28株牛源分枝杆菌的耐药基因突变分析

为明确分离自宁夏、甘肃和新疆地区的28株牛源分枝杆菌的耐药基因突变情况,通过采用16S rRNA、MPT64和多位点PCR方法进行基因分型鉴定,L-J比例法对其进行药敏试验,随后用DNA测序技术对10株耐药菌和4株敏感菌进行耐药基因检测及突变分析。分型鉴定结果表明,28株分离株均属于结核分枝杆菌复合群(MTBC),其中26株为牛分枝杆菌,2株为人型结核分枝杆菌。药敏试验结果表明,28株MTBC中18株对4种一线抗结核药物敏感,10株耐药。耐药菌株中,1株对利福平耐药;7株对异烟肼、利福平和链霉素三重耐药;2株对异烟肼、利福平、链霉素和乙胺丁醇四重耐药。耐药基因突变位点分析结果表明,rpoB 378位点的突变率为10.0%;katG 463位点的突变率为100.0%;rrs 311位点的突变率为11.1%;embB 378位点的突变率为100.0%;oxyR-ahpC和rpsL位点无突变。提示宁夏、甘肃和新疆地区奶牛场中MTBC主要以牛分枝杆菌为主,且存在耐多药情况,耐药突变位点以katG 463和embB 378为主。     

多重PCR对禽分枝杆菌亚种鉴定的初步应用

为了建立禽分枝杆菌多重PCR方法，给禽分枝杆菌亚种鉴定及禽结核病的诊断提供参考。本实验根据国外报道的诊断方法设计4对特异性引物，选用我国禽结核参考菌株（CVCC 68201）基因组DNA为模板，优化了退火温度，测定了DNA最小检测量，并进行了特异性检验。采用优化好的多重PCR体系，对国家兽医微生物菌种保藏中心保存的禽分枝杆菌标准菌株进行检测和分类。实验结果表明，禽结核参考菌株（CVCC 68201）能很好的扩增出577 bp（IS901基因片段）、385 bp（IS1245基因片段）和140 bp（dnaJ基因片段）三条目的条带，基因组DNA的最小检测量为0.38 ng/μL，目的条带在退火温度50 ℃～62 ℃之间均能得到有效扩增。对23株禽分枝杆菌菌株检测，并设立牛分枝杆菌作为阴性对照，最终将禽分枝杆菌菌株分为三大类：禽亚种/森林土壤亚种、副结核亚种、人猪亚种，与国家兽医微生物菌种保藏中心的分类结果相比不仅一致且更加详尽而有临床意义。因此，基于分子生物学方法建立的多重PCR方法可以对禽分枝杆菌亚型进行快速鉴定并对禽结核病的诊断提供参考。     

分枝杆菌分型三重PCR检测方法的建立及应用

本研究旨在建立一种快速鉴定分枝杆菌的三重PCR方法,并比较分析其在临床检测中的可靠性。根据已发表的结核分枝杆菌、牛分枝杆菌和非洲分枝杆菌rv 3036c基因,结核分枝杆菌rv 1970f基因(RD7)和牛分枝杆菌pncA基因的序列,改造并设计合成了3对特异性扩增引物,建立了一种能对分枝杆菌样品进行初步鉴定的三重PCR方法。结果显示该方法可针对rv 3036c、rv 1970f和pncA基因分别扩增出大小为500、125和249 bp的目的片段,能特异性检测出结核分枝杆菌(500和125 bp两条带)和牛分枝杆菌(500和249 bp两条带),并可将结核分枝杆菌、牛分枝杆菌与其他分枝杆菌加以区分。本方法的检测灵敏度为50 pg/μL模板基因组DNA。对86株抗酸染色阳性菌进行三重PCR鉴定,鉴定结果与细菌16S rDNA和ITS序列测定结果一致,检测准确度为100%,优于生长特征和生化试验鉴定。     

甘草次酸联合抗结核药对结核杆菌活性研究

研究选取中药单体18β-甘草次酸联合一线抗结核药物异烟肼(INH)、利福平(RFP)和链霉素(SM),利用MABA法检测其体外单独及联合作用于牛源结核分枝杆菌的抗菌活性。18β-甘草次酸单独作用于结核分枝杆菌标准株(ATCC 27294)和牛分枝杆菌标准株（ATCC 19210）的最低抑菌浓度（MIC）分别为50和100 μg/mL。临床分离的2株敏感株和6株耐药株的MIC值分别为25～50和100～200 μg/mL。18β-甘草次酸联合INH、RFP和SM作用于6株耐药株均具有协同作用,且MIC值明显下降,INH的MIC值下降2～32倍（FICIs 0.125～0.375）,RFP的MIC值下降4～8倍（FICIs 0.240～0.490）,SM的MIC值下降4～16倍（FICIs 0.165～0.460）。中药单体药物对正常细胞BHK-21具有较低的细胞毒性,对肝癌细胞SMMC具有较好抑制作用。结果表明,18β-甘草次酸与抗结核药物INH、RFP和SM联合使用对结核分枝杆菌具有较好的抗菌药理活性。     

