内蒙古绒山羊MTNRla基因外显子2克隆及序列分析

依据已发表的绵羊MTNRla基因外显子2扩增引物序列,以内蒙古绒山羊基因组DNA为模板进行PCR扩增,得到824bp的基因序列,将扩增产物进行克隆测序后与GenBank数据库进行序列同源性比较分析,结果表明,绒山羊MTNRla外显子2扩增序列与已发表的山羊同源性为99.2%,与绵羊、牛、人、鼠同源性分别为98.5%、96.8%、82.O%和78.4%,内蒙古绒山羊MNTRla基因第2外显子氨基酸序列与已发表的山羊氨基酸序列的同源性为97.7%,与已发表的绵羊、牛、人和鼠的氨基酸同源性分别为94.1%、91.8%、82.2%、83.1%.     

山羊FSHR基因5''''端侧翼序列的克隆与分析

为找寻山羊FSH受体基因的SNP突变位点,进行FSH受体基因的多态性分析和探索该受体基因在山羊多胎中的可能作用,利用比较基因组学的方法,根据绵羊FSH受体基因序列设计引物,以湖南湘东黑山羊基因组为模板,PCR扩增了FSH受体基因5' 端侧翼调控区,通过克隆进行了序列测定及分析,并与牛、绵羊该区段序列进行了比较.结果表明,PCR扩增获得的片段为844 bp,与中国西门塔尔牛该段序列相比,同源性为94.08%,在-364 bp处的左翼发生了多碱基插入,湘东黑山羊该序列有5个碱基的插入,另在-625~-619 bp处的7个碱基缺失;与澳洲绵羊的FSHR基因比较,同源性为93.60%,在-367 bp处的左翼,湘东黑山羊该段序列有2个碱基的插入,在-630,-145,-97 bp 处各有1个碱基缺失.     

山羊FSHR基因5′端侧翼序列的克隆与分析

为找寻山羊FSH受体基因的SNP突变位点,进行FSH受体基因的多态性分析和探索该受体基因在山羊多胎中的可能作用,利用比较基因组学的方法,根据绵羊FSH受体基因序列设计引物,以湖南湘东黑山羊基因组为模板,PCR扩增了FSH受体基因5′端侧翼调控区,通过克隆进行了序列测定及分析,并与牛、绵羊该区段序列进行了比较.结果表明,PCR扩增获得的片段为844 bp,与中国西门塔尔牛该段序列相比,同源性为94.08%,在-364 bp处的左翼发生了多碱基插入,湘东黑山羊该序列有5个碱基的插入,另在-625～-619 bp处的7个碱基缺失;与澳洲绵羊的FSHR基因比较,同源性为93.60%,在-367 bp处的左翼,湘东黑山羊该段序列有2个碱基的插入,在-630,-145,-97 bp 处各有1个碱基缺失.     

湘东黑山羊GDF9B基因的克隆与测序分析

提取湘东黑山羊基因组DNA,根据绵羊基因组序列设计4对引物扩增湘东黑山羊GDF9B基因,并进行克隆测序分析,结果表明:克隆的山羊GDF9B基因包含外显子1～2序列和部分内含子,序列登录号分别为AY968810、AY947812.将湘东黑山羊GDF9B基因外显子1的序列与绵羊同区域同源性为99.1%;外显子2的序列与绵羊同区域同源性为98.2%.     

