应用~(32)P标记核酸探针检测牛传染性鼻气管炎病毒的研究初报

本文在我国首次报道应用核酸探针检测牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)。经培养、纯化IBRV,抽提IBRV全基因组DNA,用缺口翻译法标记上~(32)P,在硝酸纤维膜上进行打点杂交。试验结果表明,采用~(32)P标记的核酸探针,可检测出10Pg的IBRV—DNA,能明显区别IBRV感染细胞和未感染的正常细胞,具有相当高的灵敏度和特异性,同Dorman报道的结果相似。 应用核酸探针检测病毒核酸的技术,近年来有了突破性的进展,有的国外学者称之为第四代检测技术。其基本原理是利用放射性同位素标记的DNA或RNA(即核酸探针)与固定在硝基纤维素膜上或玻片上的单链核酸进行杂交,经过放射自显影,在X光片或感光乳胶中可看到特定的核酸片段的踪迹。由于这一技术具有灵敏度高,特异性强的优点,在医学临床诊断中已显示出它的优越性,文献报道日趋见多。在动物病毒研究方面已见到了用核酸探针检测蓝舌病,牛传染性鼻气管炎鸡马立克病,猪伪狂犬病、犬瘟热、传染性喉气管炎等病毒感染的报道。 Dorman,M,A在1985年首先报道了利用生物素标记的IBRV—DNA的HindⅢ酶切片段可检测出10pg(10~(-11)g)IBRV—DNA。随后,Dunn,D.C和Pacciarini,L以及Brunner,D也相继作了报道。我们用~(32)P标记的IBRV—DNA全基因组做为核酸探针,进行了一系列的研究,初步结果表明,我们     

应用~(32)P标记核酸探针检测牛传染性鼻气管炎病毒的研究初报

文本在我国首次报道应用核酸探针检测牛染性鼻气管炎病毒(IBRV)。经培养、纯化IBRV,抽提IBRV全基因组DNA,用缺口翻译法标记上~(32)P,在硝酸纤维膜上进行打点杂交。试验结果表明:采用~(32)P标记的核酸探针,可检测出10pg的IBRV—DNA,能明显区别IBRV感染细胞和未感染的正常细胞,具有相当高的灵敏度和特异性,同Dorman报道的结果相似。     

光生物素核酸探针检测牛传染性鼻气管炎病毒的研究

用光生物素标记牛传染鼻气管炎病毒(IBRV)基因的9.6kb片段制成探针,能检出10pg的IBRV—DNA,1个TCID_(50)量的病毒和1个TCID_(50)掺毒量的精液,与其它病毒无交叉反应。检测人工感染牛的鼻、眼拭子和病毒分离符合率为84.4％,检测感染细胞与细胞病变符合率达81.7%,两项综合符合率为82.5%,以病毒分离为标准,核酸探针检测的鼻眼拭子特异性为90.9%,灵敏度为71.4%。鼻眼拭子经一代细胞培养增毒后再用核酸探针检测,与病毒分离的符合率达93.8%,特异性和灵敏度均达92.9%。 牛传染性鼻气管炎是由IBRV引起的牛呼吸道炎症、生殖道感染、结膜炎、脑膜脑炎等症状的疾病。此病的诊断通常采用中和试验、ELISA等方法检查感染动物的血清抗体以及病毒分离检测病原。只要病料新鲜,分离病毒并不困难,但从牛精液中分离IBRV,由于精液对细胞有毒性影响,有时不一定能成功。用核酸探针检测病毒基因是一种快速、灵敏、简便的方法,我们采用光生物素标记IBRV基因的9.6kb片段作探针,对IBRV掺毒精液及人工感染牛的鼻、眼拭子进行检测,并与病毒分离进行比较,结果表明核酸探针具有较高的特异性和灵敏度,与病毒分离符合率在8(?)%以上,可与病毒分离互相补充作为病原检测的一种手段。     