一种用于Red同源重组的正反筛选表达盒的构建及其反向筛选性能分析

为建立能够应用于大肠杆菌基因无痕敲除的方法,本研究分别从大肠杆菌TG1基因组和pKD13质粒中扩增出链霉素敏感基因(str~S,即rpsL基因)和卡那抗性基因(kan~R),采用重叠延伸PCR方法将str~S基因和kan~R基因拼接,并将拼接片段分别克隆于pMD18-T和pBAD33载体中,再以重组载体为模板,以带有flgK基因同源臂的引物扩增获得Placstr~S-kan~R打靶片段和Parastr~S-kan~R打靶片段,然后结合Red重组技术构建了相应的flgK基因敲除菌株placSK-ΔflgK/TOP10和paraSK-ΔflgK/TOP10,并通过链霉素最小抑菌浓度(MIC)试验检测两种筛选系统的反向筛选性能。结果显示,野生型TOP10菌株、placSK-ΔflgK/TOP10菌株和paraSK-ΔflgK/TOP10菌株的链霉素MIC值分别为8 000μg/mL、2 000μg/mL和500μg/mL。表明采用两种筛选系统构建的敲除菌株均有一定的链霉素敏感表型,具有反向筛选的能力,但含Para启动子的筛选系统反向筛选性能更好。本研究建立了可用于大肠杆菌Red重组技术的反向筛选系统,为获得更有效的Red重组筛选工具提供了依据。     

兔源益生菌Tu-115菌株鉴定及其产纤维素酶固体发酵条件优化

对胞外产纤维素酶且能有效抑制大肠杆菌的优良菌株Tu-115菌株进行菌体形态和菌落形态观察、生理生化特性测定及16S rDNA序列系统发育分析以确定其种属。以羧甲基纤维素(CMC)酶和滤纸酶活力大小为指标,通过单因素试验和正交试验来确定发酵培养基的最适发酵条件。Tu-115菌株鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens);当以麸皮为碳源,豆饼粉为氮源,碳氮比4:1,麸皮粒度大于20目,料水比1:1,接种量20%,初始pH值4.0,装瓶量4 g/250 ml,在35℃静置培养144 h时,CMC酶和滤纸酶活力分别可达73.35 IU/g和64.06 IU/g。确定了Tu-115菌株的种属,获得了该菌株产纤维素酶的最适固体发酵条件,为该菌株应用于纤维素酶生产奠定了基础。     

奶牛结核分枝杆菌rpoB和katG基因突变与多重耐药的相关性

本试验旨在研究奶牛结核分枝杆菌rpoB和katG基因突变与耐药性之间的关系。将临床分离的30株牛源结核分枝杆菌,利用噬菌体生物扩增法（phage amplified biologically assay,PhaB）检测其对利福平（RFP）和异烟肼（INH）的药物敏感性,采用聚合酶链式反应—DNA直接测序法（PCR-DS）扩增rpoB和katG基因并测序,分析rpoB和katG基因突变及其耐药相关性。15株表型耐药菌株中4株单耐RFP,PCR产物直接测序后发现3株在rpoB基因531位点发生突变,突变率为75.00%（3/4）;9株单耐INH菌株中7株发生突变,6株katG基因315位点基因突变,突变率为85.71%(6/7),1株发现463位点密码子基因突变,突变率为14.29%（1/7）;2株耐RFP的同时也对INH耐药,测序发现2株均在rpoB基因的531位点〖JP2〗和katG基因的315位点发生突变。所有菌株均未发现rpoB和katG基因的缺失。rpoB基因531位点和katG基因315位点的突变是RFP和INH产生耐药性的主要机制;检测牛源结核分枝杆菌RFP耐药性的同时可以初步筛选耐多药结核分枝杆菌。     

草地早熟禾根际胶质芽孢杆菌的分离及鉴定

从草地早熟禾(Poa pratensis)根际土壤中筛选到7株胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus),对其形态学和生理生化特性、耐盐性、耐酸碱性、温度敏感性等特性进行了测定。结果表明,这些菌株均为革兰氏阴性杆菌,产生圆形芽孢和丰厚的荚膜;过氧化氢酶、溶菌酶试验阳性,能水解淀粉,V.P反应、卵磷脂酶均为阴性,不产生吲哚。供试菌株在NaCl质量分数为1%~2%的硅酸盐培养基上能够生长;在25~30℃供试菌株均能良好生长。     

