菊苣农杆菌介导转化受体系统的研究(简报)

对影响菊苣转化受体系统几种重要因素进行了初步探讨。研究结果表明,采用菊苣叶片、茎段作为外植体,在MS 6-BA 1.5 mg/L IBA 0.2 mg/L培养基上,再生频率达100%,农杆菌菌株LBA4404介导菊苣遗传转化体系中,经生根后20~25 d的叶片,遗传转化效果最佳。共培养2 d,同时附加20~25 mg/L卡那霉素和500~600mg/L头孢霉素,转化频率由1.5%提高到7.1%左右。     

农杆菌介导普那菊苣遗传转化体系的建立

以普那菊苣(Cichorium intybus L.cv.Puna)叶片为试验材料,接种于含不同激素浓度配比的MS培养基上进行愈伤组织、芽分化以及根再生的诱导,分析了不同激素浓度及其配比对愈伤组织诱导和芽分化以及根再生效果的影响。以已经建立的再生体系为基础,以农杆菌菌株LBA4404(含质粒pBin438-TaNHX2)侵染转化普那菊苣,探索普那菊苣高效遗传转化体系。结果表明:对外植体适宜的预培养时间为2～3d,与农杆菌的共培养时间也应控制在2～3d;侵染时间控制在8min左右;卡那霉素(Km)阳性筛选的适宜选择浓度为60mg·L^-1。乙酰丁香酮(AS)200μmol·L^-1是促进农杆菌转化的最佳浓度,200 W超声波处理、20次负压处理也可提高农杆菌转化率效果。26mg·L^-1 Km是野生型普那菊苣苗能够存活的上限,头孢唑林钠和头孢噻肟钠在500～1000mg·L^-1浓度范围内、羧苄青霉素300mg·L^-1和氨苄青霉素在40～60mg·L^-1浓度范围内均能较好的诱导出愈伤组织和芽。将来自小麦(Triticum aestivum)的Na⁺/H⁺逆向转运蛋白(vacuolar Na⁺/H⁺exchanger or antiporter,简称NHX,NHE或NHA)导入普那菊苣;经抗生素筛选以及针对TaNHX2基因的PCR检测和Southern杂交分析,证明获得了28株转TaNHX2基因的普那菊苣植株。     

发根农杆菌介导的百脉根的基因转化

本文报道了豆科植物简单有效的转化再生实验系统。百脉根子叶外植体被含发根性Ｒｉ质粒载体的发根农杆菌感染，该载体带有一个ｕｐｔ－Ⅱ基因和一个甘露碱合成酶基因，在含卡那纱的筛选培养基上，外植体能诱导出毛根，并不断生长，毛根诱导频率为４５．５％。切取毛根根段在筛选培养基上培养，毛根能膨大，并分化再生成苗和植株，其再生率为７６７．９％。抗性植株形态正常，浅层根系发达，ＤＮＡ斑点杂交与Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交证明     

农杆菌介导的桑树遗传转化条件的研究

本实验探讨了多种因子对桑树遗传转化的影响,结果表明:菌株LBA4404 比C58Cl转化效率高;不同外植体转化效率有差异,以叶盘、茎尖和愈伤组织为受体转化频率分别为8.7% 、5.6% 和2.8% ;农杆菌菌液浓度、感染时间、共培养时间等对桑树叶盘转化效率有一定影响;AgNO3 对遗传转化具有明显的促进作用。     

农杆菌介导多年生黑麦草遗传转化体系的建立

AVP1基因能够提高植物的抗盐性,通过农杆菌介导AVP1基因转化多年生黑麦草,并建立了较为成熟的遗传转化体系。研究表明,将预培养4d的黑麦草胚性愈伤组织经OD600为0.6左右的农杆菌菌液在负压下侵染6min,共培养3d,用250mg/L的羧苄青霉素(Carb)脱菌,附加150μmol/L的乙酰丁香酮(AS),然后转接到含75mg/L潮霉素(Hpt)的筛选培养基上进行筛选培养的转化体系效果最佳。     

菊苣高效遗传转化体系的建立

研究了影响农杆菌GV1301菌株介导的菊苣遗传转化的几种因素,建立了菊苣高效遗传转化体系,获得了转基因抗性苗.结果表明,采用菊苣叶片,经预培养和共培养2 d,农杆菌浸泡时间为5～7 min,卡那霉素20 mg/L,头孢霉素600 mg/L,最高转化频率达7.1%,经PCR检测,目的基因已整合到菊苣基因组中.     

