用杂种克隆板将猪GAS6基因物理定位于SSC11

 【目的】确定GAS6（growth arrested-special 6）基因在染色体的物理位置,为该基因的克隆及功能研究打下基础。【方法】运用比较基因学的方法,根据人的该基因序列设计引物,从大围子猪基因组分离猪该基因的内含子9的片段,通过扩增体细胞杂种克隆板上27个样品和辐射克隆板上118个样品。【结果】分离了猪该基因包括内含子9的片段（GenBank收录号为AY880668）,首次将GAS6基因物理定位于猪SSC11 q11-17,与微卫星SW1452标记紧密连锁,LOD值为16.88,存留率为22%,在放射杂交图谱上的图距为56 cR。【结论】GAS6基因区间定位结果与精细定位结果相一致,也与比较定位结果相一致,并进一步验证了猪11号染色体（SSC11）和人大部分13号染色体（HSA13）存在同源性。     

用引物原位合成和体细胞杂种克隆板将猪微卫星SW943定位于12p11～(2/3p13)

 以Dig 11 dUTP为报告分子 ,运用猪微卫星SW 94 3引物在猪减数分裂粗线期二价体 (下称二价体 )上进行引物原位DNA合成 (primedinsitulabeling ,PRINS) ,用鼠抗地高辛、兔抗鼠、羊抗兔抗体检测引物原位合成结果对SW 94 3进行定位研究 ,同时运用包含猪 啮齿类 2 7个细胞系的杂种细胞克隆板 ,通过PCR扩增进行SW 94 3的定位 ,结果将猪微卫星SW 94 3定位于 12 p11～ (2 /3p13)。     

牛ACAS2基因的克隆、序列分析及染色体物理定位

以中国西门塔尔牛肝脏组织为材料,运用同源序列克隆技术并结合RT-PCR技术,对牛ACAS 2基因的部分cDNA进行了克隆与序列分析,应用SUN bRH 7000型辐射杂种板对分离的牛ACAS 2基因进行了染色体定位。结果显示,本研究所获得的长为1 535 bp的cDNA序列为牛ACAS 2基因的部分编码序列,该段序列与人(G enB ank登录号:NM-139274)和小鼠(G enB ank登录号:NM-019811)的ACAS 2基因mRNA序列的相似性分别为91%和88%;牛ACAS 2基因被定位于牛的13号染色体上,与该染色体上的标记D IK 4350的距离为1.51 cR。     

猪CACNA2D1基因定位及与相关遗传图谱的整合分析

【目的】定位猪CACNA2D1基因并分析该基因是否可作为影响猪某些生产性状的候选基因。【方法】扩增并测定猪CACNA2D1基因的部分序列,运用辐射杂种细胞系对其进行定位并将定位结果与相关遗传图谱进行整合分析。【结果】将猪CACNA2D1基因定位在猪9号染色体79.3~86.7 cM的位置上,发现在CACNA2D1基因定位区域有3个分别影响母猪发情期排卵数、胴体肩胛重以及10周龄体重的QTL,在定位区域附近有影响猪屠宰24 h后肌肉pH值的QTL。【结论】猪CACNA2D1基因可作为猪繁殖性状、胴体性状、生长性状甚至肉质性状的候选基因进行进一步的研究。     

供体细胞系基因座位特异DNA 甲基化多态性 及其与猪克隆效率的关联分析

利用甲基化限制性酶切试验(Combined bisulfite restriction analysis, COBRA）和亚硫酸盐转换PCR (Bisulfite sequencing PCR , BSP）后测序的方法,筛选猪体细胞克隆优势供体细胞提供基因座位特异的DNA 甲基化 遗传标记。比较8 个发育重要基因的差异甲基化区域(Differentially methylated regions,DMRs）在不同克隆供体细胞系 中的DNA 甲基化多态性,并与猪克隆成绩进行关联分析。结果表明院除了XIST-DMR2 和H19-DMR3 DNA 甲基化变 异幅度较小(低于10%）外,其他基因的相关座位均存在一定的COBRA 多态性,其中,LINE1-DMR1、POU5F1-DMR1 和NANOG-DMR1 等3 个差异甲基化化区域在克隆效率最高细胞系中处均处于最低程度的DNA 甲基化状态,因此, 可作为筛选猪体细胞克隆优势供体细胞系的潜在的DNA 甲基化遗传标记。     

