Dazl基因在绵羊不同发育期睾丸组织中的表达与细胞定位

类无精症缺失基因(deleted in azoospermia-like gene,Dazl)在雄性动物生殖细胞分化过程中起重要调控作用,但对于不同物种或处于不同发育阶段的同一物种而言,其调控机制存在差异。为了探讨Dazl在绵羊(Ovis aries)不同发育期睾丸组织中的表达、定位及调控作用,本实验选取0、2、5、12和24月龄健康的绵羊15只,每组3只,采取睾丸、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和肌肉组织。运用实时荧光定量PCR(quantitative Real time PCR,q RT-PCR)检测了0、2、5、12和24月龄绵羊睾丸组织及12月龄绵羊的不同体组织(心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和肌肉)中Dazl m RNA的表达量,利用Western blot技术对Dazl基因编码蛋白的表达量进行检测,并采用免疫组织化学染色方法检测Dazl蛋白的阳性信号在不同月龄睾丸组织中的分布情况。结果显示,对于不同月龄睾丸组织,从m RNA和蛋白水平均检测到了Dazl基因的表达,并且二者的趋势基本相似。在0、2和5月龄睾丸中Dazl m RNA及蛋白表达量较低,12月龄中表达量较高且极显著高于0、2和5月龄(P0.01),而在24月龄中Dazl m RNA及蛋白的表达量均出现不同程度的下调现象。12月龄绵羊各组织的q RT-PCR检测结果显示,Dazl m RNA只在睾丸组织中高表达,在心脏中表达量很低,而在其他组织中不表达。免疫组织化学染色结果显示,Dazl蛋白在初情期前(0、2和5月龄)定位于睾丸间质细胞,而在12和24月龄定位于睾丸间质细胞、初级精母细胞、次级精母细胞和精子细胞。研究结果表明,Dazl基因在性成熟前公羊的睾丸间质细胞及成年羊的睾丸间质细胞、精母细胞和精细胞中表达,并且在他们的增殖过程中起调控作用。由此推测,在绵羊睾丸发育过程中,Dazl基因可能通过直接作用(调控精母细胞的成熟分裂)和间接作用(调控睾丸间质细胞的增殖)共同调控精子发生。本研究为进一步研究Dazl基因在雄性动物精子发生过程中的调控机制提供了科学依据和参考。     

断奶前后仔猪小肠Proglucagon mRNA的时空特异性表达

摘要：目的：胰高血糖素样肽-2（GLP-2）与小肠上皮生长关系密切。研究断奶前后仔猪十二指肠、空肠和回肠GLP-2 mRNA 表达丰度的变化规律，探讨断奶前后仔猪小肠上皮更新缓慢，是否与编码GLP-2的基因 — 胰高血糖素原（Proglucagon）的时空特异性表达有关。方法：本实验随机选取新生仔猪9窝，于35日龄（d）断奶。分别于断奶前1周（28d）、断奶当天（35d）、断奶后72h（38d）、断奶后1周（42d）、断奶后10天（45d）随机选取仔猪6头，屠宰，迅速采取十二指肠、空肠（后段）和回肠粘膜，用RT-PCR检测样品中胰高血糖素原 mRNA表达量。结果：胰高血糖素原基因在小肠中的表达呈现明显的空间（肠段）特异性，空肠和回肠表达丰度较高，而在十二指肠表达很少。胰高血糖素原 mRNA在仔猪空肠和回肠的表达显示截然不同的时间（日龄）特异性模式：空肠胰高血糖素原 mRNA表达在42日龄之前保持较高水平，而在断奶后1周和断奶后10天显著下降；而回肠中胰高血糖素原 mRNA表达水平在本实验观察期内保持稳定，未检测到日龄相关的变化。结论：断奶仔猪小肠GLP-2 mRNA表达呈现时空特异性规律。     

StAR蛋白在仔猪睾丸组织中的表达*

以1-5周龄的仔猪睾丸为研究对象，采用免疫组化法和放射免疫法(RIA)研究了类固醇合成快速调节蛋白(StAR protein)在仔猪睾丸的表达及StAR蛋白与血浆睾酮水平的关系。实验结果表明：在1～5周龄，StAR蛋白主要在仔猪睾丸的间质细胞中表达；其中1、3周龄StAR蛋白的表达水平较低；2、4周龄StAR蛋白的表达水平较高，5周龄StAR蛋白的表达水平低于2、4周龄，但比1、3周龄强。睾酮水平在第2、3周时最高，在其它时期较低。StAR的表达与睾酮水平的变化并不完全一致。     

