转入DAF基因猪体内外源基因的整合鉴定

衰变加速因子（ＤＡＦ）是补体激活途径中的一个重要膜调节蛋白,转入ＤＡＦ基因的猪可以作为人器官移植的供体。采用聚合酶链反应的方法,对８７头经显微注射导入ｈＤＡＦＳＣ质粒片段或ｈＤＡＦＢ质粒片段的产仔猪进行整合鉴定,获得转ｈＤＡＦ基因阳性猪１８头。     

Dot-blot对转DAF基因猪外源基因整合的检测

衰变加速因子(DAF)是补体激活途径中的一个重要膜调节蛋白，转人DAF基因猪可以作为人器官移植的供体。采用斑点杂交试验(Dot-blot)，对经显微注射导入了hDAF质粒片段、用聚合酶链反应(PCR)鉴定的阳性猪所产仔猪32头进行了整合检测，获得转基因阳性仔猪14头。说明了Dot-blot可作为转基因动物外源基因整合检测的一种手段。     

猪MHCⅠ类基因区基因组DNA的RFLP初步分析

用４种限制性内切酶ＥｃｏＲＩ，ＢａｍＨＩ，ＨｉｂｄⅢ和ＲｓｔＩ对纯种二花脸猪和梅山猪白细胞基因组ＤＮＡ进行内急酶消化和电泳，经Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ将ＤＮＡ转移到ＮＣ膜上，将来源于猪ＭＨＣ的Ⅰ类基因猪移植抗原基因片段克隆ＰＤ１－ＡＤＮＡ（４．３ｋｄ）用ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ标记作为ＤＮＡ探针，进行分子杂交反应，比较了不同品系和个体间的限制性酶切片段长度多态性（ＲＦＬＰ），结果表明：（１）经各种     

根癌农杆菌介导转化抗虫基因获得转基因烟草

将抗虫ＰＩ基因构建到ｐＩＧ１２１Ｈｍ质粒的Ｔ－ＤＮＡ上，利用农杆菌ＬＢＡ４４０４介导转化烟草，获再生植株。经ＧＵＳ检测和Ｄｏｔ ｂｌｏｔ分析，证实外源基因已插入植物细胞基因组中，再生植株的转化率为６４．３％。     

四种检测猪的繁殖与呼吸综合征病毒血清抗体方法的比较

本试验利用猪的繁殖与呼吸综合征病毒美洲株和上海分离株ＳＨ１建立了ＩＦ，ＩＰＭＡ和Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ三种抗体检测方法，对１２０份随机抽样猪血清检测表明，美洲株原组ＩＦＡ的阳性率为３０．８％，ＩＰＭＡ的阳性率为３０％，Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ的阳性率为３２．５％，ＳＨ１分离株抗原组ＩＦＡ的阳性率为３７．５％，ＩＰＭ阳性率为３７．５％，Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ的阳性率为４０％，进口ＥＬＩＳＡ试剂盒的检测阳性率为２６     

转hFat-1基因猪外源基因整合分析及拷贝数测定

对转人源化Fat-1基因猪的15头传代仔猪进行PCR检测,发现有7头阳性猪,其断奶后成活5头仔猪。对这5头仔猪进行Southern印迹杂交试验,确认3头仔猪整合有hFat-1基因。采用荧光实时定量PCR法测定原代转hFat-1基因公猪及3头阳性仔猪外源基因的拷贝数,分别是2、1、1、2个拷贝。转hFat-1基因猪能够将外源基因遗传到下代仔猪,但外源基因具有遗传不稳定的趋向。     

转hFat-1基因猪外源基因整合分析及拷贝数测定

对转人源化Fat-1基因猪的15头传代仔猪进行PCR检测,发现有7头阳性猪,其断奶后成活5头仔猪。对这5头仔猪进行Southern印迹杂交试验,确认3头仔猪整合有hFat-1基因。采用荧光实时定量PCR法测定原代转hFat-1基因公猪及3头阳性仔猪外源基因的拷贝数,分别是2、1、1、2个拷贝。转hFat-1基因猪能够将外源基因遗传到下代仔猪,但外源基因具有遗传不稳定的趋向。     

