鳗鲡疱疹病毒SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

[目的]建立鳗鲡疱疹病毒（Anguillid herpesvirus, AngHV）的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR（qPCR)检测方法。[方法]利用PCR扩增出AngHV ORF49的序列,克隆至pET-32a载体,构建重组质粒pET-32a-ORF49,作为qPCR的标准品;根据ORF49序列设计引物,以梯度稀释的重组质粒为模版,进行SYBR Green Ⅰ qPCR扩增,制作标准曲线,建立AngHV的qPCR检测方法,并评价其灵敏性、特异性、重复性和应用效果。[结果]结果显示,qPCR的Ct值与标准品的拷贝数线性关系良好,且线性范围广,获得的标准曲线的相关系数（R2）达到0.999,扩增效率为100.855%;该方法特异性好,仅特异性检测AngHV,而对鲤疱疹病毒Ⅲ型（Cyprinid herpesvirus 3, CyHV-3）、蛙虹彩病毒（Rana grylio virus, RGV）和鳗鲡虹彩病毒（Eel iridovirus, EIV）无扩增;该方法重复性好,组内和组间变异系数均小于2%;该方法灵敏性高于普通PCR法,最低可检测到10个病毒拷贝,而普通PCR法为1000个病毒拷贝。应用分析结果表明,感染AngHV的欧洲鳗鲡（Anguilla anguilla）的主要组织器官内均可检测到AngHV,并且鳃、鳍和皮肤黏液内的病毒量明显高于其他组织器官;对保存的25份疑似鳗鲡“脱黏败血综合征”病料进行检测,阳性检出率为96%,而普通PCR法的阳性检出率仅为76%。[结论]本研究建立的AngHV SYBR Green Ⅰ qPCR检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好,可用于AngHV的快速和定量检测,对鳗鲡“脱黏败血综合征”的防控也具有重要意义。     

迟缓爱德华氏菌SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法的建立及其应用

根据克隆得到的迟缓爱德华氏菌gyrB基因序列设计并合成一对特异性引物,通用性和特异性检测结果显示所设计的引物具有良好的种间特异性和种内通用性,构建含gyrB基因的重组质粒作为标准品,经过反应体系优化后建立了检测迟缓爱德华氏菌的SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法。结果显示,该方法线性关系良好,在Tm为63℃时,扩增产物的熔解曲线仅有一个单特异峰,扩增所得标准曲线为y=-3.32x 39.38,相关系数为0.998,扩增效率为1.00,最低能检测到60个拷贝。应用建立的方法对人工感染的大菱鲆病样进行了检测,三个被检样品均呈阳性反应,证明该方法具有较好的适用性。实验结果表明所建立的实时荧光定量PCR方法具有特异、敏感、快速、定量的优点,可用于迟缓爱德华氏菌病的快速检测。     

鳗鲡疱疹病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为了建立鳗鲡疱疹病毒(Anguillid herpesvirus,AngHV)的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR(qPCR)检测方法,利用PCR扩增出AngHV ORF49的序列,克隆至pET-32a载体,构建重组质粒pET-32a-ORF49,作为qPCR的标准品;根据ORF49序列设计引物,以梯度稀释的质...     

基于vhhP2基因的SYBR Green I实时定量PCR检测哈维氏弧菌方法的建立

根据哈维氏弧菌(Vibro harveyi)溶血素基因vhhP2的保守序列设计特异性引物, 建立了SYBR Green I实时定量PCR检测哈维氏弧菌的方法。构建含vhhP2基因的重组质粒作为标准品, 进行SYBR Green I实时定量PCR, 在Tm为60℃时, 扩增产物的熔解曲线仅有一个特异峰, 扩增所得标准曲线为y= –3.331x+37.48, 相关系数为0.998, 扩增效率为1, 最低可检测到7个拷贝。实验结果表明该检测技术具有较高的特异性、敏感性和重复性, 对哈维氏弧菌病的快速诊断和流行病学调查有重要意义。

     

