胡椒PnNPR1基因的克隆与表达分析

根据胡椒病程相关基因非表达子1(Nonexpressor of pathogenesis-related genes1,NPR1)基因的部分序列设计引物,运用RT-PCR方法获得其家族成员的1个全长c DNA,命名为Pn NPR1,长度1 712 bp,开放阅读框1 362 bp,编码454个氨基酸。预测Pn NPR1分子量为141.56 ku,理论等电点为4.98。该基因含有BTB/POT结构域、ANK锚蛋白重复序列、DUF和NPR1-like C等4个结构域,具有植物NPR1所共有的保守结构域。系统进化分析表明,Pn NPR1与苜蓿的同源性最高。Real-time RT-PCR结果表明,Pn NPR1在胡椒叶片、根、茎和花中均表达,在叶中的表达量最高。辣椒疫霉菌诱导后,Pn NPR1基因的表达量在抗/感2种胡椒中均出现先增加后减少的现象,并且在抗病种质中表达量较高。研究结果为Pn NPR1的功能研究提供了理论依据。     

胡椒PnCAD基因的克隆和表达分析

木质素在植物体中具有运输水分、支撑植株和加强植物体免受侵害等功能,是苯丙烷代谢途径的重要产物之一。其中肉桂醇脱氢酶（cinnamyl alcohol dehydrogenase,CAD）是该途径中重要的限速酶。本研究在胡椒转录组测序的基础上,用RACE法进行克隆,对PnCAD基因全长进行生物信息学分析,并对其蛋白进行理化性质、亚细胞定位和系统进化树等分析;最后运用实时荧光定量PCR进行分析。结果表明：克隆得到CAD基因的全长cDNA,长度为1364 bp,开放阅读框（open reading frame,ORF）为1071 bp,编码356个氨基酸,预测相对分子量为3.879 kDa,等电点为6.27,属于亲水性蛋白;含有3个N-糖基化特征序列和9个磷酸化位点,可能处于细胞质内。结构域分析发现,胡椒CAD蛋白含有NAD(P)结合位点、多个催化锌和结构锌结合位点。系统进化树分析表明,胡椒CAD与细辛CAD6亲缘关系最近,胡椒和细辛的同源性最高为76%,均隶属于比较原始的双子叶植物。通过荧光定量分析发现,黄花胡椒在辣椒疫霉菌侵染下表达量升高,在8 h达到最高值,约为对照的10倍;之后在24 h时出现小幅度升高,约为对照组的6倍,之后下降。‘热引1号’胡椒的表达量在侵染8 h时达到最低,之后缓慢上升。总体来说,所有时间下黄花胡椒基因表达量均高于‘热引1号’胡椒,且差异显著。本研究结果可为今后研究胡椒抗非生物胁迫功能提供参考,为PnCAD基因的功能研究提供理论依据。     

胡椒4-香豆酸：辅酶A连接酶Pn4CL基因的克隆及表达分析

根据胡椒4-香豆酸：辅酶A连接酶（4-coumarate:coenzyme A ligase, 4CL）基因的部分序列设计引物,运用RACE方法获得其家族成员的1个全长cDNA,命名为Pn4cl,长度2130 bp,开放阅读框1638 bp,编码545个氨基酸。预测Pn4CL分子量为59.57 kDa,理论等电点为5.70。该基因含有AMP-binding（AMP-binding enzyme）、CaiC[Acyl-CoA synthetase (AMP-forming) /AMP-acid ligaseⅡ]、PLN02246、AFD-class I等结合域,具有植物4CL所共有的保守结构域。系统进化分析表明,Pn4CL与北细辛的同源性最高,同时与木兰分支类植物的4CL聚类在一起,与菊分支的进化距离较近,与蔷薇分支的进化距离较远。亚细胞定位表明,该蛋白定位在细胞膜上。Real-time RT-PCR结果表明,该基因受外援激素SA和MeJA诱导表达,同时接种辣椒疫霉菌后,Pn4CL基因的表达量在抗/感2种胡椒中均出现先增加后减少的现象,并且在抗病种质中表达量较高。研究结果为Pn4CL的功能研究提供了理论依据。     

胡椒对胡椒瘟的抗性测定

用胡椒瘟菌种Ｐ２接种不同胡椒种质的叶片,根据胡椒瘟发生情况评价各种质叶片的抗瘟性。结果表明,班尼约尔１号、兴热１胡椒叶片表现感病;７３－Ｆ－５叶片表现中等感病;云选１号叶片表现中等抗病。     

小麦ramosa2基因的克隆与序列分析

为了研究ramosa2基因在小麦中的功能,以普通小麦(Triticum aestivum L)中国春基因组为模板,玉米、高梁、水稻和大麦中ramosa2基因保守序列为参考设计引物,扩增到1条全长为771 bp的目的片段.序列分析表明,该核酸序列与高梁、玉米、水稻和大麦中ramosa2基因的同源性高达82.9%～95.2%;其预测编码的氨基酸序列与高粱、玉米、水稻和大麦ramosa2基因的氨基酸序列同源性达79.2%～95%.     