鸡毒支原体的分离鉴定和最低抑菌浓度测定

从山东、河北、北京和天津等不同地区分离、鉴定了4株鸡毒支原体，通过体外最低抑菌浓度测定发现泰妙菌素、泰乐菌素、百里霉索、罗红霉素、林可霉素／壮观霉素合剂、氧氟杀星、乳酸红霉素和盐酸林可霉素对该4个菌株的最低抑菌浓度(MIC)平均值分别是0．0062μg/ml、0．0171μg/ml、0．0682μg/ml、8．5248μg/ml、8．5248μg/ml、0．1024μg/ml、0．4550μg/ml和15．4944μg/ml，同时发现不同菌株之间的最低抑菌浓度有明显的差异。该试验结果表明鸡毒支原体容易对抗菌药物产生抗药性，目前临床预防或治疗鸡毒支原体感染可选用泰妙菌素、泰乐菌素、百里霉素和氧氟杀星等药物，而常规使用的红霉素和罗红霉素效果不佳。     

纤维素降解菌的筛选、鉴定与产酶条件优化试验

为了筛选高效降解纤维素菌株,试验以朽木及其下面土壤为样本,筛选获得28株具有纤维素降解能力的菌株,采用刚果红染色和酶活性测定筛选出一株纤维素降解菌(LD03),通过形态观察、生理生化以及16S rDNA序列测定,初步鉴定该菌株属于Rhizobacter属细菌,对该菌株培养条件和产酶条件进行了优化。结果表明:菌株LD03最适产酶条件,碳源为30 g/L淀粉、氮源为3 g/L牛肉膏、初始p H值为7、培养温度为37℃、装液量为50 mL、接种量为4%、培养时间为36 h,酶反应p H值为7,酶反应温度为60℃。     

嗜水气单胞菌 β-hemA 重组菌的优化培养及其生长曲线的测定

用正交试验探讨温度、培养基、时间三个因素对嗜水气单胞菌β-hemA重组菌E.coliDH5α(PCB)基因产物表达量的影响,通过优化培养,选择最佳培养条件,显著提高了β的溶血素基因(β-hemolysisgene,β-hemA)产物的产量。实验结果表明:该重组菌株在100mlTSB(添加0.05%酵母浸提物,1.8μg/mlZnCl2),37℃培养30h收获,其毒素蛋白含量为3258μg,毒素溶血价为17.44hu/μg,而在LB(100ml)和营养肉汤(100ml)中最高蛋白量和溶血活性分别为1260μg,14hu/μg和1199μg,8.22hu/μg。所选择的三个因子中对毒素蛋白质含量影响最大的是培养基,其次是温度;而对溶血素影响最大的则是温度,其次为时间。最佳生长曲线测定结果表明,在培养基预热至37℃的情况下,PCB6h能进入对数期。     

应用Alamar Blue法与试管法测定α-倒捻子素和8-甲氧基补骨脂素体外抗结核杆菌活性

选取传统中药提取单体化合物α-倒捻子素和8-甲氧基补骨脂素,通过2种药物敏感性实验方法MABA(Microdilution Alamar Blue Assay)分析与试管法分别测定了两种化合物对结核分枝杆菌H37Rv(ATCC27294)和H37Ra(ATCC25177)的体外抗菌活性,同时还测定了9种阳性抗结核药物对这两种结核菌的最低抑菌浓度(MIC),比较2种方法的检测结果。结果表明:α-倒捻子素对结核分枝杆菌H37Rv(ATCC27294)和H37Ra(ATCC25177)的最低抑菌浓度均为6.25μg/mL,而8-甲氧基补骨脂素对结核分枝杆菌H37Rv(ATCC27294)和H37Ra(ATCC25177)的最低抑菌浓度均为128μg/mL。Alamar B1ue法与试管法相比较,完全符合率是90%(9/11),具有较好的一致性。本研究结果表明Mamar B1ue法是一种快速、简便测定药物对结核分枝杆菌MIC的方法。本研究为α-倒捻子素和8-甲氧基补骨脂素的进一步开发利用和抗分枝杆菌机制研究打下了基础。     