农杆菌介导禾本科植物遗传转化的研究进展

农杆菌介导的遗传转化是目前禾本科植物进行转基因的有效手段,高效遗传转化体系建立的关键是优化T-DNA导入的各因素。文中主要从农杆菌菌株及载体、植物受体的选择、侵染与共培养、抗生素及添加剂的筛选等方面详细阐述了农杆菌介导植物遗传转化的主要影响因素,为实践操作提供了理论依据。     

农杆菌介导犁苞滨藜NHX基因转化苜蓿的影响因素

以新牧1号杂花苜蓿(Medicago varia Martin.cv.Xinmu No.1)和新疆大叶苜蓿(Medicago sativa L.cv.Xinjiang Daye)无菌苗叶片和子叶为材料,通过根癌农杆菌EHA105介导转化犁苞滨藜NHX耐盐基因,提高植株耐盐性。本文对农杆菌转化条件进行研究,结果表明:以预培养3d的子叶为转化受体,菌液浓度OD₆₀₀为0.4～0.5时,浸染10～15min,然后转入附加20～30mg/L乙酰丁香酮的共培养基,培养4d,可以获得较高的转化效率;对抗性芽的PCR检测初步证明,外源基因整合到苜蓿的基因组中。     

农杆菌介导的PSAG12-IPT基因转化柳枝稷研究

为延长生物能源作物柳枝稷(Panicum virgatum)的叶片功能期,以柳枝稷‘西稷1号’品系的成熟胚诱导的愈伤组织为受体,采用农杆菌介导法转化叶片衰老延缓基因P_SAG12-IPT.结果表明:经过农杆菌转化,共培养,抗性愈伤组织筛选、再生和生根培养,在农杆菌介导处理的8500块愈伤组织中共获得了320株转化植株;经PCR检测分析,转化植株中共有19株植株扩增出标记基因潮霉素B磷酸转移酶基因的目标片段,初步表明P_SAG12-IPT基因已整合到柳枝稷基因组中,转化率为0.223%.对柳枝稷转基因植株的叶片叶绿素含量、净光合速率、胞间CO₂浓度和气孔导度进行测定,表明P_SAG12-IPT基因在部分转基因植株中已经表达.     

农杆菌介导红三叶草遗传转化体系的建立

以红三叶草品种‘Altaswede’作为受体材料,以GUS基因为报告基因,研究了影响农杆菌介导红三叶草遗传转化的几种因素以及几种侵染方法对提高转化效率的影响。建立了农杆菌介导的红三叶草快速高效遗传转化体系,并获得了转基因抗性苗。研究结果表明,以上胚轴为外植体,在OD600值为0.6的菌液中侵染20 min,真空度6×10-2Pa处理9 min,共培养5 d后转入含卡那霉素50 mg/L的分化培养基中,4周后60%的外植体分化出不定芽并生根成苗。PCR分子检测表明有80%的植株为GUS阳性,转化率约为50%。     

发根农杆菌介导的花苜蓿毛状根转化体系的建立

为开发一种高效的花苜蓿（Medicago ruthenica）转化体系,本试验以‘中科1号’花苜蓿为材料,使用发根农杆菌作为介导进行毛状根转化,并分析毛状根发生率和转化率。试验表明：利用本研究开发的方法可使花苜蓿在一周左右产生毛状根,其发生率可达72%;经鉴定,毛状根中成功转入基因并超表达的占66.7%。花苜蓿毛状根转化体系的建立将为其功能基因研究提供有力的手段,进而为苜蓿育种奠定基础。     