藏绵羊生长激素(GH)基因的克隆及序列分析

【目的】对藏绵羊生长激素(GH)基因进行了克隆和序列分析,以期为进一步开展藏绵羊GH基因与其生长发育性状的相关分析以及基因定位、表达调控等研究提供理论基础。【方法】用特定引物对藏绵羊GH基因进行PCR扩增、克隆和测序,使用DNAMAN4.0、BioEdit 7.0.0、DnaSP 4.10.1等生物信息学软件进行序列分析和比较基因组学研究。【结果】藏绵羊GH基因(GenBank登录号EF077162)由5个外显子和4个内含子组成,完整编码序列(Complete coding sequence,CDS)全长为654 bp。5个外显子大小分别为13,161,117,162和201 bp;4个内含子大小分别为246,227,229和275 bp;内含子与外显子的连接区序列遵循基因组成规则。信号肽由26个氨基酸组成,成熟肽由191个氨基酸组成。藏绵羊与已报道的其他绵羊GH基因编码区核苷酸序列及推导的氨基酸序列同源性均为99.0%~100%;而与山羊、普通牛、瘤牛、大额牛、牦牛、水牛各物种在GH基因编码区核苷酸序列上同源性分别为98.4%,98.0%,97.7%,97.5%,97.5%,98.1%;相应的氨基酸序列间同源性分别为100%,99.0%,99.0%,98.1%,98.6%,98.1%。【结论】成功地克隆了藏绵羊GH基因;牛科物种内,藏绵羊与已报道的其他绵羊以及与山羊、普通牛、瘤牛、大额牛、牦牛、水牛等物种在GH基因编码区核苷酸序列和推导的氨基酸序列上均具有较高的保守性。     

内蒙古绒山羊MTNR1α盛因外显子2克隆及序列分析

依据已发表的绵羊MTNR1α基因外显予2扩增引物序列。以内蒙古绒山羊基因组DNA为模板进行PCR扩增,得到824bp的基因序列,将扩增产物进行克隆测序后与GenBank数据库进行序列同源性比较分析。结果表明,绒山羊MTNR1α外显子2扩增序列与已发表的山羊同源性为99．2％,与绵羊、牛、人、鼠同源性分别为98．5％、96．8％、82．O％和78．4％,内蒙古绒山羊MNTR1α基因第2外显子氨基酸序列与已发表的山羊氨基酸序列的同源性为97．7％,与已发表的绵羊、牛、人和鼠的氨基酸同源性分别为94．1％、91．8％、82．2％、83．1％。     

山羊FSHR基因5’端侧翼序列的克隆与分析

为找寻山羊FSH受体基因的SNP突变位点，进行FSH受体基因的多态性分析和探索该受体基因在山羊多胎中的可能作用，利用比较基因组学的方法，根据绵羊FSH受体基因序列设计引物，以湖南湘东黑山羊基因组为模板，PCR扩增了FSH受体基因5’端侧翼调控区，通过克隆进行了序列测定及分析，并与牛、绵羊该区段序列进行了比较，结果表明，PCR扩增获得的片段为844bp，与中国西门塔尔牛该段序列相比，同源性为94．08％，在-364bp处的左翼发生了多碱基插入，湘东黑山羊该序列有5个碱基的插入，另在-625-619bp处的7个碱基缺失；与澳洲绵羊的FSHR基因比较，同源性为93．60％，在-367bp处的左翼，湘东黑山羊该段序列有2个碱基的插入，在-630，-145，-97bp处各有1个碱基缺失。     

绵羊Leptin基因的进化分析

[目的]为绵羊与其他动物的分子系统进化分析奠定基础。[方法]对绵羊Leptin基因的第23、外显子进行PCR扩增和测序,将测序结果与GenBank中绵羊和7个其他物种中相应序列进行比对,并构建绵羊与其他物种的分子系统进化树。[结果]不同物种的Leptin基因的核苷酸序列有较高的保守性。绵羊与山羊、水牛、奶牛、猪、人、家鼠、鸡的同源性分别为99.5%、98.0%、97.3%、93.4%、88.4%、83.9%、82.4%。系统发生树将这些物种总体上分成2支,家鼠与鸡聚为一支;而绵羊与山羊、水牛、猪和人为另一支。绵羊与山羊亲缘关系最近,而与水牛、奶牛、猪、人、家鼠、鸡亲缘关系渐远。[结论]Leptin基因适于进行物种起源、演化、分类以及系统发生关系的研究。     

