行了病原鉴定,并通过序列同源性分析确定了其分类地位。采用16SrDNA基因的通用引物R16mF2/R16mR1、R16F2n/R16R2和延伸因子(EF-Tu)tuf基因的通用引物fTufu/rTufu,对样品总DNA进行PCR扩增,分别得到了约1.2kb和840bp的特异条带。经克隆测序,并在NCBI网站比对分析,确定所得序列分别为植原体特定的16SrDNA和tuf基因序列。将测得序列与已报道的翠菊黄化组植原体序列进行同源性比对,并构建系统进化树,显示河南许昌的泡桐丛枝病植原体属于16SrⅠ-D亚组。     

水稻橙叶病植原体16S rDNA基因的序列分析

利用植原体16S rDNA通用引物对水稻橙叶病发病植株的DNA进行了PCR扩增和基因克隆.序列测定表明,PCR扩增的片段全长为1 853 bp,包括1 527 bp的水稻橙叶病植原体(RYL)的16S rDNA基因全序列、234 bp的邻近间隔区的序列及部分(92 bp)23S rDNA基因序列.序列比较结果表明,RYL的16S rDNA全序列与其他植原体的相似性在88%～95%,其中与America aster yellows(AAY,GenBank登录号X68373)最高相似性为95%.利用最大简约法构建的16S rDNA系统演化树结果表明:RYL与AAY亲缘关系最近,同被聚类为翠菊黄化组(16Sr Ⅰ).     

枣疯病植原体新疆分离物16S rDNA基因克隆与序列分析

利用植原体16SrDNA基因保守序列通用引物对新疆阿克苏地区和喀什地区的疑似枣疯病植株总DNA进行常规PCR和巢式PCR检测,分别扩增出1.5kb和1.2kb的特异性片段。对片段进行克隆、序列测定分析及系统发育树构建,结果表明,新疆枣疯病阿克苏分离物和喀什分离物的16SrDNA基因序列同源性极高,达到100%,与16SrⅤ组植原体的同源性达到98.4%以上,并且与16SrⅤ-B亚组中的枣疯病山东莱芜株系、山东龙口株系同源性最高,达到99.5%,因此归属于榆树黄化组16SrⅤ-B亚组。首次报道新疆枣疯病植原体16SrDNA的序列,确定新疆枣疯病植原体的分类地位,为枣疯病的早期诊断和检测提供依据。     

广州桑树矮缩病植原体secE基因序列分析与蛋白结构预测

[目的]预测广州桑树矮缩病植原体secE蛋白的抗原性。[方法]应用PCR技术从典型矮缩症状的桑树植株总DNA中扩增到约400 bp的特异片段,将此片段克隆后与GeneBank中已报道的5种植原体的secE基因进行序列同源性分析,并对克隆基因所编码的蛋白进行理化性质、二级结构、跨膜区以及前导信号序列分析。[结果]该片段长411 bp,编码136个氨基酸的蛋白。桑树矮缩植原体与洋葱黄化植原体同源性最高,核苷酸和编码的氨基酸序列同源率分别为100%和99%。secE蛋白理化性质预测其理论等电点为9.33;二级结构主要为螺旋,其次为折叠和无规则卷曲,无转角;有3个明显的疏水区,易形成跨膜螺旋;有4个明显的抗原区域。[结论]该secE蛋白具有良好的抗原性。     