化学修饰法制备B组轮状病毒生物素核酸探针及应用研究

用亚硫酸氢钠—乙二胺溶液对B组轮状病毒的ssRNA胞嘧啶修饰和转氨基作用，与生物素e—氨基己酸N—羟基琥珀酰亚胺酯反应，制备探针与样品在硝酸纤维膜上进行点杂交，经亲合素—碱性磷酸酶系统显色，可测出106.25－212.5pg的RNA靶序列，特异性试验表明：B组生物素探针只能与B组核酸杂交，而与无关核酸无杂交信号，用B组探针检测45份仔猪腹泻粪样，检出B组阳性5份，检出率11．1％，明显高于PAGE法，实验结果表明，生物素核酸探针制备简单并且有特异、灵敏、稳定的优点，可用于各组轮状病毒的检测。     

牛传染性鼻气管炎病毒和牛病毒性腹泻病毒双重荧光定量PCR检测方法的建立

为建立基于TaqMan探针的双重荧光PCR技术检测牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)和牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的方法,根据IBRV gB基因序列和BVDV 5′端非编码区序列的保守区域,分别设计1对IBRV的特异性引物和1条FAM标记的TaqMan探针,1对BVDV的特异性引物和1条ROX标记的TaqMan探针,建立双重荧光定量PCR检测IBRV和BVDV的方法。对建立的检测方法进行特异性和敏感性测定,并用临床样品进行检测验证。特异性试验结果显示,该方法检测参试的IBRV毒株,在波长530μm(FAM)时收集到特异性荧光信号曲线,检测参试的BVDV毒株,在610μm(ROX)时收集到特异性荧光信号曲线,无交叉信号出现,对照的毒株无论是在530μm(FAM),还是610μm(ROX)处,均无荧光信号曲线出现,方法的特异性好;敏感性试验结果显示,该双重荧光定量PCR可检测到100个拷贝的IBRV和BVDV质粒DNA模板;临床样品检测结果表明,对保存在-70℃的127份牛病料样品核酸进行检测,IBRV阳性12份,BVDV阳性26份,IBRV和BVDV同为阳性2份,为混合感染,检测的拷贝数分别为6.24×105和6.32×104拷贝/μL。阳性样品经序列比对分析,分别与IBRV和BVDV的序列100%同源。建立的双重实时荧光定量PCR方法检测IBRV和BVDV具有特异、敏感等优点,可用于临床样品的鉴别检测。     

光鸡中马立克氏病病毒的检测

用生物素标记马立克氏病病毒(MDV)基因文库中H片段制成探针,能检出皮肤样品中10pg的MDV—DNA。18份外表健康鸡皮肤样品的阳性检出率为27.8%。     

马立克氏病病毒光敏生物素核酸探针的制备及应用

从马立克氏病病毒(MDV)GA株Bam HI基因文库中选取L片段,用光敏生物素标记该片段,制备了MDV光敏生物素核酸探针。其检测灵敏度达Pg水平,保存期至少4个月。对细胞培养物中病毒核酸的检测结果表明,探针只与血清Ⅰ型MDV DNA发生分子杂交,而不与血清Ⅱ型(SB-1)和血清Ⅲ型(HVT)MDV DNA发生反应。分别以京-1株(血清Ⅰ型)和Fc126株(血清Ⅲ型)接种1日龄雏鸡,于14日龄和30日龄采用斑点杂交法检测羽髓提取的病毒DNA,结果京-1株均为阳性,Fc126株均为阴性,表明该探针可以用于MDV强毒株和HVT疫苗毒株的区别诊断。采用斑点杂交法检测实验感染MDV GA株的鸡全部为阳性(16/16),检出率为100％;而用琼脂免疫扩散试验的检出率为87.5％(14/10)。试验表明,所制备的MDV光敏生物素核酸探针具有特异性强、灵敏度高、无放射性污染等优点。为MDV强毒株的临床检测及MDV分子生物学研究提供了一种重要手段。     