猪COPG2和MEST克隆、印记状况和组织表达分析

【目的】为了在猪中找到更多新的候选印记基因并分析它们在哺乳动物之间的保守性,以期为猪分子遗传育种提供基础分子生物学信息和分子标记。【方法】以长白与荣昌猪杂交F1 代一月龄个体为研究对象,通过比较生物学的方法,克隆COPG2和MEST全长cDNA,并分析基因的序列特点,然后利用 IMpRH(法国农业科学院的辐射杂种克隆板)分析COPG2和MEST在猪染色体上定位信息。通过RT-PCR产物直接测序方法分析了这些基因在一月龄F1代个体11个不同组织(心、胃、肌肉、肾脏、肺、肝、小肠、膀胱、舌头、脾和脂肪)的印记状况,并进一步利用Real-time PCR方法,分析其在一月龄F1代个体11个不同组织的表达情况。【结果】克隆得到2 817 bp COPG2和2 219 bp MEST序列。其中COPG2 包括2 616 bp 完整CDS(coding sequenc,编码序列)区域,分析表明其编码含871个氨基酸的蛋白质,MEST包括981 bp完整CDS区域,编码326个氨基酸的蛋白质。IMpRH分析结果表明,猪COPG2和MEST都位于猪18号染色体上并且与标记CL365941紧密连锁,LOD值分别为14.32和8.5。印记分析表明COPG2在11个组织中呈双等位表达,MEST在心脏、胃、肌肉、肾、肺、膀胱、舌头和脂肪中表达父方等位基因,但在肝脏、小肠和脾脏中呈双等位表达。荧光定量结果显示COPG2 和MEST总的表达量在一月龄个体各组织间存在着显著性差异(P＜0.01),其中COPG2和MEST在肾脏中表达量均高于其它各组织(P＜0.01)。【结论】在哺乳动物之间,COPG2序列较为保守但是印记状况却缺乏保守性;MEST序列和印记状况均较为保守,但MEST在猪中印记状况具有组织特异性。此外,染色体定位信息和印记状况证实了在猪的18号染色体上有由COPG2和MEST构成的新的印记域。     

猪PDCD5基因的克隆与真核表达

用RT-PCR方法从猪肝组织中扩增出猪PDCD5(programmed cell death 5)编码序列,TA克隆至pMD-19T载体中,软件分析猪PDCD5基因的核算序列和蛋白序列,进行染色体定位.构建真核表达载体,将PDCD5基因编码区序列插入绿色荧光蛋白报告基因的真核表达载体pEGFP-C1中.通过脂质体转染法将重组载体瞬转入猪脐静脉血管内皮细胞系(SUVECs)进行瞬时表达.结果表明:该序列编码125个氨基酸,猪PDCD5基因定位于猪6号染色体,含有6个外显子,与人PDCD5基因高度同源.双酶切鉴定和测序表明:重组真核表达载体构建成功,荧光检测和Western blot检测显示PDCD5融合蛋白表达.研究结果为探讨猪PDCD5基因在细胞凋亡调控中的功能提供了基础数据.     