绒山羊Y染色体Amelogenin基因BAC筛选与鉴定

Amelogenin基因是控制牙釉蛋白的表达基因.它不仅在动物牙齿发育过程中起重要的调控作用,而且可用于动物性别鉴定.为了获得绒山羊Amelogenin基因全序列、研究绒山羊牙齿的进化过程、实施牙齿保护,本研究根据GenBank收录的绵羊Y染色体基因Amelogenin-intron4序列设计引物,以绒山羊基因组DNA为模板,通过PCR技术,进行绒山羊BAC文库Amelogenin筛选与克隆.测序后得到259bp的目的序列.此片段与其他物种进行核苷酸序列比对,结果显示,与绵羊、牛同源性分别达98％和96％,而与人、黑猩猩、老鼠无同源性.属于GT-AG型内含子,具有增强Amelogenin基因转录的作用,并且通过实验筛选出该片段所在的BAC为山羊Y染色体的BAC.     

牦牛α1-珠蛋白基因的克隆和序列分析

根据α-珠蛋白基因起始密码子上游及终止密码子下游的保守序列设计引物，以牦牛基因组DNA为模板克隆并测定了α-珠蛋白基因序列。结果表明，所测的氨基酸序列与牦牛α-珠蛋白链的氨基酸序列完全相同，即为牦牛α1-珠蛋白基因，长706bp，编码141个氨基酸。通过与其他物种的同源性比较，发现牦牛α1-珠蛋白基因的核苷酸序列与黄牛和水牛的同源性分别为99．71％和98．58％，与山羊、绵羊、人和马的同源性只有96．0：3％、95．57％、68．55％和51．13％；氨基酸序列与黄牛和水牛的同源性分别为99．29％和96．45％，与山羊、绵羊、人和马的同源性只有92．90％、91．49％、87．23％和87．23％，说明牛亚科α-珠蛋白基因在进化上高度保守。同时发现第254位的碱基A为牦牛α1-珠蛋白基因所特有。牦牛的两个α1-珠蛋白基因长度相等，都为706bp，且间距为2．47kb，距离比山羊的远。     

绵羊Nanog基因部分编码序列的克隆及分析

利用NCBI中GenBank里查询到已登录的人、猪、牛和山羊的NanogmRNA序列,通过多重同源比较,获得高度保守区域序列,设计了同源引物,并首次对绵羊Nanog部分编码序列进行了分子克隆。经过PCR扩增,获得绵羊Nanog基因第二外显子168 bp(GenBank Accession:EF436277)、第四外显子124 bp(GenBank Acces-sion:EF596905)和第二外显子至第四外显子498 bp(GenBank Accession:EU016097)三个序列片段。经测序,三个序列已登录GenBank。绵羊Nanog第二显子168 bp与山羊相应序列相似性最高达97%,与人相应序列相似性最低达84%;绵羊Nanog第四显子124 bp与山羊相应序列相似性最高达100%,与人相应氨基酸序列相似性最低达73%;经判断,绵羊Nanog第二外显子至第四外显子498 bp序列片段应该是一段假基因序列,与山羊mRNA相应序列相似性最高达98%,与人mRNA相应序列相似性最低达83%。本研究为进一步研究绵羊Nanog基因表达谱提供了序列信息。     

山羊胰岛素样生长因子Ⅰ基因多态性及序列分析

采用PCR-SSCP技术检测胰岛素样生长因子Ⅰ(insulin like growth factorⅠ,IGF-Ⅰ)基因外显子在性早熟、高繁殖力品种(济宁青山羊)和性晚熟、中等繁殖力(波尔山羊)以及性晚熟、低繁殖力品种(安哥拉山羊和内蒙古绒山羊)中的单核苷酸多态性,分析该基因对济宁青山羊性早熟和高繁殖力的影响;并对济宁青山羊IGF-Ⅰ基因扩增片段进行克隆测序,拼接出山羊IGF-Ⅰ基因4个外显子序列,将济宁青山羊IGF-Ⅰ基因外显子核苷酸序列和推导的氨基酸序列与绵羊、牛、人、大鼠、小鼠和鸡6个物种的序列进行比较。结果表明,IGF-Ⅰ基因4个外显子在所检测的4个山羊品种中均不存在多态性;这7个物种的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为79.6%~99.3%和77.8%~99.4%;与牛、人等6物种相比,济宁青山羊IGF-Ⅰ基因氨基酸序列不存在特有变化。可见,物种间IGF-Ⅰ基因保守性强,IGF-Ⅰ基因可能不是影响济宁青山羊性早熟和高繁殖力的主效基因。     