基于gyrB基因的SYBR Green I实时定量PCR检测病原灿烂弧菌

灿烂弧菌Vibrio splendidus是多数海水养殖动物的主要致病菌,对养殖业危害较大。本研究根据灿烂弧菌gyrB基因的保守序列设计特异性引物,建立了SYBR Green I实时定量PCR检测灿烂弧菌的方法。构建含gyrB基因的重组质粒作为标准品,进行SYBR Green I实时定量PCR,在Tm为62℃时,扩增产物的熔解曲线仅有一个单特异峰,扩增所得标准曲线为y=-3.338x+37.67,相关系数为0.999,扩增效率为0.99,最低能检测到20个拷贝。实验结果表明,该检测技术具有较高的特异性、敏感性和重复性,对灿烂弧菌病的快速诊断和流行病学调查有重要意义。     

鰤鱼诺卡氏菌SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

根据GenBank中蛳鱼诺卡氏菌16S-23S rRNA基因序列设计并合成一对特异性引物,经反应体系优化后建立了检测蛳鱼诺卡氏菌的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。结果显示,该方法线性关系良好,标准曲线的相关系数为0.998;溶解曲线分析显示产物为单一的特异峰;检测灵敏度可达10 6μg/μL的DNA含量,与嗜水气单胞菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌、麦氏弧菌不发生交叉反应,具有良好的特异性。应用建立的方法在蛳鱼诺卡氏菌病爆发时期,对16份鱼体组织、养殖水体、饲料等样品进行了检测,结果 7份为阳性,与细菌分离、培养检查结果 100%相符。既能检测发病鱼,又能检出未发病且已感染的病鱼,对病害的早期防控体现应用价值。结果表明,建立的实时荧光定量PCR方法具有特异、敏感、快速、定量等优点,可用于蛳鱼类致病鱼诺卡氏菌的快速检测。     

美洲鳗鲡腺瘤病毒(AEAdoV)普通PCR和SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为了建立美洲鳗鲡腺瘤病毒（American Eel Adomavirus, AEAdoV）的检测方法,根据AEAdoV福建株的superfamily 3 helicases (S3H)序列,设计了二对引物,建立了AEAdoV的普通PCR和qPCR检测方法;进一步评价检测方法的灵敏性、特异性及重复性,比较两种方法对AEAdoV-FJ检出率,并对美洲鳗鲡体内各组织的病毒含量进行了分析。结果显示,普通PCR扩增的目的片段长度约300bp,利用其构建了qPCR质粒标准品,其拷贝数与qPCR的阈值循环数(cycle threshold value,CT)线性关系良好,线性范围广,标准曲线相关系数(R2)达到0.999,扩增效率为105.067％;采用普通PCR法和qPCR可检测的最低AEAdoV拷贝数分别为100个和10个;上述两种方法均可特异性检测AEAdoV,而对蛙虹彩病毒（Rana grylio virus,RGV）、鳗鲡疱疹病毒（Anguillid herpesvirus,AngHV）、鲤疱疹病毒（Koi herpes virus,KHV）、对虾白斑综合症病毒（White spot syndrome virus,WSSV）、日本鳗鲡内皮细胞坏死病毒(Japanese Eel Adomavirus,JEAdoV)和花鳗鲡腺瘤病毒(Marbled Eel Adomavirus, MeAdoV)均无扩增反应;qPCR法的组内和组间变异系数均小于2%,表明其重复性良好。临床应用结果显示,35 份美洲鳗鲡病料,采用普通PCR法的AEAdoV检出率为82.8%,而qPCR法的AEAdoV检出率为97%。对美洲鳗鲡组织的病毒含量分析结果显示心脏、肝脏、鳃、鳍的AEAdoV相对含量较高,而黏液、皮肤和脾的病毒含量相对较低。上述结果对于研究AEAdoV的致病性,开展其流行情况和病原学情况具有重要意义。     

基于lolB基因的SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测病原霍乱弧菌方法的建立

基于霍乱弧菌lolB基因保守序列设计1对特异性引物,建立了SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测霍乱弧菌的方法。常规PCR检测仅霍乱弧菌扩增出大小为519bp的目的片段,其他3种病原弧菌均为阴性;SYBR GreenⅠ实时定量PCR,在Tm为86.5～87℃,扩增产物的熔解曲线只出现1个单特异峰,无引物二聚体,表明该引物具有较好的特异性。SYBR GreenⅠ实时定量PCR扩增曲线反映了PCR的指数增长阶段和平台阶段;所制作的标准曲线在2.59×108～2.59×100拷贝数之间有较好的线性关系,相关系数为0.993,能对霍乱弧菌进行准确的定量分析。该方法检测时间从核酸抽提到结果分析仅需4～5h,较传统方法敏感、操作简单、耗时短,是霍乱弧菌引起的水产动物疾病的快速诊断及流行病调查的有效方法。     

