基于锁核酸探针的双重荧光实时RT-PCR检测方法鉴别新城疫中强毒株与弱毒株

为鉴别新城疫病毒(NDV)强毒株和弱毒株,本研究建立了基于新型锁核酸(LNA)探针的实时荧光RT-PCR检测方法(Duplex LNA rRT-PCR)。该方法针对NDVF基因裂解位点设计了两条新型LNA探针,通过对11株NDV株进行大将军脂duplex LNA rRT-PCR检测方法检测,验证该方法的特异性;通过对副粘病毒I型(APMV-1)和NDV中强毒株(vNDV)不同浓度病毒液进行检测,确定该方法的灵敏度,并与TaqMan实时荧光RT-PCR检测方法进行比较。结果显示本研究所建立的方法对11株NDV检测的特异性为100%(11/11),优于TaqMan实时荧光RT-PCR检测方法(10/11);所建立的duplex LNA rRT-PCR方法检测中强毒株F48E9和弱毒株LaSota的灵敏度分别为10个EID50和0.1个EID50,比美国农业部推荐的TaqMan实时荧光RT-PCR检测方法低10倍。本研究利用新型LNA探针技术,建立了鉴别NDV中强毒株与弱毒株的duplex LNA rRT-PCR检测方法,可以特异性检测NDV并有效区分中强毒株与弱毒株,适合用于鸡场和进出境动物产品中NDV的快速检测。     

禽新城疫快速鉴别诊断方法的建立

依据新城疫病毒（NDV）融合蛋白（F）基因裂解位点的核苷酸序列与其毒力的相关规律，分别设计合成了四条寡核苷酸引物，建立了一个可迅速检测不同禽源新城疫毒株并可鉴定强、弱毒株的逆转录酶－－聚合酶链式反应（RT－PCR）技术，对强毒株可扩增出362bp的通用片段和254bp的强毒株特异性片段；弱毒株则可扩增出362bp的通用片段和123bp的弱毒株特异性片段。本方法只需一个RT－PCR反应，整个过程在8小时内完成，既可检测感染鸡胚尿囊液，也可从病料直接检测，应用该方法对源于各种禽类的36份ND可疑病粒样品进行检测试验，结果阳性检出率为73.5%，与常规方法检测的结果相一致。     

华南地区三株新城疫地方强毒株的序列测定及其系统发育分析

用设计的特异性引物，通过一步法RT-PCR扩增出5个毒株的897bp片段，对其中的3株病毒cDNA分析表明：各毒株的半胱胺酸位点和个数及糖化位点基本没有改变。各毒株在抗原决定簇氨基酸位点HN基因346-353处的碱基突变甚多，且氨基酸也出现了部分的突变。针对HN基因897bp片段构建了相应的系统发育树，系统发育分析表明：中国（华南）地区NDV各毒株与欧美国家的Ⅱ至Ⅴ基因群明显分离，遗传规律较远；NDV-WS1和NDV-HY与台湾省NDV各毒株归属为一组，与中国毒株的遗传距离较近，均属新近出现的基因型Ⅶ型，NDⅦ型在远东和西欧（Ⅶb）和及中东和南非（Ⅶa）广泛存在，可能形成了ND的第4次大流行。这些一方面说明NDV的变异可能已突破种源屏障，在鸡与鹅之间进行相互传播；另一方面说明中国古老的NDV毒株仍然持续存在，并逐渐向强毒株突变，与其他新出现的基因型毒株“共循环“。     

多重聚合酶链反应快速检测鉴别鸡毒支原体强毒株和弱毒疫苗株的研究

根据鸡毒支原体强毒株和弱毒疫苗株基因组的结构特点，设计合成了二对引物XZ1，XZ2和XZ45、XZ46，建立了一种同时检测鉴别MG野毒株和弱毒疫苗株的多重PCR技术。试验结果表明，用这两对引物对MG强毒株和弱毒疫苗侏进行多重PCR，强毒株只扩增出732bp一条带，而弱毒疫苗株则可同时扩增出732bp、524bp二条带，而对其他种类鸡支原体和其它禽病病原的扩增不出现任何条带，结果均为阴性；敏感性测定结果表明，该多重PCR最低能检出1Pg的MG强毒株和弱毒疫苗株的DNA模板。     