山羊SDHD基因cDNA编码序列的克隆与分析

利用NCBI中GenBank里查询到已登录的人、猪、牛和绵羊的SDHD mRNA序列,通过多重同源比较,从而获得高度保守区域序列,设计了同源引物,并首次对山羊SDHD编码序列进行了分子克隆。经过PCR扩增和测序,获得山羊SDHD基因共4段cDNA序列,分别为:451 bp4、20 bp5、29 bp和698 bp。所获得的四段序列测序结果经La-sergene7.0软件SeqMan拼接后,获得一条1238 bp长的cDNA序列。在GenBank数据库中进行BLAST/nr比对,发现其与绵羊、牛、猪和人相应序列相似性分别达98%、97%、85%和81%。用NCBI的ORF Finder软件对已经克隆的山羊SDHD基因cDNA进行开放阅读框分析,发现该序列包含一个480 bp的开放阅读框,编码159个氨基酸残基,计算机分析表明(Compute pI/Mw tool),该蛋白的分子量约为17 224.11 Da,等电点为8.92。通过DNAMAN软件分析发现,山羊SDHD蛋白保守性很高,其与绵羊、牛、猪和人SDHD蛋白在氨基酸序列上的相似性分别达到97%、96%、87%和85%。此山羊SDHD基因cDNA序列和SDHD蛋白质序列已于2010年1月31日登录在NCBI的GenBank上,登录号为GU338978和ADB92501。本项研究为进一步研究山羊的SDHD基因作为山羊肉品质性状候选基因,提供了相应的序列信息。     

巴什拜羊微卫星标记多态性及其与生长指标关联性分析

【目的】以巴什拜羊为研究材料,通过分析微卫星DNA座位的基因型,并与生长性状进行相关分析,以寻找影响巴什拜羊生长性状的微卫星标记,为分子标记辅助选择提供依据。【方法】从GenBank数据库查询绵羊、山羊的微卫星座位,根据微卫星选择标准选择符合要求的10个微卫星标记,对巴什拜羊189个个体基因组DNA进行检测,采用最小二乘方法分析微卫星座位与生长指标的关联效应。【结果】10个微卫星标记共检测到110个等位基因,平均每个座位等位基因数为11个,平均多态信息含量为0.7914,平均杂合度为0.8149;10个微卫星座位中有8个微卫星座位与巴什拜羊体重、体尺等5项生长指标有显著和极显著的关联性,特别是基因座BM415与体重、体尺指标均呈极显著相关(P0.01),多重比较结果显示8个微卫星座位都存在优势基因型。【结论】发现了巴什拜羊群体生长指标具有显著效应,多态性较高的微卫星基因座,为开展巴什拜羊生长指标的分子标记辅助育种提供了有价值的遗传标记。     

伏牛白山羊6个微卫星标记的遗传多样性分析

选取位于绵羊第6号染色体上与牛多胎基因FecB紧密连锁的2个微卫星基因座OarAE1 01、BM1329,牛第3号染色体上的微卫星基因座BMS1248,绵羊第4号染色体上的2个微卫星基因座MAF70、OarHH35及牛第8号染色体上的微卫星基因座BM1227,对伏牛白山羊遗传多样性进行检测。结果表明,6个微卫星基因座在伏牛白山羊中共检测到50个等位基因,其中平均多态信息含量(PIC)为0.789,且每个微卫星基因座的PIC>0.5,平均有效等位基因数(Ne)、平均杂合度(H)分别为5.165、0.903。由此表明,6个微卫星标记均具有高度多态性,可用于伏牛白山羊遗传多样性的分析。     