放射杂交在猪基因组研究中的应用与展望

采用高剂量射线打断供体细胞染色体,再将断裂的染色体与啮齿类细胞株融合进行放射杂交(RH),这种放射杂交在人和小鼠的基因组研究中已得到广泛的应用。对RH定位的原理、猪RH板的种类以及RH在猪基因组研究中的应用等方面进行综述,指出RH定位在猪基因组研究中的重要作用。     

猪TAF7基因的克隆、染色体定位和组织表达谱分析

 【目的】通过对猪TAF7基因初步的研究,为猪分子遗传育种提供基础分子生物学信息,为猪的遗传育种提供分子标记。【方法】以五指山猪为研究对象,克隆TAF7基因,分析该基因结构特点,然后利用IMpRH（the INRA-University of Minnesota porcine radiation hybrid,法国农业科学院-明尼苏达大学的辐射杂种克隆板）分析该基因在猪染色体上定位信息,利用半定量RT-PCR方法,分析该基因在成年五指山猪16个不同组织（心脏、背肌、淋巴、脾脏、肝脏、肾脏、肺脏、子宫、睾丸、胃、小肠、大肠、卵巢、胸腺、脑、脂肪）的表达谱信息。【结果】克隆得到长1 701 bp的五指山猪TAF7基因序列,其中包括1 050 bp完整CDS（Coding Sequence,编码序列）区域,分析表明其编码含349个氨基酸的蛋白质。利用IMpRH分析结果表明,猪TAF7基因与分子标记SW1879和IL4（interleukin-4,白细胞介素-4）紧密连锁,LOD（Limit of Detection,检测极限）值分别为6.69和6.15。组织表达谱分析结果显示该基因在大多数组织中均有表达,其中在睾丸表达量较高,而在心脏、背肌中表达很低。【结论】猪TAF7基因5’UTR中有一个短的内含子,而在该基因CDS区域没有内含子。猪TAF7蛋白序列与人TAF7蛋白序列的相似性较高,二者在生物系统发育树中的距离最接近。猪TAF7基因在大多数组织中均表达,在猪睾丸中表达量较高,证实它调节目的基因转录具有广泛性。     

染色体原位杂交技术与植物体细胞杂种遗传鉴定

染色体原位杂交技术近年发展较快，已广泛应用于植物遗传育种实践。在植物体细胞杂种遗传鉴定方面，染色体原位杂交技术也日益显示出其优势，可用于倍性变异的来源检测，非对称杂种的非对称程度确认，融合双亲的基因组互作，染色体行为分析，以及融合双亲染色体在体细胞杂种有性过程中的传递等。还探讨了染色体原位杂交技术在柑桔远缘体细胞杂种遗传鉴定中的应用前景。     

家蚕突变型浓黑蛹的遗传分析研究

将家蚕浓黑蛹与其他突变型蛹进行杂交分析,结果表明:浓黑蛹为隐性突变;浓黑蛹与家蚕龙角基因(K)连锁,属于第11连锁群;浓黑蛹与黑蛹(bp)为相同基因座的遗传突变。据此将浓黑蛹基因符号命为bp2。     

基因治疗奶牛乳腺炎的生物安全评价

为评价基因治疗奶牛乳腺炎的生物安全性,以3头患隐性乳腺炎的奶牛作为试验对象,通过乳房基部穿刺注射接种携带人溶菌酶基因的乳腺特异性表达重组质粒p215C3LYZ(1 600μg·头~(-1)),24 h后以相同剂量重复注射1次.定期采集试验奶牛的乳样、粪样、尿样以及试验牛舍的垫料和水样,并利用建立的PCR进行检测.结果发现,除第2次注射24 h内可从奶样中检测到重组质粒外,其他样品均为阴性,这表明重组质粒p215C3LYZ不能在奶牛体内长期残留,也不能在环境中释放及散播.所有奶牛均于第2次注射20 d后处死,并采集血液、心、肝,脾、肺、肾、肌肉以及乳腺等样品进行PCR检测,结果表明:重组质粒p215C3LYZ在奶牛体内未发生转移.     

The human gene for the beta subunit of nerve growth factor is located on the proximal short arm of chromosome 1

Fragments of the recently cloned human gene for the beta subunit of nerve growth factor (beta-NGF) were used as hybridization probes in analyzing two sets of rodent-human somatic cell hybrids for the presence of human beta-NGF sequences. Results from the first set of hybrids assigned the human beta-NGF gene to chromosome 1 and ruled out the presence of sequences of comparable homology on any other chromosome. With the second set of hybrids, which contained seven different, but overlapping, regions of chromosome 1, the NGF locus was mapped to band 1p22.     

