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根癌农杆菌感受态细胞的制备及保存方法研究 总被引:1,自引:0,他引:1
研究不同培养基、转化溶液、保存方法对根癌农杆菌感受态细胞转化率的影响,确定高转化率根癌农杆菌感受态细胞的制备及保存方法。结果表明,使用YEB培养基,单菌落接种培养过夜后以1∶100的比例扩大培养10.5 h,用20 mmol/L CaCl2+80 mmol/L MgCl2溶液处理,所制备新鲜感受态细胞的转化率为1.59×10^5转化子/μg质粒DNA。浓度为7%的DMSO对新鲜感受态细胞保存效果较好。 相似文献
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通过对EHA105菌株48h不间断培养观察,绘制出其生长曲线图;同时用不同浓度的CaCl2溶液分别制备根癌农杆菌EHA105的感受态细胞,在转化过程中用不同的温度进行热激处理,统计分析阳性转化子个数,明确了采用冻融法将外源DNA导入农杆菌EHA105时的几个影响因素的参数。结果表明,当0D。值在1.0—1.5之间时,根癌农杆菌EHA105正处在对数生长期,活力最强;制备感受态细胞时,CaCl2溶液的浓度在6~10mmol·L-1之间,无显著差异,但以10mmol·L-1效果最佳,转化率达5.322×10^6·μg-1热激处理温度在20~37℃之间均无显著差异,但37℃处理时转化率最高,达5.550×10^6·μg-1。 相似文献
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农杆菌介导小麦遗传转化的影响因素 总被引:1,自引:0,他引:1
[目的]对农杆菌菌株、小麦品种、培养基状态及报告基因选择等进行优化筛选,为进一步完善农杆菌介导小麦遗传转化方法提供参考。[方法]用携带质粒pCAMBIA1304的农杆菌菌株LBA4404、EHA105,对温麦19、郑离03和郑离06小麦的幼胚愈伤组织进行遗传转化,从农杆菌菌株、小麦品种、共培养基状态及报告基因选择等方面进行探讨。[结果]农杆菌菌株EHA105转化效率较高,最高达到22.58%;姊妹系郑离03与郑离06的转化率差别极大,郑离06转化率最高而郑离03最低;农杆菌与愈伤组织共培养时,使用MS半固体培养基的转化率高于MS固体培养基;GFP和GUS都可以用作判断转化率的报告基因,GFP优势更明显。[结论]高毒性农杆菌菌株EHA105转化效率明显高于菌株LBA4404;小麦基因型是影响转化效率的重要因素之一;农杆菌与愈伤组织共培养时使用半固体培养基可提高转化率;通过GFP瞬时表达,可有效进行小麦转化效率的研究。 相似文献
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利用改进的冻融法和电击法成功地将带有编码DREB转录因子GmDREB基因的prdGm-200双元载体分别导入根癌农杆菌EHA101、EHA105和LBA4404菌株中,同时探讨了影响冻融法和电击法转化效率的因素。结果表明:农杆菌细胞OD600约为0.6时冻融法和电击法的转化效率均较高。在利用冻融法转化农杆菌时,新制备的感受态细胞有利于提高转化效率。在进行电击法转化农杆菌时,电场强度和脉冲时间都对农杆菌的转化效率有影响。 相似文献
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质粒导入不同种农杆菌冻融法的探讨 总被引:4,自引:0,他引:4
利用冻融法,使用不同的CaCl2浓度对不同细胞生长状态的农杆菌进行重组质粒导入的研究,以确定最适的导入条件.结果表明,菌体OD600值和不同的CaCl2浓度对转化有不同程度的影响.在OD600值为0.4时,液氮条件下用浓度为50mmol·L-1的CaCl2溶液对菌体进行处理得到的转化率最高.实验得到转化子,并通过菌落PCR技术鉴定. 相似文献
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韧皮部特异性启动子的克隆及含绿色荧光蛋白报告基因新植物表达载体的构建 总被引:2,自引:0,他引:2