西南高温高湿地区青贮中天然乳酸菌群落 结构特征及优质乳酸菌的筛选

为提高湿热地区青贮饲料的品质,本研究首先分析了从西南高温高湿地区青贮饲料中分离到的227株天然乳酸菌种群结构,再根据乳酸菌在高温条件下的生长活性和产酸能力筛选到4株优质乳酸菌(LP149、LS358、LR753和LPA761),并对菌株生理生化特性和生长、产酸曲线进行了测定。结果表明,天然植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)是高温高湿地区青贮料中最常见的乳酸菌菌株(占62.55%),其次是鼠李糖乳杆菌(L. rhamnosus)和副干酪乳杆菌(L. paracasei),分别占总乳酸菌的13.21%和9.25%。所筛选的4株菌株为革兰氏阳性和过氧化氢酶阴性的杆状菌,能够在pH 3.5和45℃的条件下生长。根据生理、生化特征和16S rRNA测序分析,LP149、LS358、LR753和LPA761分别被鉴定为植物乳杆菌、唾液乳杆菌(L. salivarius)、鼠李糖乳杆菌和副干酪乳杆菌。在37和45℃条件下的菌株生长和产酸曲线结果表明,筛选出的4株乳酸菌有良好的高温适应性(45℃),不仅生长速度快,产酸能力强,耐盐性较好,对糖源利用范围广,而且对酸性环境有较好的适应性,可以作为后续进行高温青贮回填试验的候选菌株。     

基于羧酸酯酶降解伏马毒素研究

初步探索了一种羧酸酯酶对伏马毒素B1(FB1)的降解规律。结果表明,该酶具有较强的pH值和温度适应性,最适反应pH值为8.0,最适反应温度为30℃。较低的酶浓度(1 U/l)下反应1 d,有36.91%的FB1残留;较高的酶浓度(100 U/l)下反应3 h,FB1能被完全转化成水解型伏马毒素B1(HFB1)。当FB1浓度低于50μg/ml时,降解速率随底物浓度的增加而增加,表现为一级反应;高于50μg/ml时,降解速率基本保持不变,表现为零级反应。最大降解速率Vmax为0.148μmol/(l·min),米氏常数Km为33.2μmol/l。该酶能够将玉米粉中的FB1降解,具有开发应用前景。     

芦丁对体外培养奶牛乳腺上皮细胞生长的影响

本实验旨在研究芦丁对奶牛乳腺上皮细胞生长的影响,实验将奶牛乳腺上皮细胞分成5组,每组细胞培养基中分别含有0、25、50、100、150μg/mL芦丁,细胞在37℃,5%CO2条件下培养48 h和96 h后测定相关指标。结果表明:细胞培养48 h,与0μg/mL芦丁组相比,100μg/mL芦丁组的细胞活性、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和过氧化氢酶(CAT)活性均显著提高,而丙二醛(MDA)含量和乳酸脱氢酶(LDH)活性均显著降低;细胞培养96 h,100μg/mL和150μg/mL芦丁组的细胞活性、GSH-Px和SOD活性均显著提高,而MDA含量和CAT、LDH活性均显著降低。与0μg/mL芦丁组相比,100μg/mL芦丁组细胞的Bcl-2表达显著升高,而Caspase3和P53表达均显著降低。综上,芦丁能够提高奶牛乳腺上皮细胞的抗氧化能力和抑制细胞凋亡,进而促进细胞的增殖,其中添加100μg/mL芦丁的效果最好。     

华南虎皮肤成纤维细胞的分离培养

应用酶消化法（胶原酶消化：0.1%胶原酶Ⅰ型＋0.1%BSA;胰蛋白酶消化：0.25%胰蛋白酶＋1mM EDTA）和植块法从华南虎皮肤组织中分离成纤维细胞。研究结果表明,植块法较适合分离华南虎皮肤成纤维细胞,胶原酶消化法次之,而胰蛋白酶消化法不宜用于分离华南虎皮肤成纤维细胞。DMEM/F12（1：1）培养基＋10%FCS＋10 ng/ml EGF＋5μg/ml胰岛素＋100 IU/ml青霉素＋100μg/ml链霉素组成的培养体系适用于华南虎皮肤成纤维细胞的体外培养。     

大豆异黄酮β-葡萄糖苷酶产生菌的选育及产酶条件研究

以豆豉为材料筛选产大豆异黄酮β-葡萄糖苷酶的菌株,并用京尼平甙法检测相对酶活。以相对酶活最高的野生菌为出发菌(经镜检为杆菌),通过UV和LiCl诱变育种,利用单因素和正交实验进行产酶条件研究确定最佳条件为:黄豆粉1%、酵母膏1%、麸皮2%、KH2PO40.1%、NaCl0.5%、起始pH值7.5、装液量30ml、发酵时间48h、发酵温度37℃、转速70r/min。在该条件下,用京尼平甙法测得该菌株的相对酶活为0.826,水杨苷法测得绝对酶活为5.49μg/ml。     