鸡新城疫病毒强弱毒株RT_PCR鉴别诊断方法

本研究通过对大量不同毒力ＮＤＶ Ｆ基因核苷酸序列分析,根据毒力和序列间的相关规律,分别设计合成了两组引物,建立一个可以迅速鉴别ＮＤＶ强、弱毒株的ＲＴ－ＰＣＲ方法,对强毒株可扩增出１３３ｂｐ的特异性片段的３６２ｂｐ的通用片段,弱毒株可以扩增出２５２ｂｐ的特异性片段的３６２ｂｐ的通用片段。只需一个ＲＴ－ＰＣＲ反应,整个实验过程可在５小时内完成。敏感性测定结果表明该方法的最低检出量不低于５００ｐｇ的ＤＮＶ ＲＮＡ。为了增加方法的实用性,我们进一步建立了直接从组织病料中检测并鉴别强弱毒株的方法。     

新城疫天然弱毒株B95研究初报

由新城疫病毒（NDV）引起的新城疫（ND），是严重威胁养鸡业的一种世界性分布的病毒性传染病，对该病的防制主要依靠NDV疫苗。我国商品代鸡场对ND的预防主要是各兽K生物药厂生产的行系（IV系，I系为主）疫苗，种鸡场事用进口疫苗。这些疫苗的应用对预防ND、保障养鸡业的发展起了很大的作用。近年来．由于疫苗本身质量问题及保存、运输、使用等方面的问题，ND在许多地方时有发生。在发生超强毒ND时常可导致鸡群全群死亡，造成严重的经济损失。此外，非典型新城疫的存在，也日益使新城疫的防制复杂化了。为了更好地控制新城疫，研究提…     

鉴别新城疫病毒弱毒株的抗多肽抗体制备

针对鸡新城疫病毒（ＮＤＶ）弱毒株Ｆ蛋白前体（Ｆ０）Ｆ２片段的特异结构,人工合成特异性多肽,将多肽与牛血清白蛋白（ＢＳＡ）化学偶联制和轩成全抗原后免疫小鼠,制备抗多肽血清。经ＥＬＩＳＡ检测,该抗体与ＭＤＶ弱毒株呈阳性反应,而与鸡痘病毒（ＦＰＶ）,鸡传染性腔上囊病病毒（ＩＢＤＶ）,ＭＤＶ强毒Ｆ４８Ｅ８株和四平析呈阴性反应,试验结果证明该抗体可以用于鉴别ＮＤＶ弱毒株。     

新城疫病毒弱毒株分子生物学特性的研究

于１９９６年从长春地区一养鸡场分离到一株新城疫病毒（ＮＤＶ长春株）,经过病毒生物学特性的研究表明该ＮＤＶ毒株为弱毒株。将ＮＤＶ长春株纯化培养后,提取病毒ＲＮＡ,经ＲＴ－ＰＣＲ扩增Ｆ基因,并测定出Ｆ基因的全部核苷酸序列为１７５８ｂｐ,编码有５５３个氨基酸残基。与国内外发表的部分ＮＤＶ病毒的强毒株和弱毒株的相同序列进行比较,其核苷酸同源性在８８．２％￣９６．７％之间,氨基酸同源性在９０．１％￣９８．１％之间,并与所有弱毒株Ｆ蛋白裂解位点区（１１２￣１１７）氨基酸序列Ｇｌｙ－Ａｒｇ／Ｌｙｓ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ／Ｓｅｒ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ相同,从基因和分子水平上进一步证明ＮＤＶ长春株为ＮＤＶ弱毒株。     

