‘红肉蜜柚’果实汁胞粒化与不同组分POD活性的关系

为了研究‘红肉蜜柚’[Citrus grandis(L.)Osbeck.cv.Hongrou miyou]果实汁胞粒化过程中不同结合态过氧化物酶(POD)的变化,以及赤霉素处理对此的影响。以赤霉素处理和未经赤霉素处理的‘红肉蜜柚’果实的近中柱和远中柱汁胞为材料,统计粒化指数后,进行POD提取体系筛选与酶活测定。发现‘红肉蜜柚’果实汁胞粒化指数逐渐上升,有无赤霉素处理无明显变化;可溶性POD最佳提取体系为pH8.0,0.1 mol/L Tris-HCl的缓冲液;离子结合POD的为含0.1%Triton和1 mol/L Na Cl的pH8.0,0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液;未检测到共价结合POD活性。此外,可溶性、离子结合POD活性在生长发育过程中整体呈下降趋势,且无论是否经赤霉素处理,近中柱与远中柱汁胞的可溶性POD活性均存在极显著差异(p0.01),而离子结合POD活性均无显著差异(p0.05);无论近中柱或远中柱,有无赤霉素处理的可溶性POD均存在极显著差异(p0.01),而离子结合POD活性仅在远中柱汁胞中有极显著差异(p0.01)。所以,可溶性POD可能与汁胞粒化关系密切,而离子结合、共价结合POD和赤霉素对汁胞粒化的影响有待进一步研究。     

‘云香’水仙NAC基因克隆及表达分析

从‘云香’水仙转录组文库中筛选出1条NAC基因序列,采用PCR技术克隆得到其c DNA序列。序列分析表明,该NAC基因包含822 bp的开放阅读框,编码273个氨基酸,分子量30 903.9 u,命名为Nt NAC3153(Gen Bank登录号:KU375569)。理化性质分析和多重序列比对显示,Nt NAC3153蛋白是一个无跨膜区域的亲水性蛋白,在N端具有一段保守结构域。系统进化树分析表明,Nt NAC3153与同为单子叶植物的小果野芭蕉Ma NAC、二穗短柄草Bd NAC和小米Si NAC亲缘关系最近。实时荧光定量PCR分析显示,Nt NAC3153基因能够被ABA、盐胁迫和高温诱导表达。研究表明:Nt NAC3153可能参与‘云香’水仙的抗逆调控机制。     

香蕉抗坏血酸过氧化物酶基因的克隆及表达分析

抗坏血酸过氧化物酶(Ascorbate peroxidase, APX)是植物重要的过氧化氢(Hydrogen peroxide, H2O2)清除酶之一。通过RACE(Rapid-amplification of cDNA ends)方法从香蕉根系cDNA均一化全长文库中获得一个抗坏血酸过氧化物酶基因,命名为MaAPX2基因。MaAPX2基因是香蕉APX基因编码框全长cDNA,包含一个750 bp的最大开放阅读框(Open Reading Frame, ORF),编码249个氨基酸的蛋白质。蛋白质序列结构域比对发现,在MaAPX2 N端具有典型的APX活性位点(APLMLPLAWHSA)和过氧化物酶近端血红素配体序列(DIVALSGGHTL)的保守结构域,属于典型的APX蛋白。系统进化树比对分析表明,MaAPX2与马蹄莲ZaAPX(AAC08576.1)的亲缘关系较近。组织特异性研究表明,MaAPX2基因组成型表达于香蕉各个组织,在叶片中表达量最大。在耐病和感病品种中,MaAPX2基因均上调表达,但在耐病品种中MaAPX2基因在所有时间点相对于对照增加的倍数均高于感病品种,表明该基因在香蕉的抗病性中起着重要作用。MaAPX2基因可以作为一个新的响应枯萎病侵染的标记基因。     

