大豆育种中利用花粉管通道法导入外源基因应注意的几点问题

花粉管通道技术因其方法简便、易操作,目前在大豆遗传转化中普遍应用,笔者根据自己实际操作中得出的经验,提出了在大豆中利用花粉管通道法导入外源基因应注意的几点问题,并对该法的发展前景提出了几点展望。     

大豆生物工程研究进展

90年代以来，大豆的生物工程研究重点放在建立遗传转化和再生体系上，随着遗传转化和再生技术的发展，我国已获得了抗病、抗虫转基因大豆植株，取得突破性进展。目前，大豆遗传转化主要采用农杆菌介导法、花粉管通法、基因枪及PEG法。农杆菌介导的遗传转化是以大豆子叶、胚轴为外植体，通过卡那霉素筛选，器官发生再生转化植株；花粉管介导法是以植株整体为受体导入外源原因，获得稳定遗传品系；基因枪介导的遗传转化是以大豆幼胚的胚轴、用基因枪轰击生长点，可以从任意一个基因型获得转基因植株；PEG介导的遗传转化是将质粒导入大豆原生质体，通过潮霉素进行筛选，获得转基因植株。     

大豆转基因研究进展

本文介绍了大豆转基因中常用的方法:农杆菌介导法、电击法、PEG转化法、基因枪法、花粉管通道法等转基因的技术方法的研究进展及其在大豆抗虫、抗病、抗除草剂等方面转化外源基因上的应用状况。     

导入外源DNA大豆后代的抗虫性鉴定与筛选

大豆食心虫（Leguwinivora glycinivorella)和大豆蚜虫（Aphid glycines)是东北大豆生产的主要虫害。为拓宽资源的利用，创造抗虫大豆种质，用花粉管通道技术向大豆品种吉20、吉25、吉27、吉30等导入皂角（Gleditisia japonica)、鹰嘴豆（Cicer arietinum)和农家早期品种DNA，对从后代中选出的变异系进行了多年抗虫性鉴定和筛选，得到了抗虫品系4个。本文报告了抗虫鉴定筛选结果。     

早熟大豆外源DNA导入的RAPD分子验证

利用花粉管通道技术直接导入外源总ＤＮＡ，从而进行农作物品种改良，在国内外许多作物上已得到了广泛的应用。但外源总ＤＮＡ是否能够通过花粉管通道进入受体。后代的变异是不是由于外源总ＤＮＡ片段与受体基因组整合，表达所引起的，一直没有得到直接的分子生物学证据，本文利用ＲＡＰＤ这一分子生物学技术，对通过花粉管通导入外源总ＤＮＡ所获得的大豆早熟后代进行了分子验证。结果表明：在后代基因组中找到了供体具有而受体没有     

“大豆外源DNA导入方法的建立与应用研究”通过省级成果鉴定

由黑龙江省农科院生物技术研究中心主持的国家自然科学基金资助项目——“大豆外源DNA导入方法的建立与应用研究”于1993年9月6日通过省级鉴定。鉴定会由我国著名大豆遗传育种学家王金陵教授主持。专家们认为该项研究将花粉管通道技术具体应用于大豆分子育种,成功地实现了大豆外源DNA的转移,建立起外源DNA提取、导入、后代选择及分子验证的一整套实验技术体系,获得了一批有应用前景的转化品系和材     

我国大豆转基因研究进展

我国大豆转基因发展很快,本文就大豆转基因中常用的方法:农杆菌介导法、电击法、PEG转化法、基因枪法、花粉管通道法、农杆菌传导的原位基因转化等的技术环节、在大豆抗虫、抗病、抗除草剂等方面转化外源基因上的应用状况,大豆再生体系建立以及对国内大豆转基因的展望.     

芸豆和玉米总DNA导入大豆及后代同工酶酶谱分析

本文报道了利用花粉管能道技术,将芸豆、玉米的总ＤＮＡ导入大豆的实验结果及采用不连续双垂直板聚丙烯凝胶电泳法,对其导入后代进行过氧化物酶及多酚氧化酶的酶谱分析。结果表明：远缘材料的外源总ＤＮＡ导入大豆,其后代发生明显变异,过氧化物酶和多酚氧化酶酶谱发生了变化,说明了外源遗传物质已转移到大豆基因组中,并且得到表达。     

导入外源DNA改良玉米自交系

该项目研究是将优良玉米自交系丹340、巴西抗病玉米杂交种以及大豆的总DNA,通过花粉管通道法分别导入玉米自交系7922、E28和黄428,对花粉管导入技术进行研究。改良7922自交系的株高和穗位比对照平均降低44 cm和22 cm;改良E28自交系S6的抗病性显著提高;改良黄428自交系A33和A35的干物质含量明显增加。     

导入外源DNA获得抗SMV大豆品系

用花粉管通道技术向大豆导入抗ＳＭＶ（大豆花叶病毒）的品种间、种间以及属间材料ＤＮＡ，结合常规育种程序，培育出抗病丰产品系。抗病性鉴定结果表明，获得了抗性是遗传稳定的。与对照相比，在保证和提高原品种丰产水平前提下，水平抗笥明显提高，同一品系对ＳＭＶ的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ不同毒系抗性水平有差异。讨论认为，用外源ＤＮＡ导入技术创造和培育抗ＳＭＶ大豆种质和品种途径是可取的。     

CaCl2诱导大豆花粉管通道农杆菌转基因研究

为了提高大豆花粉管通道法转基因效率,研究直接用农杆菌转化方法的可行性,以秋大豆品种上海本地青为受体材料,用花粉管通道法在三种CaCl2浓度水平下进行质粒pCAMBIA3301转化,又以GV3101、LBA4404、EHA105三种农杆茵菌株直接导入花粉管通道为处理进行了遗传转化.以质粒为外源基因平均结实率为36.83%,T0代种子平均成活率为60.89%,T1植株喷施除草剂后平均存活率为8.24%.以农杆菌直接转化平均结实率为15.92%.T0代种子平均成活率为20.40%,T1植株喷施除草剂后平均存活率为7.79%.对存活的植株提取DNA进行PCR检测,以质粒为外源基因的处理共获得20株转化苗,三种CaCl2浓度水平的转化效率分别为0.56%、1.64%、1.40%,有两种水平的转化效率约为传统转化效率的三倍.以农杆菌直接转化的处理共获得5株转化苗,转化效率分剐为0.17%、0.33%、0.29 %.     