胡椒果与胡椒叶精油化学成分分析

采用水蒸气蒸馏法提取胡椒鲜果、黑胡椒、白胡椒和胡椒叶中的精油,得率分别为1.46%、1.77%、2.30%和1.25%。对精油进行GC-MS分析,分别鉴定得到38、31、36和63种化学物质,δ-榄香烯、3-蒈烯、D-柠檬烯、α-古巴烯、石竹烯和律草烯在果与叶中含量均较高,其中叶中δ-榄香烯含量占38.54%;蒎烯、月桂烯、α-水芹烯和间伞花素在果中含量较高,而在叶中含量较低;甘香烯、α-荜澄茄油烯、β-榄香烯、α-古芸烯、β-古巴烯、α-蛇床烯、花柏烯、4-异亚丙烯-7-甲基-6-亚甲基-2-辛烯酸甲酯和桉油烯醇在叶中含量较高,而果中含量较低或没有。此外,采用电子鼻方法可有效区分胡椒粉和胡椒叶。     

甘蔗ScHTD2基因的克隆及生物信息学分析

D14是一类能够有效抑制水稻分蘖的水解酯酶,可能是独脚金内酯信号传导途径中的重要组分。为研究该基因在甘蔗分蘖性状中的功能,利用RT-PCR和RACE技术从甘蔗主栽品种ROC22中克隆出D14同源基因的c DNA全长,命名为Sc HTD2,并对其进行生物信息学分析。结果表明:Sc HTD2基因的c DNA全长为1 302 bp(KP137674.1),具有927 bp的开放阅读框,编码308个氨基酸;蛋白质分析表明,Sc HTD2为不稳定的水溶性非分泌蛋白,主要作用于氨基酸的生物合成或者作为生长因子调控生物生长发育。亚细胞定位于叶绿体,存在14个磷酸化位点,不存在乙酰化位点和信号肽。二级结构以α螺旋和无规则卷曲为主,还有一些残基形成β-折叠和链延伸。保守结构域和三级结构预测均表明该蛋白包含一个α保守水解酶家族,属"D14-Like"或者"DAD2-Like"蛋白家族。推测Sc HTD2可能作为独脚金内酯调控甘蔗分蘖信号转导中一个具有催化特性的水解脂酶而起作用。进化树分析表明该蛋白与高粱、玉米等单子叶植物进化关系较近。     

化学诱变结合离体选择选育胡椒抗瘟病无性系

在胡椒(PipernigrumLinn.)茎尖丛生芽增殖技术的基础上,以印尼大叶种“LampongType”无菌实生苗作外植体源,采用EMS(ethylmethanesulphonate)对胡椒茎尖进行化学诱变处理,并结合辣椒疫霉(Phytophthoracapsici)培养滤液对胡椒茎尖及其增殖形成的丛生芽进行离体选择。结果表明,利用EMS在胡椒茎尖接种前进行化学诱变可提高抗瘟病变异体的产生频率。利用EMS不同浓度和不同时间对胡椒实生苗茎尖处理后接种,不经离体选择,直接在再生植株上进行抗病检测,抗性植株频率在4.3%￣26.67%之间,而不施用化学诱变的处理则未获得抗性植株。利用不同浓度EMS和不同诱变处理时间结合不同浓度的辣椒疫霉培养滤液离体选择,各种组合所获得的抗性植株比率在33.33%￣100%范围,但各种组合均较EMS和辣椒疫霉培养滤液单独处理的要高,其中以1.0%EMS处理60min结合25%辣椒疫霉培养滤液处理的最好。     

不同杀菌方式对黑胡椒风味品质的影响

以黑胡椒为对象,采用蒸汽杀菌、紫外线杀菌和辐照杀菌的方法,研究了不同杀菌方式对黑胡椒中微生物、胡椒碱、胡椒精油及其组成的影响.结果表明,杀菌处理后黑胡椒中的菌落总数、霉菌均有不同程度的减少,辐照杀菌效果最显著.杀菌处理对黑胡椒的胡椒碱、精油含量及其风味物质组成的影响较大,胡椒碱和精油含量均有不同程度的变化,除辐照处理稍...     