(鱼师)鱼诺卡氏菌SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

根据GenBank中(鱼师)鱼诺卡氏菌16S-23S rRNA基因序列设计并合成一对特异性引物,经反应体系优化后建立了检测(鱼师)鱼诺卡氏菌的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法.结果显示,该方法线性关系良好,标准曲线的相关系数为0.998;溶解曲线分析显示产物为单一的特异峰;检测灵敏度可达10-6 μg/μL的DNA含量,与嗜水气单胞菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌、麦氏弧菌不发生交叉反应,具有良好的特异性.应用建立的方法在(鱼师)鱼诺卡氏菌病爆发时期,对16份鱼体组织、养殖水体、饲料等样品进行了检测,结果7份为阳性,与细菌分离、培养检查结果100％相符.既能检测发病鱼,又能检出未发病且已感染的病鱼,对病害的早期防控体现应用价值.结果表明,建立的实时荧光定量PCR方法具有特异、敏感、快速、定量等优点,可用于鱼类致病(鱼师)鱼诺卡氏菌的快速检测.     

贝类派琴虫实时荧光定量PCR检测方法的建立和应用

选择派琴虫保守的核糖体DNAITS-2区域设计引物和TaqMan探针,通过对反应体系和反应条件进行优化,建立了实时荧光定量PCR检测派琴虫的方法。所构建方法检测质粒模板DNA的动态范围为2.6×10^1～2.6×10^7拷贝,敏感度可检测到26拷贝质粒DNA,而且与包拉米原虫、隐孢子虫等其他寄生性原虫无交叉反应,也不受贝类组织DNA的干扰。利用本研究所建立的方法对来自我国山东、福建等不同沿海海域的30份贝类样品进行检测,检出阳性样品3份。研究表明,本研究所构建的派琴虫实时荧光定量PCR检测方法具有快速、灵敏和特异等优点,可满足国内养殖场及进出口水生动物携带派琴虫的检测需要。     

虾肝肠胞虫实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

近年来,虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei,EHP)流行区域不断扩大,已经成为我国南美白对虾(Litopenaeus vannamei)养殖重要病原之一。本研究根据Gen Bank中虾肝肠胞虫18S r RNA保守区域设计一套特异性引物和荧光探针,通过优化反应条件,建立检测EHP的TaqMan探针实时荧光定量PCR(Real-time quantitative polymerase chain reaction,qPCR)检测方法。建立的方法呈良好的线性关系(R²=0.998),灵敏度是巢式PCR的10倍。特异性试验表明：检测其他常见病原均为阴性,特异性好;重复性试验显示：批内批间变异系数均小于1.5%,重复性良好;对临床样品检测,与巢式PCR的符合率为97.81%。使用该方法对中山市、江门市和珠海市珠三角部分地区南美白对虾开展EHP流行病学调查,其中虾苗检出率为10.75%,成虾检出率为54.07%,部分区域检出率较高,要防范爆发风险。本研究建立的实时荧光定量PCR灵敏度高、特异性和重复性良好,具有较好的应用前景。     

真鲷虹彩病毒实时定量PCR检测方法的建立与应用

以真鲷虹彩病毒(Red-sea bream iridovirus,RSIV)主要衣壳蛋白(Major capsid protein,MCP)的基因保守片段为靶序列,利用Primer Express 3.0软件设计定量PCR引物,建立了RSIV的SYBR Green I实时定量PCR检测方法.将RSIV MCP基因连接pMD18-T载体,构建重组质粒,经过梯度稀释后作为标准品,根据标准品拷贝数(X)与Ct值的关系绘制了标准曲线,为Ct=-3.184 1gX+40.270,相关系数R2=0.996 9.熔解曲线分析表明,定量PCR产物的Tm值为82.5℃.该方法的检测限为2.20×102拷贝/反应,对流行性造血器官坏死病毒、淋巴囊肿病毒、蛙病毒3、甲鱼虹彩病毒都没有扩增反应,具有特异性.利用该方法对84批海水鱼类(石鲽、大菱鲆、鲈鱼)进行检测,其中5批鱼样品感染RSIV,并利用标准曲线对病毒含量进行了定量分析.     