秋石斛‘三亚阳光’Actin 的克隆与表达模式分析

本研究克隆了秋石斛‘三亚阳光’（Dendrobium ‘Sonia Hiasakul’）肌动蛋白基因（DenActin）cDNA 全长序列, 并进行了 DenActin 进化地位和表达模式的分析。通过克隆获得的 DenActin cDNA 序列的全长为 1 596 bp,其中开放阅 读框为 1 134 bp,编码 377 个氨基酸,同时通过 gDNA 克隆获得了 DenActin 3′端的一段包含一个内含子的 403 bp 的片 段。序列同源性分析发现该基因序列与 GenBank 中注册的其他植物 Actin 核苷酸序列的同源性均在 85%以上,氨基酸 序列的同源性高达 97%以上。通过最大似然法构建其系统进化树,分析发现 DenActin 与黄石斛 Actin 的亲缘关系最为 密切,并与其他兰科植物归为一大类。半定量 PCR 分析表明,DenActin 在幼苗叶片和中苗茎尖、根、叶片以及成熟植 株的茎、根、叶片、花柄、1 mm 花苞、3 mm 花苞、5 mm 花苞、9 mm 花苞中均稳定表达。秋石斛 DenActin 的克隆和 表达模式分析为秋石斛功能基因的表达分析提供了候选的内参基因,而 3′端包含内含子的 gDNA 片段的克隆为避免实 时定量分析中的 gDNA 污染提供了引物设计的便利。     

马蓝IGPS基因的克隆、表达分析及原核表达

吲哚-3-甘油磷酸合酶(indole-3-glycerol phosphate synthase,IGPS)是广泛参与生物体内色氨酸、生长素等吲哚化合物合成途径中重要的关键酶之一.为了研究BcIGPS在马蓝吲哚类生物碱合成中的作用,基于马蓝转录组数据,通过RT-PCR技术从马蓝中克隆得到IGPS基因序列,命名为BcIG...     

番木瓜果实膨胀素基因部分序列的克隆及分析

膨胀素(Expansin)是一类存在于植物细胞壁上,并能快速缓冲张力,使植物细胞壁松驰的蛋白质。以成熟番木瓜果实总RNA反转录得到的cDNA为模板,设计简并引物进行PCR,得到1个大小为531bp的基因片段,编码177个氨基酸,并存在expansin的保守区域,命名为Cp-EXP1。番木瓜expansin的成功克隆为研究番木瓜的生长发育以及其品种的改良等打下了良好的基础。     

大豆异黄酮合成关键酶基因的克隆及表达分析

采用RT-PCR法克隆了大豆异黄酮生物合成途径中查尔酮合酶(Chalcone synthase,CHS)和查尔酮异构酶(Chalcone Isomerase,CHI)2个关键酶基因,并利用SOE-PCR技术成功将2个基因融合,将其均构建成原核表达载体,在大肠杆菌中进行了初步的表达研究,为进一步研究CHS和CHI 2种关...     

香蕉NPR1E基因的克隆及表达分析

NPR1基因可参与调节植物对病原菌的广谱抗性,在植物系统抗性中起着关键的调控作用。通过RACE(rapid-amplification of cDNA ends)方法从香蕉根系中获得NPR1E基因,命名为MaNPR1E(GenBank登录号分别为：KF582550)。MaNPR1E是香蕉NPR1基因编码框全长cDNA,包含一个1 755 bp的最大开放阅读框,编码一个含584个氨基酸的蛋白质。经蛋白质序列同源比对发现,其含有完整的BTB/POZ结构域、锚蛋白重复ANK序列和NPR1-like-C结构域,属于典型的NPR1蛋白。系统进化树比对分析表明,MaNPR1E与海枣PdNPR3(XP_008808341.1)和油棕EgNPR3(XP_010914123.1)的亲缘关系较近。组织特异性研究表明,该基因组成型表达于香蕉各组织。实时荧光定量PCR分析表明,接种枯萎病菌后MaNPR1E的表达在感病品种中被抑制,而在抗病品种中被激活;MaNPR1E的表达受乙烯利和水杨酸的诱导。上述结果表明,MaNPR1E可能在香蕉抗枯萎病过程中扮演重要的调控角色。     