SOX9基因在绵羊不同组织中的表达及其在睾丸中的定位

SRY-盒包含蛋白9(sex determining region Y-box 9,SOX9)基因在哺乳动物个体发育中扮演重要角色,广泛存在于各种组织,但主要在睾丸组织表达,参与调控睾丸细胞的增殖与分化.本研究采用qRT-PCR方法检测了6月龄小尾寒羊(Ovis aries)体组织及其0、2、6、12和24月龄睾丸组织SOX9mRNA的表达规律,并运用Western blot、免疫组织化学技术对不同发育期睾丸SOX9蛋白进行表达与定位研究.结果显示,在体组织中SOX9 mRNA表达无组织特异性,但垂体表达量最高,下丘脑和睾丸次之,肌肉组织9背最长肌和股二头肌)几乎无表达;随着月龄的增加,SOX9 mRNA在睾丸中的表达量先降低后上升,其中6月龄睾丸表达量显著高于0和2月龄(P＜0.05),但显著低于12和24月龄(P＜0.05).SOX9蛋白表达趋势与mRNA基本一致,0、2和6月龄睾丸中表达较低,少量支持细胞和间质细胞呈免疫阳性反应;12和24月龄睾丸中表达较高且呈增加趋势,支持细胞、部分间质细胞、极少量初级精母细胞和次级精母细胞呈免疫阳性反应.研究结果表明,SOX9基因在绵羊不同体组织中广泛表达,在下丘脑-垂体-睾丸生殖轴中发挥重要作用,并与睾丸细胞的增殖及分化过程有密切的关系.     

猪背膘组织二脂酰甘油酰基转移酶基因(DGAT1和DGAT2)的发育性表达分析

酰基辅酶A:二脂酰甘油酰基转移酶(acyl-coA:diacylglycerol acyltransferase,DGAT)是催化甘油三酯合成最后一步反应的关键酶,包括DGAT1和DGAT2两种;阐明其在发育过程中的表达规律对于找到控制中外猪种脂肪沉积能力差异的基因十分必要.本研究分别用RT-PCR和实时荧光定量RT-PCR的方法分别对莱芜猪和杜洛克3日龄仔猪和成年猪背膘组织中DGAT1和DGAT2 mRNA表达量进行了分析.结果表明,莱芜猪和杜洛克成年猪DGAT1 mRNA的表达量均高于3日龄仔猪,分别为5.0倍和2.7倍;成年猪DGAT2 mRNA表达量高于3日龄仔猪,分别为27.6倍(P＜0.01)和4.8倍(P＜0.05).两品种成年猪和3日龄仔猪DGAT2基因表达量的变化均高于DGAT1.品种间同一发育时期比较,杜洛克3日龄仔猪背膘组织中DGAT2基因的表达量高于莱芜猪,但成年莱芜猪背膘组织中DGAT2基因的表达量高于杜洛克,差异均不显著(P＞0.05).提示DGAT2基因可能与中外猪品种脂肪沉积能力的差异有关.     

二花脸FSH的高量表达对大白公猪睾丸的影响

促卵泡激素(follicle-stimulating hormone,FSH)是一种动物垂体前叶嗜碱性细胞合成分泌的糖蛋白类促性腺激素.FSH在雄性动物体内的主要作用是刺激精子发生.本研究以15d和成年F1代转二花脸FSH公猪(Susscrofa)及其同日龄全/半同胞野生型公猪睾丸为材料,分析了其绝对重量和相对重量,制作了睾丸苏木精-伊红(HE)染色石蜡切片,统计了相关指标,通过qRT-PCR分析了生殖相关基因在睾丸中的表达量,与此同时,检测了睾丸中FSHβ和FSHR的甲基化率.睾丸绝对重量和睾丸脏体比分析结果表明,二花脸FSH的高量表达对大白公猪睾丸重量没有显著影响.睾丸HE染色石蜡切片分析结果显示,二花脸FSH的高量表达可以增加大白公猪睾丸中生殖母细胞的数量,对大白公猪睾丸组织结构无显著影响.qRT-PCR分析结果表明,二花脸FSH的高量表达没有影响内源生殖相关基因的表达.甲基化水平检测结果发现,二花脸FSH基因的高量表达对大白公猪睾丸中FSHβ和FSHR的甲基化水平没有显著影响.本研究结果表明,二花脸FSH的高量表达可以增加大白公猪睾丸中生殖母细胞的数量,从而提高大白公猪的生精能力,为研究精子发生过程提供参考依据.     

GnRH主动免疫对雄性大鼠垂体-睾丸轴功能的影响

本研究用GnRH并列体二聚物(GnRH-TDK)主动免疫SD雄性大鼠观察其对大鼠垂体-睾丸轴功能的影响,以探讨GnRH主动免疫去势的分子机理.24只性成熟SD雄鼠随机分为免疫组和对照组,免疫组雄鼠于12周龄时初免,8周后加免,对照组雄鼠不做任何注射.每两周采集血液放免法检测血清抗体滴度及激素含量变化.加免后4周脱颈处死所有雄鼠,收集垂体、睾丸实时荧光定量PCR分析相关生殖基因mRNA的变化.结果显示,GnRH主动免疫后12只免疫雄鼠中11只血清GnRH抗体滴度显著上升,血清LH、FSH及睾酮(T)均极显著下降到检测限附近或以下(p＜0.01),同时睾丸严重萎缩,其重量及体积下降到对照组睾丸的20％(p＜0.01),组织切片显示,曲细精管上皮组织严重受损,管内仅有少数退化的精原细胞.与对照组相比,GnRH主动免疫极显著下调雄鼠垂体GnRH受体、LH-β、FSH-β和睾丸LH受体及FSH受体mRNA表达水平(p＜0.01).由此可见,GnRH主动免疫可通过下调垂体GnRH受体、促性腺激素亚基及睾丸LH、FSH受体基因表达,影响垂体-睾丸轴的功能.     

