大豆EST-SNP的挖掘、鉴定及其CAPS标记的开发

采用生物信息学方法将大豆EST序列联配到大豆基因组序列上,挖掘到大豆EST-SNP位点537个。对其靶向基因进行功能注释分析,发现他们主要参与亚细胞定位、蛋白质结合与催化以及代谢等与大豆重要农艺性状形成相关的生物过程。同时开发了简便易行的SNP检测方法,利用EMBOSS软件筛选导致酶切位点改变的EST-SNP,分别以大豆绥农14、合丰25、Acher、Evans、Peking、PI209332、固新野生大豆、科丰1号、南农1138-2的DNA及其混合的DNA为模板,设计引物进行PCR扩增,发现44个PCR产物中有36个测序峰图在预期的EST-SNP位点表现出多态性。酶切分析发现26个PCR产物具有酶切多态性,可以作为CAPS标记。结果表明该EST-SNP挖掘体系及其CAPS标记转化系统具有高效率、低成本等优点,有利于促进大豆的遗传育种研究。     

稻瘟病抗性基因Pi25特异性CAPS标记的开发与验证

为在水稻育种中快速与高效利用稻瘟病抗性基因Pi25, 本文利用该基因不同等位基因编码区序列差异开发了4套CAPS标记(CAP1/Hinc II、CAP3/Bgl II、CAP3/Nde I和CAP3/Hpy 99I), 并利用169份稻种资源、98个重组自交系(RIL)以及217个水稻转基因后代, 对4套标记的准确性和选择效果进行了验证。结果表明, 4套标记均能准确地检测Pi25/pi25座位。其中, 标记CAP1/Hinc II和CAP3/Hpy 99I特异性识别并酶切显性等位基因, 而标记CAP3/Bgl II和CAP3/Nde I特异性识别并酶切隐性等位基因。利用稻瘟病菌株JS001-20接种RIL与转基因材料, 抗性表现与标记检测的结果完全一致, 表明该CAPS标记准确可靠。分析稻种资源后发现, Pi25基因频率较低(1.2%), 说明该基因在我国水稻稻瘟病抗性育种中还没有被充分利用。本文的研究结果特别是开发的2对识别并酶切显性等位基因的CAPS标记可用于分子标记辅助选择, 改良我国早籼稻的稻瘟病抗性。     

植物SNP数据库及转化CAPS的方法

单核苷酸多态性(SNP)在植物基因组中广泛存在,基于SNP的分子标记也正越来越广泛地应用到植物基因定位、图位克隆及分子标记辅助育种等方面。模式植物拟南芥和水稻的全基因组序列测定已经完成,拟南芥有两种生态型完成了全序列测定,水稻有两个品种完成了全序列测定。许多植物有来自不同品种或不同组织器官或生长发育阶段的大量的EST序列。这些序列是植物SNP开发的重要资源。利用生物信息学手段对全基因组序列或EST序列进行分析已经形成了许多SNP位点数据库,这些数据库的建立为基于SNP的基因功能研究及分子标记开发提供了宝贵的资源。本文对植物SNP位点开发涉及的数据库资源及已经形成的SNP位点数据库进行了总结,并讨论了将SNP位点转化成CAPS或dCAPS标记的方法和相应的工具软件。     

基于全基因重测序的芒果细菌性角斑病抗性相关SNP分析

芒果细菌性角斑病是芒果生产上的重要细菌病害之一,为揭示芒果品种对细菌性角斑病的抗性差异,本研究通过全基因组重测序技术对高抗细菌性角斑病品种‘热农1号’和高感细菌性角斑病品种‘凯特’进行测序,通过与参考基因组‘红象牙’进行比对,进行数据统计与质量检测、序列比对及多态性SNP位点分析。结果表明,在测序深度10X下,‘凯特’和‘热农1号’分别获得5.93 Gb和4.55 Gb的数据量,过滤后的Q30达到92.4%和92.3%。将获得的原始数据与参考基因组对比,‘凯特’和‘热农1号’比对上的reads数目分别是31 108 817和30 217 182。‘凯特’和‘热农1号’分别检测到3 530 706和3 325 884个SNP位点,产生非同义突变的SNP位点数分别为133 283和127 148个,杂合度为0.43%和0.36%,转换和颠换的比值为2.24和2.25。基于抗病品种‘热农1号’和感病品种‘凯特’全基因组重测序数据比较的结果,获得到了3 258 857个差异SNP位点和33 161条基因信息,其中有937个基因参与抗病蛋白的调控。本研究结果可以在一定程度上反映抗感细菌性角斑病的...     