小麦蓝矮病植原体延伸因子(EF-Tu) tuf基因序列的同源性分析

 【目的】利用分子生物学方法分析小麦蓝矮病植原体延伸因子tuf基因，从亚组水平上确定小麦蓝矮病植原体的分类地位。【方法】电镜观察自然发病的小麦蓝矮病病叶；用引物fTufu/rTufu对小麦蓝矮病植原体延伸因子tuf基因进行PCR扩增；核苷酸序列测定及分析。【结果】经电镜超微结构观察，在韧皮部观察到大量典型植原体。通过PCR扩增得到约850 bp的特异片段。感受态转化后，进行测序，结果表明小麦蓝矮病植原体tuf基因片段长842 bp，编码280个氨基酸。分析比较15种植原体延伸因子tuf基因的同源性，结果表明小麦蓝矮病植原体与三叶草绿变（KVF）亲缘关系最近，核苷酸同源性为99.9％，氨基酸同源性为100％。【结论】从亚组水平上确定了小麦蓝矮病植原体的分类地位，为研究小麦蓝矮病植原体的来源及致病分子机理提供理论依据。     

赞皇大枣枣疯病植原体分子分类

 【目的】枣疯病是一种重要的植原体病害,本试验旨在明确惟一已知的天然三倍体品种--赞皇大枣枣疯病植原体的分类地位,为赞皇大枣枣疯病植原体分类研究提供参考。【方法】利用植原体16S rDNA通用引物对赞皇大枣枣疯病病株的DNA进行PCR扩增和克隆测序,通过BLAST比对进行序列分析,利用临位相连法构建16S rDNA系统演化树,并应用DNAstar软件进行虚拟RFLP分析。【结果】获得的赞皇大枣枣疯病植原体16S rDNA序列长度为1 850 bp（GenBank登录号GU184180）,包括1 529 bp的16S rDNA基因全序列、264 bp的邻近间隔区序列及57 bp的23S rDNA部分基因序列。同源分析表明,赞皇大枣枣疯病病原16S rDNA序列与其它植原体的相似性在87%—98%,其中与榆树黄化 Elm yellows（EY）(GenBank登录号l33763)最高相似性为98%;与大多数二倍体枣品种的植原体序列相似率达99%以上;其虚拟RFLP图谱与4个16SrⅤ亚组的代表序列图谱差异显著,赞皇大枣枣疯病植原体延伸因子tuf基因的序列(GenBank登录号JN001985) 比对结果表明,与其它亚组序列同源性为52.3%—76.7%。【结论】三倍体赞皇大枣枣疯病病原属于榆树黄化组(16Sr V),并与其中的B亚组亲缘关系最近;与二倍体品种的病原分类地位一致,说明枣疯病植原体在系统进化上比较保守。     

云南西盟蔗区发现检疫性病害甘蔗白叶病

研究旨在明确2018年在云南西盟蔗区发现的甘蔗病害是否为植原体引起的甘蔗白叶病。使用植原体16S rRNA基因序列通用引物P1/P7和R16F2n/R16R2对10份采自云南西盟蔗区的疑似甘蔗白叶病样品进行巢氏PCR检测,并将巢氏PCR 产物进行克隆测序和序列分析。巢氏PCR结果表明,所有10份样品均能扩增得到1240bp左右的片段。测序结果表明所有获得的10条16S rRNA基因序列大小均为1247bp,序列间的核苷酸一致性为100%。BLASTN分析表明从病株扩增到的所有核苷酸序列与先前云南临沧甘蔗白叶病植原体分离物LC7和LC9的16S rRNA基因序列(Genbank登陆号：KR020691和KR020692)的核苷酸序列一致性为100%。虚拟RFLP分析表明西盟分离物的16S rRNA基因序列的酶切图谱与16SrXI-B亚组植原体相同。本研究结果表明云南西盟蔗区发现的甘蔗病害为16SrXI-B亚组植原体引起的甘蔗白叶病。     

玉兰黄化病病原的分子检测与鉴定

对表现叶片黄化的玉兰植株,利用植原体16S rRNA基因通用引物进行巢式PCR检测,得到1.4 kb的特异片段,将此片段克隆后进行序列测定、分析及构建系统关系树.结果表明,该片段与16SrI组中的各植原体同源率均达到99%以上,而与其他组的植原体16S rDNA序列的同源率均低于97%,认为该植原体株系为翠菊黄化植原体组中的成员之一.