基于基因组和转录组数据的胡椒内参基因鉴定

为系统筛选适合胡椒基因表达模式分析的内参基因,本研究基于胡椒全基因组和转录组数据,初步筛选出62个候选基因。以胡椒主根、芽尖、叶片、花穗、不同发育时期果实以及接种辣椒疫霉菌的主蔓为材料,利用geNorm、NormFinder和BestKeeper软件系统分析候选基因在不同组织中的表达稳定性,结合目标基因的表达模式验证,鉴定稳定表达最优的内参基因为Myeloid leukemia factor 1 (Pn17.1212)。结果表明：该基因是分析胡椒果实发育、辣椒疫霉菌响应相关基因表达模式的理想内参。内参基因的选择不应仅限于持家基因,全基因组和转录组信息可提供更加全面的参考基因数据,内参基因的准确鉴定需综合转录组信息、基因表达稳定性、标记基因的表达模式验证等数据分析的结果,获得的理想内参基因可满足不同研究对表达稳定性的要求。     

胡椒脱皮方法研究进展

胡椒脱皮的方法有浸泡脱皮、机械脱皮、酶法脱皮、生物脱皮等方法。浸泡脱皮属于传统脱皮方法,机械脱皮污染严重,酶法脱皮成本高,生物脱皮是一种绿色环保的脱皮方法。相比传统脱皮法和化学脱皮法,生物脱皮具有提高胡椒质量、无污染等优点。胡椒生物脱皮技术是未来胡椒脱皮的主要发展方向。     

胡椒连作对土壤微生物群落功能多样性与群落结构的影响

连作障碍严重威胁中国胡椒优势种植区可持续发展,而土壤微生物多样性下降、群落结构失衡是连作障碍形成的重要原因之一。为了探明胡椒连作障碍与微生物多样性及群落结构变化之间的关系,揭示胡椒连作障碍形成的微生物机理,本文采用BIOLOG微平板法研究了海南万宁8、18和28 a 3种不同种植年限胡椒园土壤微生物群落功能多样性和群落结构变化。结果表明:随种植年限增加,不同园块之间稳定并达到最大的平均吸光度值(AWCD)呈明显下降趋势;香农指数、香农均匀度等多样性指数亦随种植年限增加呈显著下降趋势,而辛普森优势度指数无显著性差异;微生物群落结构随着年限增加出现了2次明显变化,第1次群落结构变化发生在8~18 a阶段,主要与酚酸类和多聚物类碳源利用微生物大幅减少有关,第2次则发生在18~28 a阶段,与碳水化合物类、氨基酸类、羧酸类和胺类相关利用微生物减少有关。因此,胡椒连作显著降低了土壤中微生物多样性,改变了微生物群落结构,是胡椒连作障碍形成的重要原因之一。     

花生(Arachis hypogaea L.) CaM基因克隆与序列分析

提取花生(Arachis hypogaea L.)幼嫩叶片基因组DNA,合成5'端和3'端引物,进行PCR并克隆测序,得到CaM基因组的2个异型基因PGCaM-1和PGCaM-3,登录Genebank并注册为AY517933、AY572856。序列分析表明,PGCaM-1序列全长1425 bp,在第25个氨基酸之后有一个长度为973 bp的内含子,PGCaM-3序列全长447 bp。两个异型基因的开放读码框均由447个核苷酸组成,共编码148个氨基酸,同属于EF手型CaM超家族成员,核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为96%和98%,与已知花生CaM cDNA序列及氨基酸均有极高的同源性,序列之间的差异可能引起表达和功能上的差异。     

西番莲水通道蛋白PePIP2基因克隆及表达分析

西番莲作为新兴的热带果树,在热带农业中具有非常重要的作用,然而干旱、高温等非生物胁迫严重影响其正常生长发育。相关研究表明水通道蛋白(AQP)能够提高植物的抗逆性,本研究以西番莲‘台农’(Passiflora edulia Sims)为实验材料,利用西番莲的基因组数据,通过同源克隆法从西番莲中克隆得到了一个水通道蛋白基因PePIP2,其开放阅读框(open reading frame,ORF)为861 bp,编码286个氨基酸。对其进行生物信息学分析,其分子式为C₁₄₁₇H₂₁₅₆N₃₆₀O₃₇₃S₈,预测分子量为30 459.37 Da,等电点为8.84,亚细胞定位于细胞膜上。启动子区域分析显示其含有参与胁迫应答的顺式作用元件。对其进行干旱、高盐、低温、高温胁迫下的表达分析,结果表明：PePIP2能够受到干旱、高温和低温胁迫的诱导表达,其中在土壤含水量为50%,在45℃高温处理4 h和0℃低温处理48 h,其表达量最高。在烟草中进行瞬时表达,在不同时间的干旱胁迫处理下,PePI...     

拟南芥AtLACS9基因的克隆及其植物表达载体构建

将大豆种子凝集素基因的启动子(lec)从pBl-lec载体上酶切下来,连接到植物表达载体pCAMBIA3301(p3301)的多克隆位点上,然后运用RT-PCR方法扩增了拟南芥AtLACS9基因的编码区cDNA,并将其克隆到改造后的p3301载体的lec启动子之后,为进一步转化大豆、获得油份含量提高的转基因大豆做准备....