用PCR方法扩增得到了长度为966bp的笋瓜韧皮部蛋白2基因启动子片段,克隆人pUCm—T载体后,获得了新的重组质粒pUCm—PSP.分别用限制性内切酶酶切重组质粒和pCAMBIA1302植物表达载体,经回收、连接、转化和鉴定后,构建了由PSP驱动绿色荧光蛋白(GFP)报告基因的新型植物表达载体pHZ03.利用细胞感受态法将新植物表达载体分别导入根癌农杆菌EHA105、GV3101、LBA4404和发根农杆菌Ri15834中. 相似文献
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[目的]建立重复性好的感受态细胞的快速制备方法和质粒转化方法。[方法]采用改进的氯化钙法制备感受态细胞后,将带有目标片段的质粒转入感受态细胞,使工程菌DH5α转化成具有抗氨苄青霉素的大肠杆菌,接种于添加氨苄青霉素的LB培养基上,并通过蓝白斑筛选和菌落PCR进行检测。[结果]制备的感受态细菌在不加Amp的LB平板上能较好生长,表明感受态细菌具有较强活性。感受态细菌在添加Amp的平板上不能生长,表明感受态细菌未被杂菌污染。转化后获得白色菌落1 410个,转化率为1.41×105cfu/μg。菌落PCR表明获得的白色菌斑为带有目标片段的阳性菌斑。[结论]该方法十分简便,是一种适于实验室操作的高效感受态细胞的制备方法。 相似文献
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[目的]提高大肠杆菌感受态细胞的转化效率。[方法]根据普通实验室的试验条件,总结出1种少量制备大肠杆菌感受态细胞并高效率转化质粒的方法。[结果]利用该方法少量制备大肠杆菌感受态细胞,在OD600nm值为0.3~0.6时均可达到高转化率的效果。与常用的大量制备法相比,该方法的转化率提高100~300倍。[结论]该方法简单方便、重复性好、转化效率高、成本低,能够满足基因库的构建、分子克隆等研究的要求,是从事基因克隆研究方面的科研人员的良好选择。 相似文献
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质粒导人不同种农杆菌冻融法的探讨 总被引:1,自引:0,他引:1
利用冻融法,使用不同的CaCl2浓度对不同细胞生长状态的农杆菌进行重组质粒导入的研究,以确定最适的导入条件。结果表明,菌体OD600值和不同的CaCl2浓度对转化有不同程度的影响。在OD600值为0.4时,液氮条件下用浓度为50mmol·L^-1的CaCl2溶液对菌体进行处理得到的转化率最高。实验得到转化子,并通过菌落PCR技术鉴定。 相似文献
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以pBI121质粒为基本载体,分别构建了由35S启动子驱动的用于番茄HsfA3基因亚细胞定位(Subcellular location)和遗传转化的植物表达载体pBI-sl-A3、pBI-A3。将pBI121质粒上的35S启动子进行改造,分别构建了植物表达载体pBI-mini35S、pBI-HSE-mini35S,用于研究热激转录因子HsfA3与热激元件(Heat shockelements,HSEs)的互作。通过冻融法将以上4种重组质粒导入根癌农杆菌LBA4404中,用于后续试验,为进一步研究HsfA3基因在耐热中的功能和分子生物学机制奠定了基础。 相似文献
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以小麦绵阳19和洛阳8716幼胚愈伤组织为材料,利用gus基因的瞬时表达,探讨了农杆菌菌株和侵染条件对转化效率的影响。结果发现,对于农杆菌菌株EHA105,小麦绵阳19和洛阳8716幼胚愈伤组织侵染的最佳条件均为OD6000.8,侵染30min。对于农杆菌菌株LBA4404,绵阳19和洛阳8716幼胚愈伤组织侵染的最佳条件分别为OD6001.0,侵染30min和OD6000.8,侵染60min。利用建立的农杆菌转化体系对小麦高分子量麦谷蛋白亚基1Bx14基因进行了转化,经潮霉素抗性筛选、PCR和PCR-Southern杂交检测,平均转化率为0.61%。 相似文献