痰热清注射液联合阿米卡星对铜绿假单胞菌耐药菌株体外抗菌作用研究

为了研究痰热清注射液联合阿米卡星对铜绿假单胞菌耐药菌株的体外抗菌作用,试验采用微量稀释法分别测定痰热清注射液、阿米卡星以及两药联合对铜绿假单胞菌耐药菌株1号、耐药菌株2号的最低抑菌浓度(MIC);采用棋盘稀释法检测两药联合的体外抑菌作用,并计算部分抑菌浓度(FIC)指数,根据FIC指数判定药物联合的抗菌作用;建立体外生物膜模型,用银染法分别测定阿米卡星、痰热清注射液及两药联合对其成膜能力的影响。结果表明:对于耐药菌株1号,阿米卡星的MIC为6.25μg/mL,痰热清注射液的MIC为62.5μL/mL,联合用药时阿米卡星的MIC为1.56μg/mL,痰热清注射液的MIC为1.95μL/mL;对于耐药菌株2号,阿米卡星的MIC为12.5μg/mL,痰热清注射液的MIC为500μL/mL,联合用药时阿米卡星的MIC为0.39μg/mL,痰热清注射液的MIC为125μL/mL;对于两个耐药菌株,两药联合时的FIC指数均为0.28。两个耐药菌株的成膜能力强,高浓度的阿米卡星和痰热清注射液单独使用时均对其成膜能力有抑制作用,而低浓度阿米卡星反而有促进生物膜生长的作用(阿米卡星浓度≤3.125μg/mL促进耐药菌株1号生物膜生长,阿米卡星浓度≤6.25μg/mL促进耐药菌株2号生物膜生长),痰热清注射液与阿米卡星联合用药后对两个耐药菌株生物膜生长的抑制作用增强。说明痰热清注射液与阿米卡星联合对耐药菌株1号和耐药菌株2号的抑制具有协同作用。     

达氟沙星对猪胸膜肺炎放线杆菌的野生型临界值与药效学临界值的制订

为了制订达氟沙星对猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae, APP)的野生型临界值与在猪体内的药效学临界值,试验采用微量肉汤稀释法测定达氟沙星对115株APP的最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration, MIC),制订野生型临界值;选取5株MIC₉₀附近菌株进行毒力试验,测定达氟沙星对毒力最强的菌株的体外和半体内MIC及最小杀菌浓度(MBC),进行体外与间接体内杀菌试验;将18头猪随机分成健康组和患病组(按体重滴鼻接种APP 1×10⁹ cfu/kg),均按体重肌肉注射甲磺酸达氟沙星注射液2.5 mg/kg(以达氟沙星计),分别于给药后0.25,0.5,0.75,1,2,4,6,8,10,24,36小时时采集血液,采用高效液相色谱法测定血浆中的药物浓度;构建PK-PD模型,制订药效学临界值。结果表明：达氟沙星对APP的MIC分布范围为0.004～1μg/mL,制订的野生型临界值为0.5μg/mL;S3菌株的毒力最强;达氟沙星对S3菌株的体外和半体内MIC均为0....     

分枝杆菌药物最低抑菌浓度的快速测定方法研究

为了建立快速测定分枝杆菌药物最低抑菌浓度的方法,同时了解耐多药结核分枝杆菌(MDR-TB)和非结核分枝杆菌(MOTT)对常规抗结核分枝杆菌以外的其他抗生素的敏感性。采用一种快速变色液体培养基系统,以微量法进行测定。结果表明:MDR-TB对CLA、AZI、ROX、LEV、SPA、CIP、OFL、CAP、AMI、TH1314和PTA高度敏感的菌株分别88.89％、72.2％、72.2％、55.6％、50％、66.7％、70％、40％、40％、70％和50％,未见对DOX和MIN高度敏感的MDR-TB菌株;CLA、LEV和TH1314对MDR-TB的MIC几何平均值分别为0.5、1和1μg／mL,显示出较好的活性;不同的MDR-TB和MOTT对抗生素的敏感性有差异;这种新型变色液体培养基检测系统具有快速、操作简便等特点,对多种一线抗结核药物耐药的多MDR-TB对CLA、LEV、AZI、ROX、CAP和TH1314敏感,可供首先选择用于MDR-TB的治疗;不同的MOTT应根据MIC结果选择抗生素进行治疗。