外源野生大豆DNA导入栽培大豆引起的变异

本文利用花粉管通道在大豆自花受粉后,将野生大豆DNA导入栽培大豆,从而引起了后代性状的广泛变异。结果进一步证明了外源DNA片段直接导入受体植物卵细胞、合子或早期胚细胞,部分片段可被受体细胞DNA整合乃至表达理论的可行性和实用价值。     

外源DNA直接导入大豆的研究

本文报道了在大豆自花授粉后,利用其形成的花粉管通道,将外源DNA直接导入栽培大豆的研究结果。 通过对10组大豆实验材料进行外源DNA导入的结果看出:转化的后代主要表现在熟期、株型、花色、种皮包、百粒重和蛋白质含量的变异;变异的D_2代单株或株系的过氧化物同功酶酶谱和酶活性显示了明显的差异,其中发生“疯狂分离”的单株,其酶带显示不规律;表型变异不明显而蛋白质含量高于受体的8701组合的D_2代各株系,其酶活性明显增强,并主要表现在A_1和B区。 实验结果表明:外源DNA片段直接导入受体植物卵细胞、合子或早期胚细胞,部分片段可以被受体细胞DNA整合和表达。还表明:利用花粉管通道途径来实现外源DNA直接导入大豆,进行大豆种质创新和品质改良也是可能的。     

PCR-ELISA法对大豆品种的转基因定性检测研究

以共价交联在PCR管壁上的寡核苷酸作为固相引物进行PCR扩增,对PCR扩增的固相和液相产物分别进行杂交和凝胶电泳检测的PCR-ELISA法,对黑龙江省常规选育品种合丰35和黑农37、外源DNA直接导入大豆的分子育种所获品种黑生101、及大连进口的美国2号等大豆,进行转基因定性检测.结果表明:该方法高效可靠,可作为一种快速定性检测转基因产品的方法;检测结果:美国2号为转基因大豆,黑生101、合丰35和黑农37为非转基因大豆.上述结果对分子育种、生态保护、安全监测及对建立黑龙江省非转基因大豆生产保护区等具有重要意义.     

大豆花粉管通道法转化lkt50基因

采用花粉管通道法,将外源基因lkt50向大豆品种东农48和品系东农96-02导入.通过卡那霉素筛选,从所获得的种子苗中初选转化植株,进一步进行PCR、Southern blot及RT-PCR分子生物学检测.结果表明:在14株卡那霉素抗性材料中利用nptII基因的特异性引物有7株PCR阳性,利用lkt50基因特异性引物有2株PCR阳性,并且2株Southern blot及RT-PCR检测均呈现阳性,因此认为花粉管通道法可以用于大豆的转基因研究和应用.     

外源DNA导入大豆变异后代的SOD同工酶分析

以花粉管通道途径向大豆导入外源DNA,变异后代已达D_4代。 受体为栽培品种吉林20号、吉林16号;供体足野生豆、半野生豆和栽培豆。从439个D_1植株中得12株变异株,变异率为3％。变异性状明显表现供体特征,并且是可遗传的。超氧物歧化酶(SOD)同工酶电泳鉴定,在有的变异株中检测到供体具有的亚基谱带b_1、b_2。结果表明,外源DNA导入技术在大豆育种上是可以利用的。     

导入外源总DNA获得优质高蛋白和双高大豆新品系

本文报道了利用大豆自花受粉后形成的花粉管通道，将外源野生大豆总ＤＮＡ直接导入受体栽培大品种中，其中一组合（Ｄ８７０１）获得的导入后代Ｄ８９－９８２，蛋白南含量比受体提高了近２个百分点，球蛋白总量提高近１０个百分点，并使其与大豆加工品质密切相关的１１Ｓ球蛋白组分所占比例超过了７０％该品系经品比和异地鉴定，产量比标准品种提高１１％，于１９９５年进入省区域试验；另一组合（Ｄ８７０５）的导入后代Ｄ９０－１     

外源DNA导入的大豆品种“黑生101”的RAPD初探

黑生１０１是利用花粉管通道技术育成的一第一个大豆品种,利用１３２个随机引物对黑生１０１及其供体,受体的ＤＮＡ进行ＲＡＰＤ扩增,其中３个单引物和２个双引物组合起来,均能在后代黑生１０１中扩增出与供体相同而与受体不同的ＤＮＡ片段,证明黑生１０１中确有供体ＤＮＡ片段的导入。     

外源DNA导入大豆获得一不育材料

获得不育系的途径有许多，如远缘杂交，自然变异，无性系变异等。本试验以吉林２０号大豆为受体，采用花偻管通道导入技术，导入远缘材料鹰咀豆总体ＤＮＡ，于Ｄ２代获得一不育变异株Ｄ８８０４－７，通过对该材料雌雄育性进行了一系列研究，初步认为，Ｄ８８０４－７材料为雌雄育性均不正常，自交可结少量种子，不育性可自交保持的不育材料。