AtNHX1基因对菊苣的转化和耐盐性研究

用农杆菌介导法将AtNHX1基因导入菊苣中,共获得42株卡那霉素(Kan)抗性再生植株。经过PCR检测、Southern杂交和RT-PCR检测表明,AtNHX1基因已成功整合到菊苣基因组中,并且能够正常转录。野生型和转基因植株诱发的愈伤组织进行耐盐生长试验,结果显示,相同盐胁迫条件下,转基因愈伤组织的相对生长率显著高于野生型愈伤组织。施加梯度NaCl胁迫后,植株叶片K⁺和Na⁺含量测定结果显示,转基因植株叶片比野生型积累更多的Na⁺和K⁺,维持较高的K⁺/Na⁺;叶片相对电导率测定结果表明,转基因株系叶片相对电导率显著低于野生型。上述结果表明,AtNHX1基因的导入和表达在提高菊苣耐盐性的同时减轻了盐胁迫对植物细胞膜的伤害。     

根癌农杆菌介导的紫花苜蓿遗传转化体系的建立与优化

以“中苜1号”紫花苜蓿7日龄无菌苗子叶和再生无菌苗的叶片为材料，建立了适用于农杆菌介导的转基因组织培养体系，并对MsNHX1基因进行转化。转化优化条件为：“中苜1号”紫花苜蓿7日龄无菌苗子叶、再生无菌苗叶片，用农杆菌菌液（A600=0.6）侵染6min，然后在培养基上铺一层灭菌滤纸培养7d后清洗，建立了苜蓿快速有效的遗传转化体系。     

匍匐翦股颖农杆菌转化体系的研究

以匍匐翦股颖品种回旋、潘娜A-1、L-93的胚性愈伤组织为受体材料,利用根癌农杆菌EHA105介导将外源NAS基因导入其中,通过G418(40mg/L)筛选40d,分化培养得到再生植株,通过分子检测检出阳性株,最终农杆菌的转化率分别为0.90%、1.54%、2.02%。     

根癌农杆菌介导的1─磷酸甘露醇脱氢酶基因转化百脉根的研究

本文以百脉根子叶外植体为受体材料，通过根癌农杆菌介导的方法，导入外源目的基因1－磷酸甘露醇脱氨酶（mtlD）基因和npt－Ⅱ基因，建立了转化系统，获得转基因植株，转化频率为9．7％．转化处理的外植体再生植株的茎段在含卡那霉素的分化培养基上膨大，再生成苗和植株。抗性植株的形态正常，移入盆栽后生长良好。PCR扩增与扩增产物的Southern杂交证明外源基因已整合到百脉根基因组上。     

农杆菌介导的xynB基因转化苜蓿的初步研究

构建了PBI121-xynB表达载体,利用农杆菌介导法进行紫花苜蓿遗传转化研究,将xynB基因的cDNA序列导入苜蓿。转基因植株生长发育良好,RT—PCR检测xynB基因已经导入到苜蓿中,DNS方法检测转基因植株的木聚糖酶活性为10.5 U/g鲜叶片。     

农杆菌介导桑属（Morus）遗传转化进展

本介绍了农杆菌介导的植物遗传转化机理和方法，并对近年来农杆菌介导桑树遗传转化所取得的成就和存在的问题作简要综述，并对桑树基因工程进行展望。     

农杆菌介导的药百合鳞片遗传转化体系的建立

本试验以药百合鳞片高频再生体系为基础,研究了农杆菌介导的药百合鳞片遗传转化的几个影响因素。结果表明,预培养5 d有利于转化;共培养3 d并且添加100 μmol/L乙酰丁香酮有利于提高转化频率并抑制了农杆菌的过度生长;在侵染阶段添加150 μmol/L乙酰丁香酮,农杆菌侵染液pH 值5.7、光吸收值0.8,侵染时间10 min为最佳遗传转化体系。再生植株经gus基因的瞬时表达检测及hpt基因PCR检测证明载体已成功整合到药百合基因组中。     

农杆菌介导白三叶草高效遗传转化和转基因植株再生

利用子叶下胚轴为外植体,通过农杆菌Ti质粒介导途径,建立了白三叶草高效遗传转化及转基因植株高频率再生体系。PCR检测及Southern印迹鉴定结果表明,外源T-DNA片段已整合到转基因植株的基因组中,且多以1~2个少数拷贝存在。Northern印迹结果和对报告基因GusA编码蛋白的活性检测结果表明,目的基因在部分转基因植株中高水平表达。适宜条件下外植体遗传转化后的植株再生比例达58.23%~62.12%。与对照相比,转基因植株在外部形态上没有发生改变。