猪MSTN基因生物信息学分析

[目的]对猪MSTN基因进行生物信息学分析。[方法]以从GenBank中检索到的猪、大鼠、小鼠、狗、绵羊、山羊、牛、黑猩猩、人、马、鸡和斑马鱼的MSTN基因CDS序列为材料,将该12个物种的MSTN蛋白序列调入DNAStar软件的Megalign程序,进行系统进化分析;并对猪MSTN基因的基本信息、内切酶图谱、编码蛋白二级结构、信号肽、跨膜结构以及蛋白质亚细胞定位进行分析。[结果]猪MSTN基因与大鼠、小鼠、狗、绵羊、山羊、牛、黑猩猩、人、马亲缘关系很近;该基因包含多个酶切位点;其编码的蛋白是一个疏水性不稳定蛋白,分子量为42 791.3 u,等电点为6.98,包含375个氨基酸残基;蛋白二级结构上,含有20.53%的α-螺旋(Helix)、4%β-转角(Turn)、53.07%无规则卷曲(Coil)、22.4%伸展条(extenden strand)和1个跨膜结构区域;该蛋白定位于细胞外,作为信号肽的可能性很大。[结论]该研究为猪MSTN基因的进一步分析研究提供了参考依据。     

猪MSTN基因生物信息学分析(英文)

[目的]对猪MSTN基因其进行生物信息学分析。[方法]以从GenBank中检索到的猪、大鼠、小鼠、狗、绵羊、山羊、牛、黑猩猩、人、马、鸡和斑马鱼的MSTN基因CDS序列为材料,将该12个物种的MSTN蛋白序列调入DNAStar软件的Megalign程序,进行系统进化分析;并对猪MSTN基因的基本信息、内切酶图谱、编码蛋白二级结构、信号肽、跨膜结构以及蛋白质亚细胞定位进行分析。[结果]猪MSTN基因与大鼠、小鼠、狗、绵羊、山羊、牛、黑猩猩、人、马亲缘关系很近;该基因包含多个酶切位点;其编码的蛋白是一个疏水性不稳定蛋白,分子量为42791.3u,等电点为6.98,包含375个氨基酸残基;蛋白二级结构上,含有20.53%的α-螺旋(Helix)、4%β-转角(Turn)、53.07%无规则卷曲(Coil)、22.4%伸展条(extendenstrand)和1个跨膜结构区域;该蛋白定位于细胞外,作为信号肽的可能性很大。[结论]该研究为猪MSTN基因的进一步分析研究提供了参考依据。     