鳗鲡圆环病毒SYBR Green Ⅰ qPCR检测方法的建立与应用

为建立鳗鲡圆环病毒(Eel circovirus,EeCV)的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR(qPCR)检测方法,根据EeCV复制相关蛋白(replication-associated protein, RAP)基因的保守序列设计特异性引物,并评价其灵敏性、特异性、重复性和应用效果。qPCR的阈值循环数(Cycle threshold value,C_t值)与标准品的拷贝数线性关系良好,且线性范围广(1.0×10⁸～10²拷贝数/μL);可特异性检测EeCV,而对鳗鲡疱疹病毒(Anguillid herpesvirus)、猪圆环病毒(Porcine circovirus)、鸭圆环病毒(Duck circovirus)无扩增;重复性强,组内和组间变异系数均小于3%;灵敏性高于普通PCR法10倍。且qPCR检测后发现,在感染EeCV的鳗鲡体内重要器官均可检测到EeCV,其中鳃的病毒量显著高于其他组织;对保存的44份疑似鳗鲡病毒性感染病料进行检测,阳性检出率为98%,而普通PCR法的阳性检出率为73%。     

梭子蟹肌孢虫的组织分布与形式特点

利用透射电镜技术研究了梭子蟹肌孢虫在三疣梭子蟹体内的组织分布和形式特点,结果显示,梭子蟹肌孢虫主要寄生在骨骼肌、血淋巴、鳃、胃和肠,而在心脏、肝胰腺、性腺和神经等部位未发现。在胃和肠的结缔组织以及骨骼肌中发现梭子蟹肌孢虫的分裂体,表明其可以在这些组织的细胞中增殖,尤其是在骨骼肌细胞中,大量不同发育时期的虫体显示了该虫对骨骼肌的亲嗜性。梭子蟹肌孢虫的分裂体以及其他增殖期的细胞仅寄生于宿主细胞内,而成熟的孢子可存在于宿主细胞内和细胞外基质中。梭子蟹肌孢虫的孢子有6种存在形式,在宿主细胞内和宿主细胞外基质中各有3种。孢子在宿主细胞内的存在形式:1孢子直接寄生于宿主细胞质中,自由游离,无膜包围;2孢子被单层膜包围,类微绒毛样突起物部分溶解,这种情况见于专业性吞噬细胞——无颗粒细胞内;3孢子被层状环形膜结构包围,类微绒毛样突起物清晰,这种情况见于非专业性吞噬细胞内。孢子在宿主细胞外基质中的存在形式:1孢子自由游离,无膜包围,类微绒毛样突起物清晰;2多个孢子被体液性被囊包围,类微绒毛样突起物清晰;3孢子无膜包围,孢外壁与类微绒毛样突起物消失。本研究阐明了梭子蟹肌孢虫在三疣梭子蟹体内的组织分布和孢子的存在形式,为进一步研究微孢子虫在宿主蟹体内的迁移规律提供了重要的基础数据。     

大鲵虹彩病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

利用PCR技术扩增出大鲵虹彩病毒(giant salamander iridovirus, GSIV)主要衣壳蛋白(MCP)编码区长度为1 392 bp 的片段, 克隆到 pMD19-T载体上, 构建重组质粒 pMD19-T-MCP。经PCR鉴定确认正确后, 以10倍梯度稀释 pMD19-T-MCP重组质粒, 作为标准模板进行 TaqMan实时荧光定量PCR扩增, 制作标准曲线, 建立了大鲵虹彩病毒的 TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。制作的标准曲线有极好的线性关系, 且线性范围宽, 相关系数为0.990 19。组内重复试验的CT值标准偏差为0.52%。检测结果显示, 该方法对大鲵虹彩病毒的检测有高度的特异性, 与锦鲤疱疹病毒、弗氏柠檬酸杆菌、嗜水气单胞菌以及鲤上皮瘤细胞基因组DNA之间均无交叉反应, 特异性好, 检测总DNA灵敏度为10个病毒核酸分子拷贝数, 约1.1×10-3 pg/μL病毒核酸, 较之常规PCR的敏感度高出约1 000倍。研究建立的大鲵虹彩病毒TaqMan实时荧光定量PCR方法灵敏度高、特异性强, 对大鲵虹彩病毒病的快速诊断与病毒病原定量检测有重要意义。     