无核荔枝凝集素基因的克隆与表达分析

应用PCR技术克隆了无核荔枝凝集素(LcLec)基因的部分cDNA(JF920723)和gDNA(JF920724)序列,序列分析表明,获得的cDNA序列含有一个468 bp的完整开放读码框结构,编码含155个氨基酸残基的多肽序列,该氨基酸残基序列与木菠萝家族的甘露糖结合凝集素同源。获得的gDNA序列含有3个内含子,长度分别为124、108和119 bp。荧光定量PCR结果表明,LcLec基因的表达量在无核荔枝果皮发育前期上升,之后下降至稳定水平;在采后果皮衰老阶段,随果皮褐变指数上升LcLec基因表达量上升。     

完全重瓣型山茶花品种‘红十八学士’CjHTM6基因cDNA的克隆与分析

为研究山茶重瓣性状形成分子机理,采用RACE技术从完全重瓣型山茶花品种‘红十八学士’中克隆TM6基因全长cDNA,再利用生物信息学和Real-time PCR技术对其进行分析。结果表明:该基因cDNA全长729 bp,命名为CjHTM6,有一个完整的开放阅读框(627 bp),编码208个氨基酸,蛋白质分子量24.31 ku,理论等电点为9.53,不稳定系数达44.07;编码蛋白为MADS-box蛋白,其预测的二级结构和三级结构主要以α-螺旋为主,其次为无规卷曲,延伸链所占比重最小;与单瓣花型短柄山茶至少有4个氨基酸差异。定量分析结果表明,CjHTM6基因在花中各部均有表达,其中在花心的花瓣中表达量最高,而在苞片中表达量最低。初步表明,CjHTM6基因在山茶重瓣花形成中起重要作用。     

有机肥替代部分化肥改善‘三红蜜柚’树体营养及果实品质

本研究以单施化肥为对照,研究有机肥替代部分化肥对‘三红蜜柚’树体营养及果实品质的影响。结果表明：与对照相比,有机肥替代20%化肥处理可显著提高‘三红蜜柚’叶片镁、锌含量,降低叶片氮含量至适宜水平;提高‘三红蜜柚’发育过程中果实钾、钙、锌、硼含量,降低果实磷含量;并显著提高果实可溶性固形物含量、总糖含量及糖酸比,降低果实可滴定酸含量,而维生素C含量、可食率和单果质量等与对照相比未呈现显著差异。因此,有机肥替代20%化肥可提高‘三红蜜柚’叶片部分矿质营养元素含量,改善树体营养水平,提高‘三红蜜柚’果实钾、钙、锌、硼等矿质元素含量及果实品质。     

香草兰VpLFY基因的克隆与表达分析

花分生组织特征基因LEAFY在植物花芽分化与成花诱导途径中起着重要的调控作用。通过RACE方法从香草兰中克隆VpLFY基因的全长cDNA序列。结果显示,该基因包含一个1 493 bp的开放阅读框,编码491个氨基酸残基。经蛋白质序列同源比对分析结果发现,VpLFY属于FLO-LFY家族。组织特异性研究结果表明,VpLFY基因在香草兰组织中属于组成型表达。荧光定量分析结果表明,VpLFY基因分别在香草兰纯花芽和混合花芽的不同发育阶段中有着较强的表达。     

茶树几丁质酶基因的克隆及其在干旱胁迫下的表达分析在干旱胁迫下的表达分析

以铁观音茶树叶片为材料,利用逆转录PCR及RACE法,克隆了茶树几丁质酶基因CsChi(GenBank登录号为KR078345).CsChi基因的cDNA全长为1 192 bp,包含972 bp的开放阅读框(ORF),编码323个氨基酸.生物信息学分析结果表明,CsChi蛋白的分子量为34.33 ku;理论等电点pI为8.44;原子组成为C1519H2285N413O464S18,总原子数为4 699;蛋白质结构分析显示该蛋白有6个蛋白的跨膜区域,属于跨膜蛋白;存在于细胞外;没有卷曲螺旋结构存在;CsChi基因编码的蛋白属于糖苷水解酶19家族,含有保守的ChtBD1结构域,与溶菌酶的保守结构域类似,可能兼具几丁质酶活性和溶菌酶活性,qPCR定量分析结果显示在不同干旱胁迫处理下茶树的CsChi基因的表达量,与对照组相比有所增加.推测CsChi基因在茶树干旱等逆境胁迫中起重要作用.     