伪狂犬病弱毒疫苗与野毒株PCR鉴别诊断方法的建立

目前,在国内用于预防猪伪狂犬病的疫苗主要是基因缺失的弱毒（Ｂａｒｔｈａ－Ｋ６１）为了有效地地区弱毒免疫猪和野毒感染猪,本实验分别建立了一种通用和一种鉴别ＰＣＲ诊断方法,根据已发表的伪狂犬病病毒（ＰｒＶ）ｇＢ,ｇＥ基因的序列,设计并合成了两对引物：ＰＢ１／ＰＢ２和ＰＥ１／ＰＥ２,以疫苗株Ｂａｒｔｈａｋ－６１及野毒株Ｓ,Ｓｕ,Ｆ,Ｌ,Ｙ及闽Ａ（Ｍｉｎ－Ａ）ＤＮＡ为模板进行了ＰＣＲ扩增,结果显示用引物Ｐ     

新城疫病毒系统发育分析及强弱毒株的鉴别诊断

本文综述了新城疫病毒的流行病学和病毒基因的系统发育情况,对不同ＮＤＶ毒株的强弱毒力鉴别方法进行了详细的介绍,将为新城疫的认识和防制提供新的理论基础和实践方法。     

用RT—PCR鉴别新城疫病毒不同毒力株的研究进展

本文概述了用RT－PCR技术检测新城疫病毒（NDV）的研究进展。主要介绍了鸡新城疫病毒（NDV）基因组结构以及强弱毒株F蛋白在裂解位点附近的氨基酸差异以及从感染鸡胚尿囊液提取RNA和从组织匀浆直接提取RNA,并用之作RT－PCR以鉴别NDV毒株毒力和诊断ND的研究现状及应用前景。     

一起鸡新城疫的诊断及强弱毒株鉴别的研究

某鸡场鸡群中出现以神经症状、产蛋下降、畸形蛋增多和呼吸困难、腹泻等为主要特征的疾病,对发病鸡场进行实地走访并采集发病鸡病料。根据临床症状,病理剖检及实验室细菌学、血清学、病毒学检测,鉴定该鸡场发生新城疫疫情,并继发鸡群大肠杆菌感染;通过实时荧光RT-PCR检测,对该病毒进行强弱毒株的鉴别,显示该鸡场发生的新城疫是由新城疫中强毒株引起的。     

新城疫热稳定性天然弱毒株B95免疫学特性的研究

采免疫鸡口腔、泄殖腔分泌物接种鸡胚，测尿囊液中病毒凝集价表明，免疫后2－11天口腔、泄殖腔分泌物中均有B95病毒粒子的存在。同居感染试验表明，免疫后12、16天时两组鸡抗体水平基本相同。B95经不同途径免疫鸡，均能刺激机体产生良好的免疫应答，其中点眼和喷雾免疫效果最好。与Clone30、V4、LaSota疫苗相比较，B95免疫鸡HI抗体产生快、水平高、持续时间长。     

禽流感分子生物学快速诊断方法的研究进展

禽流感(Avian Influenza,AI)自1878年首次报道以来已有100多年的历史,目前已遍布于世界上许多国家和地区,给养禽业造成了巨大的经济损失,特别是高致病性禽流感(HPAI),是严重危害养禽业的烈性传染病,可对鸡群造成毁灭性的打击。1997年香港禽流感事件中,禽流感病毒首次突破种间屏     

不同新城疫弱毒苗对新城疫病毒强毒的免疫保护试验

用NDV的LaSota株、VG/GA 株、VH 株、PHY LMV 42株及Clone 30株弱毒疫苗免疫SPF鸡后 ,通过对雏鸡免疫后的血清抗体监测表明 ,4种弱毒疫苗激发雏鸡的抗新城疫病毒抗体滴度在 7log2水平以下 ,且差异不显著。通过以上 4种新城疫弱毒疫苗对新城疫病毒东台强毒株的免疫保护试验表明 :至少单独使用弱毒疫苗 ,不能对东台地区流行的新城疫病毒强毒株提供有效保护 ,保护率在 60 %～ 74%