基于重测序的芥蓝(Brassica alboglabra)全基因组InDel标记开发

碱基插入/缺失(MDel)在基因组中的分布密度仅次于SNP且易于基因型分型,成为分子标记开发的主要来源.为了开发芥蓝品种间有多态性的分子标记,本研究利用2份芥蓝自交系重测序数据鉴定的InDel位点,在全基因组范围内设计了367对InDel候选标记.通过PCR检测比较8个芥蓝自交系的多态性,发现284对标记在至少2个芥蓝...     

基于不同烟草类型基因组重测序的烟草SSR标记的开发和应用

基于基因组重测序的分子标记研究是一种新的方法。本研究在普通烟草基因组序列已完全测定的基础上重测序了4个烟草品种（系）,包括烤烟类型（LY1306,秦烟96）2个,晒烟类型（Wanmao 3）1个,马里兰烟草类型（Wufeng 1）1个。结合在NCBI中测序并发布的K326和TN90品种的基因组序列,分析了这4个重测序的烟草品种的InDel突变和SNP突变位点,鉴定出7个具有品种多态性的SSR候选位点,其中5个SSR位点可扩增出DNA片段。通过对包括不同烟草类型在内的10个烟草品种进行PCR检测,表明本研究选出的SSR位点可用于烟草品种或烟草类型的分类,其中NW-015889872.1、NW-015854676.1和NW-015890969.1等3个SSR位点可有效区分烤烟、白肋烟和马里兰烟以及晒烟烟草类型。     

基于高通量测序的棉花InDel标记开发及其应用

【目的】获得可以用于棉花品种鉴定和纯度检测的二态性InDel标记,提高棉花种子的检验精确度和效率,为棉花的分子育种发挥作用。【方法】基于来源不同的121份棉花全基因组信息,根据高多态性信息含量筛选多态性高的InDel位点,开发二态性InDel标记,并在我国66个棉花品种的遗传距离分析和聚类分析中进行应用。【结果】基于121份棉花的二代测序数据获得10967个InDel位点,合成了85对InDel引物,选择其中有效引物64对,其中At亚组的特异引物35对、Dt亚组特异引物29对,At、Dt亚组染色体的平均最小等位频率分别为0.45、0.32,多态信息含量分别为0.49、0.40;所用的66个棉花品种的遗传距离范围是0.04~0.65cM(厘摩),平均为0.39cM,遗传距离最大的2个品种是泗棉3号和中棉所36,遗传距离最小的是徐棉18和徐杂3号。【结论】开发的64个棉花二态性InDel标记能有效地通过揭示品种间的遗传距离反映品种之间的亲缘关系,区分来源不同的棉花品种,具有一定的理论意义和应用价值。     

基于木薯全基因组重测序的InDel标记开发及应用

本研究旨在开发稳定可靠、操作简便的木薯In Del分子标记,为木薯种质资源遗传多样性研究、品种鉴定等工作提供有力工具,为木薯育种发展提供保障。本研究基于22份木薯种质资源全基因组重测序分析结果随机挑选了64个In Del分子标记进行引物设计并利用琼脂糖凝胶电泳检测进行有效性验证,结果有20对引物具有多态性,多态性率为31.25%。随后将具有多态性的且扩增效果最优的18个InDel标记扩增条带数进行统计生成矩阵用于木薯种质资源遗传多样性研究,各标记的基因多样性指数于0.21～0.50之间,香农多样性指数于0.36～0.70之间。聚类结果分析将72份木薯材料在遗传相似系数0.62处划分为2大类群。且将中国的地方品种及选育品种大多划分至1#中的同一分支,其余薯肉颜色及内皮颜色相同的木薯材料大多都聚类到了一起。此外,本研究开发出的In Del分子标记IDC46具有特异性,可用于特定木薯材料鉴定。说明后期InDel引物有望成为木薯指纹图谱及分子身份证构建的有效工具,本研究结果也将对木薯育种工作后续开展具有一定的参考意义。     