转Fat-1基因猪外源基因遗传稳定性分析

测定转Fat-1基因猪外源基因遗传稳定性,为转基因猪育种选择优质新材料提供基础数据。采用PCR和Southern印迹杂交方法对转Fat-1基因传代生产仔猪进行检测,了解Fat-1基因在猪基因组中的整合情况,统计传代猪转基因阳性比率,与自然基因单等位基因正常遗传比率进行差异显著性分析。结果显示,F2代传代仔猪Fat-1基因阳性比率为57.14%,F3代传代仔猪阳性比率为46.67%。F1代公猪外源Fat-1基因是1拷贝基因,传代配种母猪使用非转基因母猪,仔猪阳性比率与自然基因单等位基因正常遗传比率(50%)差异不显著。Fat-1基因在猪育种传代过程中遗传力没有下降,转Fat-1基因公猪能够稳定遗传生产后代猪。     

异种器官移植转基因猪检测系统的建立

以PCR、免疫荧光、细胞毒试验在DNA、表达、功能水平对转hDAF基因猪进行了检测。结果表明：转基因猪的整合率为19．35％（18／93）；在14头转基因阳性猪中，有7头动脉肌肉层表达了外源hDAF基因，6头猪的外源基因表达产物可以抑制猪淋巴细胞的裂解。     

转绿色荧光蛋白标记基因猪整合检测的研究

[目的]为转基因猪生产的整合效率、外源目的基因表达水平、目的基因在猪体内组织特异性表达分布等相关领域的进一步研究奠定基础。[方法]用显微注射法将GFP标记的转基因猪表达载体PM1导入湖北白猪和通湖猪1-细胞、2-细胞胚胎中,胚胎移植妊娠后生产仔猪,取耳或尾组织样提取基因组总DNA,用PCR法检测PM1在猪基因组中的整合情况。[结果]在所有生产的78头仔猪中,有6头猪用PCR检测为转PM1基因阳性猪,这6头猪在3次PCR扩增反应中都得到650 bp目的扩增片段。其他样品没有得到目的扩增片段的为阴性猪。[结论]载体PM1可以用于携带外源基因进行转基因猪生产。     

基因探针技术检测血清1型马立克氏病病毒的研究

选用马立克氏病病毒（ＭＤＶ）ＧＡ株ＢａｍＨＩ基因文库中ＬＤＮＡ片段，制成ＤＩＧ－标记的ＭＤＶ核酸探针，分别对Ｉ型ＭＤＶ强毒株（ＢＪ－１株）和弱毒株（Ｍｄ１１／７５ｃ株）感染材料的核酸进行ｄｏｔ ｂｌｏｔ杂交检测，结果显示均有阳性呈色反应；而对ＭＤＶ血清２型（ＳＢ－１株）、３型（Ｆｃ１２６株）及禽网状内皮组织增殖病病毒（ＲＥＶ）和淋巴细胞性白血病病毒（ＬＬＶ）感染细胞的核酸，作上述同样检测，则均未见     

精子介导生产转hCD59基因猪

为研究精子介导法生产异种器官移植用转基因猪的效率,将人膜反应性溶解抑制物(hCD59)基因与脂质体混合制成基因/脂质体复合物,分别采用睾丸注射法和基因脂质体复合物/精子共孵育法制备转人hCD59基因猪,其中睾丸注射法处理公猪1头,44 d后配母猪8头,7头受孕(受孕率87.5%),产仔73头,PCR阳性猪3头(阳性率4.3%);外源基因/精子共孵育法处理公猪4头,处理母猪4头,1头受孕(受孕率25%),产仔11头,PCR阳性猪1头(阳性率9%)。从15头受孕母猪共获得84只仔猪,经PCR初步检测,其中4只仔猪为转基因阳性,阳性率4.8%。研究结果表明:通过精子介导法可以获得转基因猪。     