山羊IGFBP-2基因的克隆、序列分析及其组织表达

【目的】克隆获得南江黄羊IGFBP-2（Insulin-like growth factor binding protein -2）基因的CDS区全序列,对其进行生物信息学分析,并分析IGFBP-2的mRNA和蛋白组织表达特征,为深入研究该基因在出生后山羊生长和发育过程中的作用以及表达调控提供基础资料。【方法】下载NCBI的GenBank数据库中公布的绵羊（Ovis aries,NM_001009436）和牛（Bos taurus,NM_174555）的IGFBP-2基因的mRNA序列,经序列比对后采用保守区域序列并利用Primer Premier 6.0软件设计克隆引物,经PCR扩增后采用TA克隆技术获取含有阳性克隆子的菌液,送公司测序得到山羊IGFBP-2基因的完整编码区序列,并利用EditSeq、DNAMAN 6.0、MEGA 6.0和ExPASy在线平台等软件对CDS区序列和其编码的氨基酸序列进行生物信息学分析;获得山羊IGFBP-2基因CDS区序列后,利用该序列设计实时荧光定量PCR（Q-PCR）引物,采用Q-PCR和蛋白质免疫印迹杂交（Western blotting）方法检测了IGFBP-2的mRNA和蛋白在出生后南江黄羊不同组织（心脏、肝脏、肺、背最长肌、半膜肌和臂三头肌）和不同发育阶段（3、30、60、90和120 d）的表达情况。【结果】①克隆得到954bp的南江黄羊IGFBP-2基因的CDS区全序列,碱基组成为GC含量69.39%,AT含量30.61%,共编码317个氨基酸残基,预测的山羊IGFBP-2蛋白分子量大小为33.8808 kD,等电点为7.82,二级结构由无规卷曲（68.14%）、α-螺旋（18.30%）和延伸链（13.56%）三种形式组成;蛋白结构域分析发现,IGFBP-2蛋白序列包含保守的IB（IGFBP homologues）和TY（Thyroglobulin type Ι repeats）结构域,IB结构域位于第37-125位氨基酸处,TY结构域位于第250-302位氨基酸处;②磷酸化位点预测发现,IGFBP-2蛋白中存在Ser（5）和Thr（7）共12个磷酸化位点;糖基化位点预测发现,IGFBP-2蛋白序列中存在10个N-糖基化位点和2个O-糖基化位点;③CDS区序列相似性比较发现,山羊IGFBP-2与绵羊、牛、猪、人和小鼠的相似性分别达到98.99%、97.73%、87.12%、78.33%和76.26%;氨基酸序列相似性比较发现,山羊IGFBP-2与绵羊、牛、猪、人和小鼠的相似性分别达到99.24%、98.10%、87.07%、70.27%和73.00%;④系统进化树分析发现,山羊IGFBP-2与绵羊和牛的亲缘关系最近;⑤组织表达分析表明,IGFBP-2在肝脏中的mRNA和蛋白的相对表达量均最高(P<0.01),背最长肌次之;在不同发育阶段的肝脏组织中,IGFBP-2 mRNA和蛋白相对表达量均呈现一直上升的趋势;在不同发育阶段的背最长肌组织中,IGFBP-2的mRNA表达水平呈现一种“上升-下降-上升”的波动平衡。【结论】获得了山羊IGFBP-2基因完整的编码区序列和组织表达特征,生物信息学分析发现IGFBP-2基因的编码区序列具有物种间的保守性,肝脏是山羊IGFBP-2 的mRNA和蛋白表达的主要组织,同时在山羊不同发育阶段的肝脏和背最长肌组织中,IGFBP-2基因的mRNA和蛋白表达丰度呈现一定的规律性,表明IGFBP-2基因可能在出生后山羊的早期生长发育过程中发挥着重要的作用。     

7个绵羊微卫星DNA标记在绵(山)羊群体中的多态性检测

选择分别位于绵羊2,4,6,9,17和19号染色体上的7个微卫星标记OarFCB11,OarFCB128,MAF70,OarAE101,MAF33,OarFCB48和OarFCB304,对湖羊、同羊及长江三角洲白山羊的典型群随机样本相应位点进行了PCR检测。结果表明,每个微卫星座位发现7个以上等位基因,且均存在多态;湖羊、同羊、长江三角洲白山羊群体杂合度(H)分别为0.9092,0.9177和0.8867,相应的群体基因平均多态信息含量(PIC)分别为0.9024,0.9116和0.8774,有效等位基因数(Ne)分别为11.7723,12.4538和11.6104,均以同羊为最高;以产生有效条带为标志,随机样本的PCR扩增效率存在明显的群体间和座位间差异,以长江三角洲白山羊和OarFCB128座位为最高;以7个座位微卫星等位基因频率推算群体间标准遗传距离,山羊与绵羊群体间遗传距离远大于绵羊群体之间,湖羊、同羊间亲缘距离系数R为0.1998。研究结果提示:选择的7个微卫星DNA座位均为多态座位;以7个微卫星标记为测度,湖羊、同羊及长江三角洲白山羊具有丰富的遗传多态性;7个微卫星标记可进一步用于绵山羊近缘种间遗传分析研究。