番茄SlAGO7基因的克隆及表达分析

根据番茄基因组数据库中AG07的EST序列信息,利用RACE和PCR技术从番茄花cDNA和叶基因组DNA中分别克隆S/A G07的cDNA全长序列和基因组序列,用生物信息学方法对其基因序列特征进行分析;利用Real-time PCR分析S/AG07在整个生长与发育过程中的时空表达模式.结果表明,SlAG07的cNDA全长片段为3 238 bp(GenBank登录号:JX467714),含有3 003 bp的完整开放阅读框,编码1 000个氨基酸,共包含3个外显子和2个内含子.所编码的氨基酸序列含有两个高度保守的PAZ和PIWI结构域,具有典型的AGO类蛋白的结构特征;与已报道的AGO7蛋白序列有较高的同源性;SlAG07基因属于AGO蛋白家族中ZIPPY/AG07亚族.SlAG07在营养组织叶中微弱表达,主要集中在根和茎表达;而在生殖器官花中强烈表达,表达丰度从花蕾到盛开的花呈递增趋势,但在果实不同发育时期中表达都非常微弱甚至不表达.由此推测,SlAG07蛋白可能与番茄花器官的发育相关.这为进一步研究该基因通过ta-siRNA干扰途径来调控番茄花器官发育形成的分子机制奠定了基础.     

大豆GmNCED1基因的克隆及表达模式分析

本研究以抗逆性强的大豆旱碱一号为材料,首次从中克隆了编码9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶（9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase,NCED）的GmNCED1基因全长cDNA片段,该基因编码区含有1 836个核苷酸,编码611个氨基酸。通过同源性比对分析发现GmNCED1与花生、菜豆等双子叶豆科植物NCED的同源性高达84%以上。同时,利用荧光定量PCR分析发现高盐、低温、干旱、外源ABA以及NAA处理均可以诱导该基因在大豆叶片及根中表达。本研究初步揭示GmNCED1基因在植物逆境胁迫中的作用,为基因工程育种提供优质的候选基因。     

橡胶树COP9家族基因的克隆及表达分析

COP9信号小体（CSN）是进化上保守的蛋白复合体,在茉莉酸信号途径中起着重要的作用。橡胶树的乳管是一种特化的细胞器,是天然橡胶合成和储存的场所。现有的证据表明橡胶的生物合成可能受到茉莉酸信号途径的调控,但是对于茉莉酸信号途径调控天然橡胶的生物合成还了解的不够。本研究采用RACE技术结合RT-PCR从胶乳中克隆了8个CSN基因的全长cDNA序列,根据与拟南芥的相似性,分别命名为HbCSN1~HbCSN8。荧光定量PCR结果显示,8个CSN基因均能在树皮、不同发育时期的叶片、胶乳、雄花和雌花中表达,其中HbCSN5在胶乳中的表达量最高,其他成员在叶片中的表达量最高。而且,部分HbCSNs基因在胶乳中的表达受到割胶和茉莉酸甲酯处理的上调表达。因此,推测这些上调表达的成员可能参与胶乳的茉莉酸信号途径。     

茶树GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶基因cDNA全长的克隆与表达分析

抗坏血酸（Vc）是重要的抗氧化剂,在茶树体内的各种生理代谢及抵御非生物胁迫中起重要作用,Vc含量关系到绿茶品质优劣。GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶（GMP）是茶树Vc生物合成途径中的关键酶之一。本研究通过RACE-PCR方法从茶树中克隆了GMP cDNA全长序列,共计1510βbp,其中包含1β086βbp的开放阅读框（ORF）,编码361个氨基酸,推测蛋白分子量为39.599βkDa。BLAST分析表明,茶树GMP基因氨基酸序列与猕猴桃的亲缘性最高,达到96%。实时定量PCR分析表明,茶树新梢芽下第三叶中GMP基因表达量最高,嫩茎中最低,不同品种茶树新梢叶片中表达量存在明显差异。高温胁迫初期,GMP基因表达量及抗坏血酸含量迅速升高,然后逐渐下降且均低于同期对照。     