四种检测猪的繁殖与呼吸综合征病毒血清抗体方法的比较

本试验利用猪的繁殖与呼吸综合征病毒美洲株和上海分离株 Ｓ Ｈ１ 建立了 Ｉ Ｆ、 Ｉ Ｐ Ｍ Ａ 和 Ｄｏｔ － Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ三种抗体检测方法, 对１２０ 份随机抽样猪血清检测表明, 美洲株抗原组 Ｉ Ｆ Ａ 的阳性率为３０ ．８ ％ 、 Ｉ Ｐ Ｍ Ａ 的阳性率为３０ ％ 、 Ｄｏｔ － Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ 的阳性率为３２ ．５ ％ , Ｓ Ｈ１ 分离株抗原组 Ｉ Ｆ Ａ 的阳性率为３７ ．５ ％ 、 Ｉ Ｐ Ｍ Ａ 阳性率为３７ ．５ ％ 、 Ｄｏｔ － Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ 的阳性率为４０ ％ 。进口 Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ 试剂盒的检测阳性率为２６ ．７ ％ 。     

寒地粳稻外源基因转化途径研究初报

试验研究了寒地粳稻（ＤＳ２＃）成熟胚为受体的ＪＱ７００型基因枪转化，寒地粳稻（ＤＳ３＃）下胚轴愈伤悬浮细胞与细胞团为受体的农杆菌ＬＢＡ４４０４共培养转化，以及寒地粳稻（ＤＳ２ＧＧ＃）未受精胚囊为受体的花粉管通道等转化途径的初步尝试。结果首先在基因枪转化途径上得到突破——成功地将ＮＰＴⅡ基因、ＧＵＳ基因及抗虫基因（Ｂ．ｔ）的ＤＮＡ片段导入寒地粳稻（ＤＳ２＃）成熟胚。以ＧＵＳ基因组织化学法检测外源基因的表达，结果转化水稻细胞的短暂表达为阳性。经过一系列组织培养过程，诱导获得了绿色转基因水稻植株，取其叶片进行外源基因的稳定遗传与表达检测，结果ＧＵＳ基因组织化学检测亦为阳性，Ｏｌｙｍｐｕｓ倒置显微镜镜检结果——转基因水稻（ＤＳ２＃）植株叶片的叶脉等维管组织中ＧＵＳ基因表达更强烈。本文只是对转化途径进行研究，关于Ｂ．ｔ基因的整合与表达的检测工作正在进行中     

间接Dot—ELISA检测EDS—76病毒抗原的研究

本研究成功地建立了间接酶联免疫吸附试验（Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ）用于检测ＥＤＳ－７６病毒抗原的标准化程序。对纯化ＥＤＳ－７６病毒抗原的最低检出量为１ｎｇ／Ｄｏｔ,其敏感性约为ＨＡ的１５．６倍。ＥＤＳ－７６阳性鸡血清特异性阻断试验及交叉反应试验证明,该法对ＥＤＳ－７６病毒抗原的检测具有特异性。试验结果表明,间接Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ检测ＥＤＳ－７６病毒抗原,具有敏感性高、特异性强、重复性好、经济、方便、快速等优点,适合于大规模样本的检测。     

Dot—PPA—ELISA联合检测猪PRV.Brucella和Chlamydia抗体方法的建立和应用研

首次将Ｄｏｔ－ＰＰＡ－ＥＬＩＳＡ用于联合检测猪衣原体、伪狂犬病毒和布氏杆菌抗体,并进行了较大规模的田间猪血清检测。实验对制作诊断膜片的工艺流程和关键材料做了细致研究,并进行同步监测、分析。确定了本方法的最佳反应条件和阳性标准。联合诊断膜片（简称膜片）具有良好特异性、灵敏性和稳定性。诊断膜片在４℃保存８个月、室温（１５～２５℃）保存２个月、３７℃保存１个月灵敏性,特异性不变。１：６４、１：１２８、１：６４为联合检测猪伪狂犬病、衣原体病和布氏杆菌病抗体的阳性标准。结果表明,Ｄｏｔ－ＰＰＡ－ＥＬＩＳＡ联合检测法操作方便、快速,结果客观,易于判读,诊断膜片便于寄送、保存,性能稳定、可靠,并能同时检测多种疫病等优点,适宜应用于猪衣原体病、伪狂犬病和布氏杆菌病抗体的联合检测。     