氧化乐果对雄性大鼠生殖毒性及作用机制

为评价氧化乐果在体内的亚慢性生殖毒性,以0（CK）、0.44、1.32和3.97mg/(kg•d).连续染毒大鼠6周。结果显示,氧化乐果能引起雄鼠体重下降,睾丸和附睾及脏器系数极显著增加（P ＜0.01）,睾丸组织病理学改变,尤其引起睾丸曲细精管萎缩、变性,各级生精细胞减少,支持细胞数量减少,间质增宽。降低附睾精子数及附睾精子活力(P ＜0.01 ）,精子畸形率显著升高(P ＜0.05 ）; 降低睾丸组织酸性磷酸酶（ACP）、碱性磷酸酶（AKP）、乳酸脱氢酶（LDH）的活力,增加γ-谷氨酰转移酶（γ-GT）活力（P ＜0.01）和睾酮（T）（P ＜0.01）和卵泡刺激素（FSH）的含量（P ＜0.05）。结合组织病理、性激素、酶活性及精子质量的变化,表明氧化乐果可对雄性大鼠机体产生明显的毒性作用,也具有雄性生殖毒性,其主要靶器官为睾丸。     

山羊钴胺素转运蛋白受体基因CD320的克隆与表达模式

钴胺素转运蛋白受体CD320(cluster of differentiation 320)为低密度脂蛋白受体家族成员,在钴胺素转运过程中发挥重要作用,参与机体多种生理过程的调节。本研究采用RT-PCR克隆山羊(Capra hircus)CD320基因,并对其序列进行生物信息学分析,同时采用q RT-PCR技术分析CD320在成年山羊不同组织(心、肝、脾、肺、肾、卵巢、骨骼肌、睾丸)以及睾丸发育各时期中的表达谱。结果表明,成功克隆获得山羊CD320基因(Gen Bank登录号:MG560828),其c DNA序列全长877 bp,开放阅读框为768 bp,编码255个氨基酸,预测分子量约为27.18 k D;与其他物种同源比对及系统发生分析表明,该基因编码的蛋白在低密度脂蛋白受体A型结构域(low-density lipoprotein receptor type A domains,LDLRA)和跨膜域的核心位点高度保守;CD320在成年山羊各个组织中均有表达,在肺、睾丸、肌肉组织中表达水平显著高于其他组织(P0.01);在睾丸中,随着发育成熟,CD320的表达量持续升高,性成熟期时表达量最高(P0.01),在附睾中不同部位间的表达量也存在差异,整体也以6月龄(性成熟)时表达量最高。本研究表明CD320可能参与了山羊睾丸、附睾的发育和精子生成过程,为进一步探索该基因在山羊生殖细胞发育中的功能奠定了基础。     

天祝白牦牛HSP60基因的克隆及其在下丘脑-垂体-睾丸中的表达定位研究

热休克蛋白60(HSP60)不仅在细胞保护方面发挥作用,也参与雄性动物生殖生理的调控。为研究HSP60基因序列特性及其在天祝白牦牛下丘脑-垂体-睾丸轴(HPT-axis)上的表达情况,探寻其在白牦牛睾丸发育、精子发生过程中的作用机制,本研究采用RT-PCR和RACE技术获得白牦牛HSP60基因全长cDNA序列,采用生物信息学方法分析HSP60蛋白的理化性质、结构及不同物种之间的同源性等,并利用qPCR、Western blotting、免疫组化法分析HSP60在白牦牛下丘脑-垂体-睾丸轴中的表达及定位。结果表明,白牦牛HSP60基因cDNA全长为2 300 bp,开放阅读框为1 722 bp,编码572个氨基酸;其理论分子量为60.977k Da、等电点为5.69,编码的蛋白为非跨膜可溶性蛋白。氨基酸序列比对结果显示,白牦牛HSP60氨基酸序列与牛、瘤牛、绵羊、藏羚羊、骆驼、白犀牛、兔和黑猩猩的氨基酸序列同源性高、进化水平相近。HSP60基因及蛋白在白牦牛的下丘脑、垂体及睾丸组织中均有表达,其中下丘脑及垂体组织表达量显著高于睾丸,下丘脑和垂体之间差异不显著。免疫组化结果显示,HSP60蛋白定位表达于白牦牛下丘脑组织的室旁核大细胞、室旁核小细胞和神经角演网、垂体组织的腺细胞、睾丸组织的精原细胞、精母细胞、支持细胞和间质细胞,而精子细胞中表达较弱。通过对健康成年白牦牛HSP60在下丘脑-垂体-睾丸轴的表达与定位检测,推断HSP60参与雄性白牦牛生殖轴调控,并参与睾丸发育与精子发生。本研究结果为进一步研究HSP60对雄性生殖调控奠定了基础。