用M_(13)克隆系统建立牛传染性鼻气管炎病毒基因组无性繁殖系

用M_(13)克隆系统对牛传染性鼻气管炎病毒进行克隆,获得14个重组体。用其中9.6kb片段制成的探针,可与IBRV—DNA进行杂交,证实已建立了IBRV基因组的无性繁殖系。 牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)属于疱疹病毒,它的基因组是线性双链DNA,约154kb(千碱基对)。 M_13为丝状雄性特异的大肠杆菌噬菌体,它具有一个单链环状DNA基因组及蛋白外壳,当感染宿主细胞后,单链环状的基团组(ssDNA)转变为双链环状的复制型((?)DNA)。M_(13)DNA经改造已成为有效的克隆载体,并广泛地应用于核酸的序列分析及单链DNA探针。我们采用了M_(13)mp作为克隆载体。改建的M_(13)载体转染JM_(103)细菌后可以产生有活性的β—半乳糖苷酶(Lac~ ),在用IPTG诱生和用X-gal作为酶底物时可以形成蓝色空斑,在Lac DNA的多个单一酶切点序列中插入外源基因,就不能产生有活性的半乳糖苷酶,从而形成透明空斑,可以用这种正性标记挑选重组体。     

新疆南疆某规模牛场牛传染性鼻气管炎PCR鉴定与分析

本试验对15份疑似感染牛传染性鼻气管炎(IBR)患牛鼻腔分泌物样品提取病毒DNA,以gB基因特异性引物进行PCR扩增,测序、核苷酸同源性分析。结果显示,在15个样品中检测出3个牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)核酸阳性样本,检出率为20%,其中1个样本提交GenBank(KY348790),命名为IBRV-4T3-1,3个IBRV核酸阳性样本之间核苷酸同源性达到99%以上,而与IBRV参考株gB基因核苷酸同源性为88.8%以上,构建的gB基因遗传进化树表明,IBRV-4T3-1与参考株亲缘关系较近,处于遗传进化树中同一分支上,属于α疱疹病毒亚科水痘病毒属(Varicellovirus)牛疱疹病毒Ⅰ型(BHV-1)。结合发病情况、临床症状,确认疑似患牛感染IBRV。     

牛传染性鼻气管炎病毒恒温隔绝式荧光PCR检测方法的建立

为建立检测牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的恒温隔绝式荧光PCR(iiPCR)方法,本研究采用文献报道的引物和探针,通过优化反应体系,首次建立了检测IBRV核酸的iiPCR方法。结果显示该方法仅特异性检测出IBRV,而对牛病毒性腹泻-黏膜病病毒、牛副流感3型病毒、牛呼吸道合胞体病毒、牛腺病毒3型、牛冠状病毒、牛支原体、多杀性巴氏杆菌和溶血性曼氏杆菌等病原则不能检出。该方法的检测下限为2.4拷贝/μL质粒标准品,并具有良好的重复性。对临床样品的检测结果与OIE推荐的荧光定量PCR方法的检测结果一致;该方法配合PetNAD核酸萃取试剂盒,从核酸提取到报告检测结果仅需1h,具有操作简便、快速、可现地化的特点。对9个省29份商品化冻精检测结果显示,IBRV阳性率为24%(7/29),表明我国流通的商品化冻精携带IBRV情况普遍。本研究为IBRV的现地检测提供了一个可靠的方法。     

寡核苷酸探针原位检测石蜡切片中PRRSV核酸

根据GenBank收录的美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）ATCCVR-2332株ORF6和ORF7基因序列，用O1igo软件设计并合成大小为37bp的寡核苷酸探针，经生物素标记后，成功建立了原住检测石蜡组织切片中PRRSV核酸的方法。该探针能检测到56PgPRRSV核酸的RT—PCR产物DNA，能特异检测出PRRSV核酸及其PCR产物，而对猪瘟病毒（HCV）、猪细小病毒（PPV）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪乙脑病毒（JEV）的核酸呈阴性反应。应用该方法检测PRRSVSC-1株人工感染的28日龄仔猪，在感染后7d即可在肺脏、肾脏、扁桃体、胸腺、肺门淋巴结、十二指肠和大脑检测到PRRSV核酸。该法可用于仔猪PRRSV感染的诊断和组织中核酸的定位及分布研究，也可用于甲醛固定组织的回顾性诊断。     