马铃薯Y病毒复制酶基因植物表达载体构建及转基因烟草的培育

用ＢａｍＨＩ／ＫｐｎＩ从重组克隆ＰＺＤ－１中切下马铃薯Ｙ病毒脉坏死株系复制酶基因，将其插入质粒ＰＲＯＤ２相庆切点中构成植物表达载体。用重组ｐＲＯＤ２转化农杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＬＢＡ４４０４菌株，通过重组农杆菌侵染叶盘将复制酶基因转入烟草品种ＮＣ８９中获得转基因植株。分子生物学检测结果表明，复制酶基因在转基因烟草中获得品种ＮＣ８９中获得转基因植株。分子生物学检测     

sFat-1转基因猪遗传稳定性和7种疾病易感性测试(英文)

[目的]测试sFat-1转基因猪的遗传稳定性,以及对7种疾病的易感性差别。[方法]采用PCR法检测传代仔猪sFat-1基因整合情况,并用ELISA和PCR法检测转基因猪对伪狂犬病、钩端螺旋体病、猪密螺旋体痢疾、布鲁氏菌病、轮状病毒、结核杆菌病和猪支原体肺炎的感染情况。[结果]sFat-1转基因猪F3代仔猪阳性比例为18.5%,转基因阳性猪和阴性猪对7种疾病的易感性没有明显差别。[结论]sFat-1转基因猪外源基因遗传不稳定,转基因阳性和阴性猪体质整体情况接近。     

BA-Dot-ELISA检测牛结核乳清抗体的研究

本研究建立了快速检测牛乳中结核病抗体的ＢＡ－Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ方法。用该法检测２８份结核变反阳性牛乳清，阳性率为７８．５７％，比常规ＥＬＩＳＡ（６４．２８％）高。用该法检测布鲁氏菌病牛乳清无交叉反应，但对５份副结核变反阳性牛乳清出现了一定的交叉反应。     

马立克病毒糖蛋白D基因转入感染细胞DNA的研究

用ＥｃｏＲＩ，ＰｓｔＩ内切酶将已分离和克隆的马立克氏病病毒（ＭＤＶ）糖蛋白Ｄ（ｇＤ）基因从重组ｐＭｇＤ１８质粒中切出，克隆进反转录病毒质粒载体（ＲＣＡＳ）的连接质粒载体ｐＵＣＣｌａ１１２Ｎ的相同位点。用Ｃｌａｌ再将ｇＤ重组ｐＵＣＣｌａ１１２Ｎ中的ｇＤ基因切出，用ＣｌａＩ将ＲＣＡＳ载体切开，将ｇＤ基因构建于ＲＣＡＳ的ＣｌａＩ位点。通过原位杂交筛选重组ＲＣＡＳ，并结合酶切分析鉴定出ｇＤ插入方向正确的重组ＲＣＡＳ。用磷酸钙沉淀法将ｇＤ重组ＲＣＡＳ转染鸡胚成纤维细胞。收集转染后第９天的细胞上清，并用其感染原代ＣＥＦ，在感染后第４天和第６天收集ＣＥＦ。提取ＣＥＦ基因组ＤＮＡ，用Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ（ｄｉｇ）标记ｇＤ基因片段作为探针，通过ｄｏｔｂｌｏｔ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ检测基因转移情况。结果表明，转染的重组ＲＣＡＳ不仅在细胞内变成有传染性的完整病毒，而且成功地将ｇＤ基因与病毒前ＤＮＡ一起整合在ＣＥＦＤＮＡ中