杀鲑气单胞菌的实时定量PCR检测方法的建立和应用

选取杀鲑气单胞菌A层A蛋白(VapA)保守序列,利用Primer Express2.0软件设计引物和探针.以ATCC标准株10倍系列稀释,通过血球计数板计数后进行实时定量PCR,制作标准曲线.通过SDS软件获得细菌数量(X)与Ct值的关系为:Ct＝-3.1574lgX 43.6841(相关系数R2=0.992).实时定量PCR的检测限为6个细菌.建立的方法对杀鲑气单胞菌典型株和非典型株具有较好的特异性,与其他细菌没有交叉反应.杀鲑气单胞菌实时定量PCR方法的建立,对于快速口岸检疫、临床诊断和疫病监测具有重要的应用价值.     

洪湖碘泡虫PCR检测方法的建立与初步应用

为建立一种灵敏、特异的快速检测异育银鲫寄生洪湖碘泡虫(Myxobolus honghuensis)的方法,本研究根据洪湖碘泡虫ITS-5.8S r DNA基因序列筛选出一对特异性引物Mh F/R,建立PCR检测方法,对反应条件进行优化,并通过特异性试验、灵敏性试验与临床检测验证其可行性。结果显示,建立的PCR检测方法能特异性扩增洪湖碘泡虫相应的基因片段,长度为479 bp,而对试验中其他9种粘孢子虫的扩增结果均为阴性;最低能检测0.1 pg的虫体基因组DNA。通过临床样品检测,PCR方法比显微镜检测的检出率提高了19.5%。结果表明,该PCR方法特异、灵敏,适用于洪湖碘泡虫的快速检测。     

虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei)实时荧光定量PCR检测方法的建立及对虾样品的检测

根据Gen Bank中公布的虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei)(EHP)SSU r DNA序列设计1对特异性引物,建立并优化了EHP的SYBR Green I实时荧光定量PCR(q PCR)检测方法。结果显示,该方法在60℃的退火温度时扩增效果最好,产物的熔解曲线为1个单峰,构建的方法对8.3×101–8.3×108 copies/μl的EHP SSU r DNA片段的检测响应具有良好的线性关系,扩增产物阈值循环数(Ct)与模板起始量的对数[log(Sq)]的关系为Ct=–3.369 log(Sq)+39.364(R2=0.992),扩增效率为98.1%,检测灵敏度下限为8.3×101 copies/μl,在线性范围内具有良好的组内和组间重复性。对实际样品的检测表明该方法比已报道的套式PCR的检测灵敏度约高4倍。利用本方法对采集自江苏、海南和山东的3批凡纳滨对虾样品的肝胰腺组织DNA(Hp DNA)中的EHP SSU r DNA进行了q PCR检测,结果显示,EHP的载量指数与对虾生长速率呈负相关关系,肝胰腺中EHP载量在103 copies/(ng Hp DNA)时代表了较高的风险水平。本研究建立的q PCR方法具有特异、灵敏、快速、定量的优点,所建立的方法及检测数据可为EHP的防控提供技术参考。     

刺激隐核虫PCR检测方法的建立

根据已知刺激隐核虫ITS序列设计引物,扩增刺激隐核虫ITS部分序列,并进行克隆、测序及序列分析建立刺激隐核虫PCR快速检测方法,检测DNA片段长度为387 bp,与福建长乐CL1209(KC550300)、福建福鼎FD1210(KC550302)、广东番禺PYH4.12株(DQ270010)、日本Wakayama分离株(AB608054)、台湾嘉义Chiayi株(AF490381)等序列同源性为100%,检测灵敏度为2个虫体。应用建立方法对2011-2013年收集到的50份患刺激隐核虫病的大黄鱼样品进行检测,结果与根据临床检测结果的符合率为100%。该检测方法的建立,为刺激隐核虫病的监测和诊断奠定了快速、简便、高通量的检测方法基础。