肉食兽细小病毒核酸探针的制备及其初步应用研究

将提纯的貂肠炎病毒(MEV)中间复制型DNA(RF-DNA),以HinaⅡ酶切,回收0.7kbC片段并克隆至质粒pBR322中,构成重组质粒pBM,经转化大肠杆菌RRⅠ并扩增后,提纯pBM,酶切电泳回收克隆的C片段,以[α-32P]dATP标记C片段和pBM,用光生物素标记pBM,分别制成放射性同位素和光生物素核酸探针。采用打点杂交技术检测了5种肉食兽细小病毒的细胞培养物和非细小病毒科5种病毒的细胞培养物,同时检测了貂和犬的粪便样品33份。结果表明,32P标记的C片段和pBM探针与光生物素际记的pBM探针均具有相同的杂交特异性,与5种肉食兽细小病毒及感染细小病毒的貂、犬粪样呈杂交阳性反应,与其他科病毒及健貂、犬粪样呈阴性。同位素32P和光生物素标记探针分别检出1 pg和10 pg貂肠炎病毒RF-DNA,敏感性比血凝试验分别离100倍和10倍。     

貂肠炎病毒DNA探针打点杂交技术检测兔出血症病毒

采用HindⅢ酶切和琼脂糖凝胶电泳技术,从重组质粒pBM中回收0.7kb貂肠炎病毒(MEV)DNA片段.以[α-~(32)P]dATP和光生物素分別标记制备DNA探针。采用打点杂交技术,用上述探针检测提纯的兔出血症病毒(RHDV)和3份感染RHDV的兔肝脏样品,同时检测从貂、犬、豹、猫和貉分离的5种肉食兽细小病毒,并用电镜检查和血凝试验为对照。探针与上述5种肉食兽细小病毒呈杂交阳性反应,而RHDV及感染的肝脏样品为阴性反应.该结果表明,MEV和RHDV在该0.7kb DNA区域内没有同源性,而5种肉食兽细小病毒在此区域内具有遗传相关性。     

BVDV和IBRV双重实时荧光定量PCR检测方法建立

根据牛病毒性腹泻病毒(BVDV)5′端非编码区和牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)gB基因保守区基因序列,参考文献分别合成了2对特异性引物和探针。利用构建的包含BVDV和IBRV目标基因片段的阳性质粒,对退火温度、引物和探针的浓度以及反应条件进行了优化,构建了实时荧光定量PCR(qPCR)标准曲线,并对双重qPCR方法的特异性、敏感性和重复性进行了评价。试验结果显示,qPCR最适退火温度为54.0℃,BVDV引物浓度为0.2μmol/L,IBRV引物浓度为0.3μmol/L,BVDV探针浓度0.2μmol/L,IBRV探针浓度为0.1μmol/L。BVDV的RNA最低检测限为100拷贝/μL,IBRV的DNA最低检测限为1拷贝/μL,并具有良好的特异性和重复性,为BVDV和IBRV的同时、快速、定量检测提供了有效的方法。     

应用生物素标记的重组质粒作为探针的杂交条件及敏感性研究

貂肠炎细小病毒复制中间型 DNA(MEV-RF-DNA)的 HindⅢ-C 片段被克隆到 pBR322中形成重组质粒pBM。用光生物素(photo biotin)标记 pBM 和 HindⅣ酶切片段的 pBM 作为探针分别与貂,太细小病毒感染的细胞培养物人工感染细小病毒的貂和犬粪便进行斑点杂交试验,结果发现两种探针检测的敏感性相差10倍以上.光生物素标记的完整重组质粒探针具有放大作用,酶切后的 pBM 敏感性不如前者.另外,本实验还证明在用生物素标记的探针杂交时,被检样品用热变性处理比碱变性处理效果更佳,而且简便。     

牛传染性鼻气管炎病毒LUXTM新型荧光PCR检测方法的建立

本研究针对牛传染性鼻气管炎病毒（Infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV）高度保守的gC基因设计单标记并具有自身荧光淬灭功能的LUX^TM引物，建立L刚新型实时荧光PCR方法用于快速检测IBRV。该方法对四株IBRV细胞培养物的检测均呈典型阳性反应，而对其它动物疱疹病毒以及健康牛组织DNA和细胞对照的检测结果为阴性，检测时间包括核酸提取仅需1h～2h。试验表明，LUX^TM荧光PCR法对IBRV细胞增殖病毒液的检测敏感性可达0．04TCID50，比病毒分离敏感性至少提高10倍；对10倍系列稀释的纯化IBRV核酸样品，L刚荧光PCR的检测敏感性比常规PCR可提高10^3倍。将病毒液添加到健康牛精液和血液样品中，该荧光PCR可检测到牛冻存精液中40TCID50牛抗凝全血、血清和临床精液中0．04TCID50的病毒，说明对临床样品的检测有效。本研究所建立的LUXTM荧光PCR方法快速敏感，适合应用于活牛及其遗传物质的进出口检疫、养牛业疾病防控等领域对IBRV的快速检测。     

