猪带绦虫囊尾蚴病特异性抗原筛选的研究进展

旨在为猪带绦虫囊尾蚴病免疫诊断方法和有效防治措施的建立奠定理论基础。阐述了猪带绦虫囊尾蚴病流行与危害及诊断和防控中存在的问题,回顾了利用cDNA文库筛选、噬菌体展示文库筛选、噬菌体肽库筛选技术和双向电泳免疫印迹筛选等几种技术对猪带绦虫囊尾蚴病特异性抗原的筛选,并将筛选到的特异性抗原进行简要介绍,分别阐明各抗原组分在该病诊断、预防和致病机理中作用及可能潜在的价值。通过猪带绦虫囊尾蚴病特异性抗原筛选说明,开展该病大规模、无渗漏抗原筛选研究,是解决虫体感染过程中不同发育时期免疫诊断、疫苗研制问题的关键。其研究重要性不但对该病本身的诊断和防控具有重要的意义,同时也为寄生虫病的诊断和防控提供新的思路。     

膜联蛋白B1在猪囊尾蚴免疫逃避作用的研究进展

膜联蛋白是一类有效的内源性调节蛋白,在Ca2+存在的条件下与膜磷脂结合,参与细胞活动的多种功能,其与肿瘤发生、自身免疫性疾病、病毒和寄生虫感染等密切相关.作为膜联蛋白家族成员Annexin B1具有独特的氨基酸残基结构,与不同种属的寄生虫入侵特异性宿主密切相关.本文主要阐述了膜联蛋白的种类及膜联蛋白B1在猪囊尾蚴感染宿...     

拟南芥未知基因At018融合蛋白原核表达条件的优化及纯化

本课题组在前期的研究中利用Al Cl3胁迫筛选碱茅全长c DNAs酵母表达文库获得到一个与铝毒害相关的未知基因(基因编号为018,用put018表示),该基因与拟南芥中未知基因(基因号为At5g57345,本研究中用At018表示)有较高的同源性。为了获得At018的纯化蛋白,本研究将拟南芥At018基因克隆后构建原核表达载体p GEX-6p-3-At018,再将其转入大肠杆菌BL21(DE3)菌株,利用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达。同时运用传统方法优化诱导条件,以提高重组融合蛋白的表达效率。SDS-PAGE分析结果表明,30℃下0.1 mmol/L IPTG的条件下诱导3 h后,GST-At018融合蛋白的表达量最大,蛋白分子质量与预测值相符,该蛋白主要以可溶性形式存在;接着利用Glutathione Sepharose4 Fast Flow亲核层析树脂纯化最终获得GST-At018融合蛋白。本研究可为进一步进行At018的功能解析提供基础。     

基于猪囊尾蚴M13h蛋白的ELISA方法的优化

利用纯化的猪囊尾蚴重组蛋白M13h作为抗原包被酶标板,通过棋盘滴定方法筛选最佳反应条件,初步建立了猪囊尾蚴病间接ELISA检测方法.确定最佳包被量为1 μg/mL,待检血清最佳稀释倍数为1∶100,酶标二抗的稀释倍数为1∶1000,二者的作用时间均为45 min;与猪弓形虫病、猪旋毛虫病、细颈囊尾蚴病、猪蛔虫病、包虫病...     

猪干扰素IFNE1基因克隆及重组表达载体的构建

依据电子延伸序列设计一对克隆引物,用RT-PCR法从猪胃组织扩增出猪干扰素epsilon 1(IFNE1)基因的完整编码区并进行序列分析;再根据克隆的序列设计一对表达引物,用PCR法从重组克隆载体中扩增出含EcoRI/XhoI酶切位点的猪IFNE1片段,插入原核表达载体,转化至宿主菌,诱导表达,SDS-PAGE鉴定融合蛋白。结果表明,克隆的猪IFNE1基因包含完整的开放阅读框架,长为586 bp,ORF为582 bp,编码193个氨基酸,与人、小鼠的同源性分别为83.6%和69.2%,推测的氨基酸序列与人、小鼠的同源性分别为76.2%和55.2%,表达的融合蛋白分子量约为47 kDa。     

猪博卡病毒NP1基因的克隆与原核表达

猪博卡病毒是近年来新发现的一种细小病毒.本研究根据其部分基因组序列(GenBank登录号GU902967-GU902971)设计了一对引物,采用PCR方法扩增出了猪博卡病毒的NP1基因,将其克隆到表达载体pET32a(+)中,构建了重组质粒pET32a-NP1,经测序鉴定正确后,将其转化感受态细胞BL21(DE3)中,...     