大豆胞囊线虫主效抗病基因Rhg4(GmSHMT)的CAPS/dCAPS标记开发和利用

大豆胞囊线虫(soybean cyst nematode,SCN)严重危害世界大豆生产,Rhg4(resistance to Heterodera glycines 4)是控制大豆SCN抗性的2个主效位点之一。本研究针对Rhg4(Gm SHMT)上的2个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNP)位点开发了快速、经济、简便易行的CAPS(Rhg4-389)和d CAPS标记(Rhg4-1165),并用开发的2个标记鉴定了以大豆胞囊线虫应用核心种质为主的193份代表性抗感种质。结果表明,Rhg4-389和Rhg4-1165位点间存在显著连锁不平衡(P=0.0001,r2=0.87),可形成4种单倍型。Rhg4-389-G/Rhg4-1165-T和Rhg4-389-C/Rhg4-1165-A为优势单倍型,稀有单倍型Rhg4-389-G/Rhg4-1165-A和Rhg4-389-C/Rhg4-1165-T是在中国抗源中新发现的单倍型。结合193份种质对SCN 3号小种抗性鉴定分析发现,Rhg4-389-G和Rhg4-1165-T主要存在于抗病种质,它们形成的单倍型对抗病种质鉴定效率可达94.1%。本研究开发了可用于辅助大豆SCN抗性鉴定且方便育种家利用的CAPS/d CAPS标记,且用其摸清了应用核心种质等重要抗源在Rhg4位点的本底,为育种家有效利用这些优异抗源提供了重要信息。     

Rf-1位点CAPS标记对水稻不同胞质雄性不育育性恢复系的关系分析

水稻育性恢复基因Rf-1是目前水稻上克隆的唯一恢复基因.通过位于Rf-1位点的两个特异性CAPS(cleavable amplified polymorphic sequences)标记对滇I型、野败型、红莲型及BT型恢复系基因型分析,发现这四种不同胞质的恢复系在Rf-1位点具有相同的带型,滇I型的两个保持系具有不同的带型.结果表明这四种不同胞质系统的恢复系均具有Rf-1基因.该结论与从恢复系选育的系谱分析的结果相一致的.     

大豆百粒重相关基因的全基因组发掘分析

百粒重是大豆重要的产量性状之一,利用正向和反向遗传学方法鉴定与籽粒大小/粒重相关的基因具有重要的理论和实践意义。利用拟南芥和水稻等模式植物中已明确功能的调控籽粒大小/粒重的基因,基于序列相似和结构域相同的原则,在大豆全基因组内筛选到175个同源基因,通过基因表达谱分析发现有22个基因在大豆种子中特异性表达。利用56份大豆种质资源重测序数据查找这些基因内的SNP位点,共得到2769个SNP位点,从中筛选得到在野生大豆和栽培大豆中分化明显的SNP位点121个。通过扩增测序对其中的16个导致非同义变异的SNP位点进行验证,发现有5个SNP位点在野生大豆中为一种变异,而在栽培大豆中为另一种变异。利用2368份大豆种质资源的重测序数据获得了其中的4个SNP位点的变异数据,结合其中1695份材料的百粒重表型分析,发现每个SNP位点对应的野生和突变基因型材料的百粒重表型间都存在极显著差异,并且每个SNP位点中野生基因型材料的百粒重大部分≥12g,突变基因型材料的百粒重大部分＜12g,因此上述4个SNP位点所在的基因（Glyma.05G019800、Glyma.07G022800、Glyma.13G259700和Glyma.13G261700）可能与大豆籽粒大小/粒重的调控有关。获得了与大豆百粒重相关的4个候选基因,为大豆百粒重QTL的精细定位和功能标记的开发以及调控大豆籽粒大小/粒重的基因的功能研究提供了参考。     