马立克氏病病毒光敏生物素核酸探针的制备及应用

从马立克氏病病毒（MDV）GA株BamHI基因文库中选取L片段，用光敏生物素标记该片段，制备了MDV光敏生物素核酸探针，其检测灵敏度pg水平，保存期至少4个月，对细胞培养物中病毒核酸的检测结果表明，探针只与血清Ⅰ型MDV DNA发生分子杂交，而不与血清Ⅱ型（SB－1和血清Ⅲ型（HVT（MDV DNA发生反应，分别以京－1株（血清Ⅰ型）和Fc126株（血清Ⅲ型）按种1日龄急诊鸡，于14日龄和30日龄采用斑点杂交法检测须提取的病毒DNA，结果京－1株均为阳性，Fc126株均为阴性，表明该探针可以用于MDV强毒株和HVT疫苗毒株的区别诊断，采用斑点发校法检测实验感染MDV GA株的鸡全部为阳性（16／16），检出率为100％，而用琼脂免疫扩散试验的检出率为87．5％（14／16）。结果表明，所制备的MDV光敏生物素核酸探针具有特异性强、灵敏度高、无放射性污染等优点，为MDV强毒株的临床检测及MDV分子生物学研究提供了一种重要手段。     

牛白血病前病毒Taqman荧光PCR检测方法的建立

设计并合成荧光引物,建立了Taqman荧光PCR体系,可快速检测全血样品中的牛白血病前病毒DNA。所建立的荧光PCR体系可特异检测牛白血病病毒核酸,而对牛病毒性腹泻—粘膜病毒(BVDV)、牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)以及羊胎肾细胞(FLK)、牛布鲁氏菌扩增均呈阴性反应,对pBST-pol重组质粒的检测敏感性可达0.32拷贝。重复性实验的Ct值变异系数介于0.67%~1.16%之间,稳定性实验的Ct值变异系数为3.14%。采用建立的Taqman荧光PCR体系和OIE推荐的套式PCR对94份临床样品进行检测,两者定性符合率达到97.87%。     

鸡致病性外源性禽白血病病毒特异性核酸探针交叉斑点杂交检测试剂盒的研制

用特定引物通过PCR合成了经地高辛标记的鸡致病性外源性及内源性禽白血病病毒特异性核酸探针,通过交叉斑点分子杂交,这些探针将可用于检测病料样品中致病性外源性禽白血病毒特异性核酸的存在。利用此试剂盒,对从病料组织样品中提取的基因组DNA作交叉斑点分子杂交或对提取的DNA用相应引物扩增后的PCR产物作交叉斑点分子杂交,可在24～36h内完成检测并报告结果。     

鸡传染性喉气管炎病毒核酸探针的制备及特异性鉴定

从鸡传染性喉气管炎病毒王岗株感染的鸡胚绒毛尿囊膜细胞中提取病毒,并抽提其核酸,经限制性核酸内切酶Pst Ⅰ完全消化后,在0.7%琼脂糖凝胶中电泳分离,然后用DE—81滤纸回收2～6kb区域的片段与质粒pBluescrip~+SK重组.有3个重组质粒(pLT—1,pLT—2和pLT—4)所含外源DNA片段的大小,分别与4.3kb,4.8kb和1.6kb的鸡传染性喉气管炎病毒DNA Pst Ⅰ片段一致,经过Southern杂交试验证明,这3个片段都是病毒DNA的特异性片段.用光生物素标记重组质粒pLT—1和pLT—2后混合作为探针,再与鸡喉气管炎病毒及其他8种鸡传染性病原进行杂交,证明此探针只与喉气管炎病毒反应,而与其他8种病原无任何交叉反应.