小麦ATG8的原核表达及其抗血清制备

提取小麦品种L10的总RNA,进行反转录,其产物用于探究自噬基因ATG8的生物学功能.用PCR方法克隆ATG8,将克隆的ATG8亚克隆至表达载体PMD19-T,酶切后切胶回收,然后把产物测序鉴定,转化宿主菌E.coli Rosetta-gami B(DE3),构建原核表达系统,将融合蛋白纯化后制备其兔抗血清,然后利用Western Blotting技术对兔抗血清进行检测,鉴定了该抗血清的结合特异性.ATG8抗体的成功制备,为小麦中ATG8基因和自噬功能的研究奠定了基础.     

猪传染性胃肠炎病毒S基因A抗原位点的克隆及原核表达载体的构建

【研究目的】对猪传染性胃肠炎病毒S基因A抗原位点进行克隆和原核表达载体的构建。【方法】参考GenBank上公布的TGEV S基因A抗原位点序列,应用Primer6.0设计一对含酶切位点的引物,用于RT-PCR扩增A抗原位点目的片段,将扩增产物连接于paesy-T克隆载体上构建克隆载体,用EcoR I和Xhol I对表达载体PET-32a（+）和重组质粒进行酶切,将酶切产物亚克隆至PET-32a（+）多克隆位点上,连接、转化至BL21(DE3),构建A位点的原核表达载体,并对阳性重组质粒进行酶切、PCR和测序鉴定。【结果】所扩增的目的片段的大小为534bp,与原核表达载体连接后,经核苷酸及推导的氨基酸序列分析表明,该基因与其它猪传染性胃肠炎病毒相应基因具有很高的同源性,说明成功地构建了TGEV S 基因A抗原位点的原核表达载体。【结论】TGEV S 基因A抗原位点原核表达载体的成功构建,填补了中国国内单独针对此位点进行研究的空白,也为TGEV诊断方法的建立提供良好的技术基础。     

杜仲Dirigent1基因的原核表达及蛋白纯化

植物Dirigent蛋白认为指导木脂素和木质素的生物合成,同时在生物防御应答,次生代谢调控和病原体抗性的过程中起到了重要的作用。本研究以实验室前期克隆得到杜仲Dirigent1基因(EuDIR1)为基础,利用基因重组技术构建pET-30a-EuDIR1原核表达载体。重组载体转化大肠杆菌BL21 (DE3)中,在15℃下0.1 mmol/L异丙基硫代β-D-半乳糖苷诱导6 h后,蛋白的沉积量达到最高值,表达模式主要为包涵体。对包涵体进行溶解,使用镍-亚氨基二乙酸亲和层析柱进行纯化。收集纯度较高的洗脱组分进行透析复性,并用15%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western Blot鉴定重组蛋白。结果表明,成功构建了pET-30a-EuDIR1原核表达载体,表达菌株诱导后在相对分子质量约18 kD处有1条特异性蛋白条带,包涵体纯化、复性后,经Western Blot鉴定,获得可溶性且纯度较高的重组蛋白。实验中得到的EuDIR1蛋白为体外生化实验提供了科学依据。     

FMDV OA/58病毒株VP1蛋白结构构建与B细胞抗原表位的预测

以口蹄疫病毒株OA/58 RNA为模板,反转录并扩增目的cDNA,然后与pGEM-T easy载体连接并转化JM109菌株,提取的重组质粒用凝胶电泳、PCR和EcoR Ⅰ酶切法鉴定.运用同源模建得到OA/58 VP1蛋白3D结构,并结合理化性质、亲水性、可塑性和免疫原性进行分析,预测OA/58 VP1的抗原表位.结果 OA/58 VP1存在多个潜在的抗原表位位点,可能的蛋白质抗原表位区域:2～11,15～35,38～50,77～88,90～107,121～125,131～135,140～149,154～163,169～175,178～189,197～213.应用同源模建得到的OA/58 VP1蛋白3D模型来预测其B细胞表位,为进一步研究OA/58 VP1功能,构建突变体和选择表达新型OA/58 VP1蛋白分子提供有参考价值的信息.     