基于大豆胞囊线虫抗病候选基因rhg1的InDe1标记发掘与鉴定

大豆胞囊线虫病是严重危害大豆生产的重要病害之一,根据抗病候选基因发掘标记可以为分子标记辅助选择抗病材料提供标记资源。本研究通过对大豆胞囊线虫抗病候选基因rhg1的序列比对分析,发现4个插入/删除位点,针对其中3个多碱基插入/缺失位点开发了InDel标记。应用开发的3个InDel标记对33份栽培大豆进行基因型鉴定,共检测到等位变异11个,平均每个位点3.67个。其中rhg1-I1位点有等位变异5个,rhg1-I2位点有等位变异2个;rhg1-I4位点有等位变异4个。各等位变异发生频率范围为0.8%~77.3%。InDel标记与大豆胞囊线虫抗性间的关联分析表明,rhg1-I4为抗性相关标记,对抗病资源的检出效率为88.2%,对感病资源的检出效率为100%。该标记的288 bp等位变异和294 bp等位变异为抗病相关等位变异,269 bp等位变异和272 bp等位变异为感病相关等位变异。此标记与常用于标记辅助选择的Satt309配合鉴定可以提高SCN抗病资源的检测效率。     

Development of SCAR and CAPS Markers for a Partially Dominant Yellow Seed Coat Gene in Brassica Napus L

Summary We have previously identified 2 RAPD and 8 AFLP markers that were associated with yellow seed coat gene in a stable and pure yellow-seeded DH line No. 2127-17, however, they were not suitable in large-scale MAS. In this paper, it reported our efforts in developing rapid and reliable SCAR and CAPS markers from the RAPD and AFLP markers. Based on the sequence information in the regions of the most closely linked 4 AFLP and 2 RAPD markers, one SCAR (SCS1130) and one CAPS (SCA1) maker were successfully developed. Linkage analysis on a 127 DH lines population derived from the cross Hui5148-2 × No. 2127-17 revealed that they were tightly flanked (3.2 cM, 3.8 cM respectively). The resulting SCS1130 and SCA1 were further evaluated in backcross breeding families and demonstrated more accurate and valuable in MAS breeding. The development of these new markers would facilitate and accelerate the yellow seed coat breeding in Brassica napus.     

SNP Markers Discovery in Soybean with Use of Degenerate Oligolucleotide Primed PCR

There are several strategies that can be applied in SNP discovery, as for example the locus-specific amplification of target genome regions （Primmer et al., 2002; Van et al., 2004） or simultaneous assembly of anonymous sequences which are the product of whole genome shotgun sequencing （Webber and Myers, 1997） or reduced representation shotgun sequencing （Altshuler et al., 2000）. The majority of these methods are highly cost-prohibitive, however, and there is a necessity for development of new strategies that would be more suitable for small and medium-scale laboratories.     

瓣化型胡萝卜雄性不育基因atp6的CAPS标记建立

根据atp6的基因序列设计特异扩增引物，以瓣化型胡萝卜核质互作雄性不育系H05A及其保持系H05B为试材，扩增获得了1条约500bp的特异扩增片段。用限制性内切酶BglII对该片段进行酶切，不育系产生1条保持系中没有的特异片段，其分子量约为60bp。建立了atp6基因的CAPS标记，该分子标记可用于胡萝卜雄性不育分子标记辅助育种。     

基于黄麻转录组序列SNP位点的CAPS标记开发与验证

黄麻CAPS分子标记的开发,可以为黄麻遗传多样性分析、种质资源鉴定和分子标记辅助选择等研究提供有效方法。本试验以黄麻179和爱店野生种为材料,采用IlluminaHiSeq4000测序技术进行转录组测序,对其SNP位点进行分析,设计了与木质素合成基因4CL、COMT及转录因子MYB相兲的SNP引物,在此基础上,应用dCAPS Finder2.0软件开发了CAPS标记,幵对其有效性进行了验证。结果表明:(1)组装后的黄麻unigene序列共72,674条,序列总长度为29,705,997 bp,检测到的SNP位点总数为67,567个,平均每440 bp有1个SNP。(2)获得了39对分别与4CL、COMT和MYB相兲的SNP引物,从中筛选获得26对CAPS标记引物,开发成功率为66.7%,其中11对CAPS标记具有多态性,多态性比例为43.2%。(3)开发的CAPS标记能较好地将12份不同类型的黄麻种质区分开来,表明CAPS是适用于黄麻研究的较理想的分子标记方法,为黄麻遗传基础研究提供了可靠工具。