星形细胞瘤及星形细胞反应性增生中胶质原纤维酸性蛋白和DNA的定量研究

用全自动图像分析仪，对４０例－Ⅰ－Ⅳ级星形细胞瘤及１０例星形细胞反应增生了胶质原纤维酸性蛋白免疫组化及ＤＮＡ组织化学的定量研究，结果显示：星形细胞反应性增生时，ＧＦＡＰ含量高于星形细胞瘤，随着星形细胞瘤分级的递增，ＧＦＡＰ含量农渐降低，ＤＮＡ含量恰好遵循相反的规律；ＧＦＡＰ和ＤＮＡ含量之间有良好的线性相关关系。     

肉仔鸡卫星细胞氧化应激时MAPK信号通路

 【目的】在地塞米松(DEX)诱导骨骼肌卫星细胞氧化应激的体外条件下,筛选丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)信号系统中起关键作用的信号通路。【方法】 将体外培养的肉仔鸡胸肌骨骼肌卫星细胞(SCs)分别进行处理：Ⅰ、对照组;Ⅱ、DEX;Ⅲ、p38 MAPK抑制剂;Ⅳ、DEX+p38 MAPK抑制剂;Ⅴ、JNK抑制剂;Ⅵ、DEX+JNK抑制剂;Ⅶ、ERK5抑制剂;Ⅷ、DEX+ERK5抑制剂;Ⅸ、ERK1/2抑制剂;Ⅹ、DEX+ERK 1/2抑制剂。除处理Ⅰ和处理Ⅱ外,其它处理首先用抑制剂预处理30 min,弃去培养基后,再按处理设置分别加入含DEX的培养基或者正常培养基继续处理24 h。处理结束后,分别测定细胞培养液中丙二醛(MDA)、活性氧自由基(ROS)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽硫转酶(GST)含量或活性;同时采用RT-PCR方法检测通路蛋白及SOD与GST基因表达量。【结果】 抑制剂单独处理组MDA和ROS的产生量显著低于DEX处理(P＜0.05);DEX+ERK5抑制剂处理与DEX+ERK 1/2抑制剂处理的MDA和ROS产生量显著高于ERK 5抑制剂处理和ERK1/2抑制剂处理(P＜0.05); DEX+p38 MAPK抑制剂处理与 DEX+JNK抑制剂处理组的MDA和ROS产生量与p38 MAPK处理和JNK处理的差异不显著(P＞0.05)。抑制剂单独处理组的SOD和GST活性比DEX处理高(P＜0.01);DEX+ERK5抑制剂处理与 DEX+ERK 1/2抑制剂处理的SOD和GST活性极显著低于ERK5抑制剂处理组和ERK1/2抑制剂处理组(P＜0.01),DEX+p38 MAPK抑制剂处理与DEX+JNK抑制剂处理的SOD和GST活性与p38 MAPK抑制剂处理和 JNK抑制剂处理的差异不显著(P＞0.05)。基因表达结果表明,DEX能够抑制GST和SOD基因的表达,抑制率达37%以上。与抑制ERK5和ERK1/2通路不同,抑制p38 MAPK和JNK通路后,DEX对GST和SOD基因的表达无明显抑制作用。【结论】 在DEX诱导的肉仔鸡胸肌骨骼肌SCs产生的氧化应激过程中,p38 MAPK和JNK通路起着关键作用。     

鸡p15INK4B基因的克隆表达及纯化

为研究鸡p15INK4B蛋白的功能及为制备此蛋白的单克隆抗体提供材料,应用引物搭桥法合成p15INK4B基因,应用基因工程的手段构建p15INK4B基因的原核表达载体,在E.coliRosetta(DE3)菌进行融合表达,并对表达产物进行亲和层析纯化。结果成功地构建了p15INK4B基因原核表达载体,经亲和层析制备了较高纯度的目的表达产物。     