番茄褪绿病毒CP基因克隆、序列分析及原核表达

为制备番茄褪绿病毒(Tomato chlorosis virus,To CV)抗血清,以番茄病叶为试验材料,提取总RNA,根据To CV CP基因设计特异性引物,利用RT-PCR方法克隆目的基因,构建原核表达载体p ET32a-To CVCP,在大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株中表达CP蛋白。结果表明:To CV CP基因(Gen Bank登录号:KT809400)全长774 bp,编码257个氨基酸,与Gen Bank中其他地区分离物核苷酸序列同源性为97.2%~99.6%,推导的氨基酸序列同源性为97.3%~100.0%。核苷酸序列保守位点占全部位点的91.3%,氨基酸序列保守位点占全部位点的88.3%,表明不同地理来源的番茄褪绿病毒的CP基因保守性较高。将To CV CP基因克隆到原核表达载体p ET-32a(+)上,并在体外条件下诱导表达出融合蛋白。SDS-PAGE分析表明,转p ET32a-To CVCP载体的大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株表达了分子量约33 k Da的重组蛋白。该重组蛋白在37℃,1.0 mmol/L IPTG、诱导6 h,表达量最大。     

棉花去泛素化酶基因GhOTUD5原核表达条件的优化

棉花组蛋白去泛素化酶GhOTUD5与生殖发育密切相关。为了获得大量可溶性表达的GhOTUD5蛋白,本试验对目的蛋白原核表达条件进行优化。采用分子克隆方法构建重组表达载体pET-22b-GhOTUD5,转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)和Transetta(DE3),用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导目的蛋白表达。在对影响原核表达的四个单因素(菌体密度OD600,诱导剂IPTG终浓度,诱导时间和诱导温度)分别分析的基础上,设计三水平的正交试验L9(43),摸索大量可溶性目的蛋白表达的最优条件。结果显示,目的蛋白GhOTUD5在Transetta(DE3)中成功表达,在BL21(DE3)中不表达。在菌体密度OD600为0.8、诱导温度为28℃、IPTG终浓度为0.7 mmol/L、诱导3 h的条件下可溶性目的蛋白表达量最高,达到13%左右。该研究结果为进一步研究GhOTUD5在棉花育性方面的功能提供了科学数据。     

草莓轻型黄边病毒CP基因的克隆、序列分析及原核表达

克隆草莓轻型黄边病毒CP基因,并构建其原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达CP蛋白。利用SMYEV的检测引物,通过RT-PCR技术筛选带SMYEV的草莓植株;根据NCBI中SMYEV序列设计扩增CP基因全长引物,通过RT-PCR获得SMYEV沈阳分离物CP基因全长序列;将CP基因克隆到原核表达pGEX-6P-1上,利用IPTG诱导CP基因在大肠杆菌BL21(DE3)中表达蛋白。利用RT-PCR扩增获得SMYEV分离物SY05的CP基因全长序列,由729个核苷酸组成,编码242个氨基酸残基。SY05与其他SMYEV分离物的核苷酸同源性为80.1%～97.4%,氨基酸同源性为92.1%～99.6%,其中,与SMYEV分离物SY03的氨基酸一致性为98.3%。将SY05的CP基因成功克隆到原核表达载体pGEX-6P-1上,构建了重组表达载体p6P-EV-CP,并将其导入大肠杆菌BL21(DE3)中。SDS-PAGE分析表明,IPTG诱导SMYEV分离物SY05的CP基因在大肠杆菌中表达出分子量为52.0 kDa的融合蛋白。克隆出SMYEV分离物SY05的CP基因,实现了其在原核细胞中的表达,为SMYEV抗血清的制备奠定了重要基础。     