芒果乙烯响应转录因子MiERF113基因的克隆及表达分析

芒果（Mangnifera indica L.）是著名的热带水果,深受消费者的喜爱。我国是世界第二大芒果生产国,其中广西为全国最大的芒果产区。芒果是典型的呼吸跃变型水果,其果实在采摘后因乙烯大量释放容易软化腐烂,导致货架期短,影响产业的发展。乙烯响应转录因子（ethylene response factor, ERF）是乙烯信号通路中的关键基因,参与果实内源乙烯合成的信号转导。为了探究ERF在芒果果实采后成熟调控的作用机制,以‘台农1号’芒果为研究对象,依据前期完成的芒果转录组数据结果,筛选并克隆得到1个ERF基因（MiERF113）,利用生物信息学方法分析MiERF113的基本理化特征、保守结构域、蛋白质结构、进化关系等;利用实时荧光定量PCR（qPCR）技术对MiERF113基因在芒果采后不同贮藏时期的特异性表达进行分析。结果表明：MiERF113基因的开放阅读框（ORF）长度为681 bp,编码227个氨基酸,预测蛋白质分子量为25.61 kDa,理论等电点（pI）为6.07,总平均亲水性为-0.883,有32个磷酸化位点,无跨膜螺旋结构,无信号肽。蛋白质结构域预测MiERF113蛋白仅含有1个保守的AP2结构域,且该结构域中第14和19位氨基酸分别为丙氨酸和天冬氨酸,符合ERF亚家族的典型结构特征。将芒果与拟南芥、猕猴桃、阿月浑子、苹果、柑橘和茶树的ERF氨基酸序列进行进化分析,发现MiERF113与阿月浑子ERF113的同源性较高,亲缘关系最近。利用qPCR检测MiERF113基因在芒果采后不同贮藏时间果皮和果肉部位的表达情况,结果显示,MiERF113基因在果皮和果肉中均有表达,且随着果实不断成熟其表达量在逐渐增加,在采后贮藏12 d时表达量达到最高。本研究为揭示MiERF113基因在芒果采后成熟过程中的调控作用提供理论依据。     

大豆GmAMS基因及其启动子的克隆和表达分析

bHLH(basic Helix-Loop-Helix)转录因子在植物雄配子发育中具有重要的调控作用。为探究bHLH转录因子在大豆花发育中的作用,以大豆细胞质雄性不育系NJCMS5A的花芽cDNA和叶片DNA为模板,通过RT-PCR克隆得到具有典型bHLH结构域的GmAMS基因及其启动子区域,并进行生物信息学分析和时空表达分析。生物信息学分析结果显示GmAMS基因的编码区序列全长为1 716 bp,编码571个氨基酸。亚细胞定位预测GmAMS位于细胞核中。荧光定量分析结果显示,相对于保持系NJCMS5B,在不育系NJCMS5A的花芽中GmAMS基因的表达水平显著下调。组织化学染色结果表明GmAMS启动子驱动的GUS蛋白主要集中在转基因拟南芥的幼小花药中表达。研究结果为进一步探究GmAMS在大豆花发育中的生物学功能和调控机制奠定了基础。     

茶树硝酸根转运蛋白基因NRT2.5的克隆及表达分析

通过RACE克隆从茶树[Camellia sinensis (L.)]叶片中获得NRT2.5基因cDNA全长序列。所得基因序列全长为2 457 bp,其中开放阅读框为1 362 bp,编码454个氨基酸,推测蛋白分子量为48.7 kD,理论等电点为9.63。生物信息学分析表明,该基因与可可树、拟南芥等的NRT2.5基因具有高度同源性,且其编码的蛋白质具有NRT家族共有的结构特征。实时定量PCR分析表明,NRT2.5基因在茶树不同组织中均有表达,但主要在成熟叶和根中表达;不同氮浓度处理后,茶树NRT2.5基因在低浓度下的表达量高于高浓度下。