利用5'LongSAGE标签分析蜜蜂肌球蛋白调节性轻链基因MLC-2选择性转录起始位点

使用西方蜜蜂雄蜂头部5’LongSAGE文库中的肌球蛋白调节性轻链基因MLC-2的标签序列,在蜜蜂全基因组序列上定位了该基因的转录起始位点(TSS),并进而预测了其启动子的结构。结果显示:蜜蜂MLC-2基因存在17个TSS,其中16个定位于MLC-2基因开放阅读框上游100bp的范围内。MLC-2基因的各TSS的使用效率不同,其中有3个优势TSS,由之起始的转录本分别占该基因总转录本数量的9.76%、54.47%和11.38%。从碱基组成来看,蜜蜂MLC-2基因TSS的第1个碱基为A、G、T、C的概率分别为58.8%、29.4%、0和11.8%。MLC-2基因的启动子结构预测结果表明,在TSS上游的300bp区域内有3个核心启动子元件。研究结果对研究蜜蜂MLC-2基因的表达调控与确定其全长cDNA序列具有重要意义。     

中国肝细胞癌p53基因热点突变R249S的载体构建及其在细胞中的表达

抑癌基因p53突变是人肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）中常见的现象，中国江苏启东地区的HCC患者中p53基因的第249位密码子突变AGG→AGT/Arg→Ser（R249S）被认为是热点突变。本研究以人肝cDNA为模板，扩增人全长p53基因，将其克隆到pCMV-Myc载体中。利用定点突变引物以pC-MV-p53为模板，构建R249S定点突变体pCMV-R249S，转染p53缺陷型的H1299细胞系。Western Blot检测表明，克隆在pCMV-Myc载体中的p53基因和249位密码子热点突变的p53基因都可以在H1299细胞系中表达。     

青蛤MAPK/p38基因的克隆及Poly∶Ic胁迫下的表达分析

[目的]克隆青蛤MAPK/p38基因,并分析其在Poly:Ic胁迫下的表达情况。[方法]利用转录组测序获得青蛤MAPK/p38基因的序列信息,采用生物信息学软件分析该基因在近缘生物间的进化关系;利用巢式及荧光定量PCR技术克隆青蛤MAPK/p38基因的结构域序列,并在Poly:Ic胁迫后立即分析该基因在青蛤各组织中的表达情况以及血淋巴中的时序性表达情况。[结果]克隆得到青蛤MAPK/p38基因的结构域序列,分析发现该基因在物种进化中很保守,其在青蛤的血淋巴、肝脏、外套膜、闭壳肌和鳃中均有表达,其中在血淋巴中表达量最高,腮中表达量最低。Poly:Ic胁迫3 h后该基因的表达量达到最大值,与对照组差异极显著(P0.01)。[结论]MAPK/p38基因所表达的产物是青蛤重要的免疫信号通路蛋白。     

水稻基因启动子OsBTF3p的克隆和启动活性分析

 【目的】分子克隆水稻基因OsBTF3启动子片段,明确其对靶基因表达的启动作用,为抗病转基因水稻研究提供理论依据和启动子元件材料。【方法】对OsBTF3编码区上游1387 bp的启动子（OsBTF3p）序列进行了克隆和序列分析,构建了OsBTF3p∷GUS融合基因植物表达载体pCAM-OsBTF3p,利用农杆菌介导的水稻遗传转化,获得了39株OsBTF3p∷GUS转基因植株,对OsBTF3p进行了启动活性、组织特异性及病原菌诱导性分析。【结果】分子克隆了OsBTF3p片段,其序列与GenBank中的已知序列一致。在转基因水稻愈伤组织中能够检测到GUS活性,表明该启动子具有启动活性。在转基因水稻叶片维管束组织和根部组织能检测到GUS活性。水稻白叶枯病菌(Xoo)侵染后OsBTF3p驱动的GUS活性明显地上调表达。【结论】OsBTF3p具有驱动GUS基因表达的启动活性、组织表达特异性和病原菌诱导性。