青花菜BoPGIP1基因的原核表达及其重组大肠杆菌的抗逆性分析

为进一步验证青花菜Bo PGIPl基因的功能,通过RT-PCR方法克隆得到青花菜Bo PGIP1基因完整的编码区序列,将其克隆到原核表达载体p ET28a(+)上,转化大肠杆菌BL21(DE3),获得高效表达Bo PGIP1基因的重组大肠杆菌BL21(p ET28a-Bo PGIP1),重组菌经IPTG诱导表达以及SDS-PAGE电泳检测,结果表明,在37 k Da处有一条特异表达的蛋白质条带,与预期的目的产物大小一致;同时对重组大肠杆菌BL21(p ET28a-Bo PGIP1)的抗逆性进行分析,结果表明,BL21(p ET28a-Bo PGIP1)对Na Cl(0.4 mol/L)、Na HCO3(0.2 mol/L)和PEG6000(20%)的抗性明显高于对照菌株BL21(p ET28a),该抗性的证明为Bo PGIP1基因在植物抗逆基因工程中的应用提供了理论依据。     

杜仲EuGT2基因的原核表达及蛋白纯化

本研究以克隆所得杜仲(Eucommia ulmoides)EuGT2基因为基础,利用基因重组技术构建原核表达载体pMCSG19-EuGT2。重组载体转化到E.coli Rosetta(DE3)中,用0.05 mmol/L异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)在37℃下诱导6 h。使用镍-亚氨基二乙酸(Ni-IDA)亲和层析柱进行纯化,并用15%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳进行检测。研究结果表明,杜仲EuGT2基因在E.coli Rosetta(DE3)中得到成功表达,重组蛋白表达形式为部分包涵体、部分可溶性蛋白。经SDS-PAGE凝胶电泳检测,在相对分子质量约56 kD处有1条特异性蛋白条带,经质谱鉴定该特异性蛋白条带确为杜仲EuGT2蛋白。以上研究结果为后续研究杜仲糖基转移酶的功能提供了科学依据。     

O型口蹄疫病毒VP1蛋白的原核表达及功能鉴定

为获得具有免疫原性的FMDV VP1蛋白,以O型FMDV重组质粒PMD18T-VP1为模板,利用PCR技术扩增得到O型FMDV VP1基因片段,将此基因片段与原核表达载体pET32a连接,构建重组表达载体,命名为pET-VP1,经PCR和测序鉴定后,用IPTG诱导表达,收集诱导的菌液进行SDS-PAGE电泳和Western-Blot分析.结果显示,在分子量约为45 ku处有1条明显的蛋白条带,且能被口蹄疫阳性血清识别,表达产物通过包涵体纯化后用透析法复性;ELISA检测结果显示,所复性的蛋白具有较高的活性.结果表明,FMDV VP1蛋白在大肠杆菌中得到高效表达,为开发诊断制剂和疫苗的研制打下基础.     

藏猪IGF-1成熟肽基因的克隆及原核表达

旨在克隆藏猪胰岛素样生长因子1(IGF-1)的成熟肽基因,并进行原核表达的研究。提取藏猪肝脏组织RNA,通过RT-PCR扩增出藏猪IGF-1全长基因,构建重组质粒p MD19-T-IGF-1,以p MD19-T-IGF-1质粒为模板,克隆IGF-1成熟肽序列并构建成熟肽p ET-32α-IGF-1表达质粒,转入大肠杆菌BL21(DE3),对IPTG诱导剂浓度和诱导时间进行优化,Ni-NTA琼脂纯化融合蛋白后采用Western Blot对其鉴定。结果显示,IGF-1成熟肽基因(315 bp),成功构建了成熟肽p ET-32α-IGF-1原核表达质粒;重组大肠杆菌BL21-IGF-1以包涵体形式表达出分子量约31 k Da融合蛋白,最优IPTG浓度为0.5 mmol/L,最佳IPTG诱导时间为10 h;纯化获得了高纯度的融合蛋白,经鉴定IPTG诱导表达和纯化的蛋白为IGF-1融合蛋白。结果表明,成功构建了表达质粒p ET32α-IGF-1及获得重组大肠杆菌BL21-IGF-1,表达了藏猪IGF-1成熟肽融合蛋白及该蛋白具有抗原抗体反应活性。