影响Fat-1转基因水牛胚胎发育因素的研究

本试验比较了水牛卵母细胞体外受精后注射外源DNA的时间(5~6、9~10、13~14、17~18、21~22 h)和外源DNA的浓度(10、50、100 μg/mL)对Fat-1转基因水牛胚胎的发育影响。结果显示,9~10 h组的胚胎表达率和囊胚表达率最高,其中胚胎表达率极显著高于5~6 h组,囊胚表达率极显著高于21~22 h组(P<0.01);在浓度试验中,50 μg/mL浓度组的胚胎表达率和囊胚表达率最高,且极显著高于100 μg/mL(P<0.01)。     

脂质体法转染水牛肾脏成纤维细胞条件的优化

试验旨在研究脂质体介导基因转染水牛肾脏成纤维细胞时如何获得较高的转染效率。本研究将以绿色荧光蛋白基因为标记基因,利用Lipofectamine LTX介导外源DNA转染水牛肾脏成纤维细胞,探讨脂质体用量、质粒用量、质粒大小、转染时间、细胞初始接种密度对转染效率的影响。结果表明,4 μg pmaxGFP质粒DNA与4 μL脂质体转染6 h,其细胞活性达98%,可获得较满意的转染效率。     

SYBR Green实时定量PCR检测转Fat-1基因水牛体细胞方法的建立

荧光定量PCR是近些年发展起来的一项新技术,可用于检测外源基因的整合拷贝数、临床诊断、食品安全和动物疾病检测等领域,具有广阔的应用前景。本文构建了携带Fat-1基因的标准品质粒,以SYBR Green为荧光染料,进行实时荧光定量PCR反应,建立标准曲线,并结合绝对定量法检测Fat-1基因在水牛耳缘和肾脏成纤维细胞基因组中的整合拷贝数。结果表明,转Fat-1基因的水牛体细胞的Ct值与起始拷贝数对数的回归方程为:y=-3.43x+31.01,R2为0.998 7,反应效率为99.5%,具有良好的重复性。本文建立的这种高效检测水牛体细胞基因组中外源基因拷贝数的方法,为后期转Fat-1基因水牛的表达分析和检测等研究奠定基础。     

成纤维细胞的不同处理对水牛亚种间核移植效果的影响

本文探讨了成纤维细胞的不同处理对水牛亚种间核移植的影响。试验设置3个组:对照组、接触性抑制组及血清饥饿组。结果:对照组在融合率、分裂率上均显著低于血清饥饿组及接触性抑制组(63.0%vs 73.0%、77.0%,43.8%vs 49.9%、50.0%)(P<0.05)。但血清饥饿组和接触性抑制组之间的融合率、分裂率差别不显著(73.0%vs 77.0%,49.9%vs 50.0%)(P>0.05)。这3个处理组之间的囊胚率差异不显著(7.0%,7.6%,9.5%)(P>0.05)。以上表明:对成纤维细胞进行处理可以提高水牛亚种间核移植的效率。     

不同年龄水牛成纤维细胞DNA甲基化与组蛋白乙酰化水平分析

实验旨在探讨不同年龄水牛成纤维细胞的增殖能力、DNA甲基化和组蛋白乙酰化水平,为水牛体细胞克隆中供体细胞的选择提供理论依据.利用细胞组织块培养法分离培养3月龄胎儿水牛、新生水牛、10岁龄水牛的耳部成纤维细胞,通过绘制细胞生长曲线、细胞免疫荧光和qRT-PCR方法分析细胞增殖能力和DNA甲基化、组蛋白乙酰化水平.结果表明...     

Scriptaid联合5-Aza-CdR对水牛成纤维细胞DNA甲基化和组蛋白乙酰化修饰的影响

旨在探讨Scriptaid和5-Aza-CdR共同处理水牛耳部成纤维细胞(buffalo adult fibroblasts,AFs)对细胞生长特性、DNA甲基化和组蛋白乙酰化的影响,为提高水牛体细胞重编程效率提供一定的理论基础。首先使用不同浓度的Scriptaid(0,0.05,0.10μmol/L)和5-Aza-CdR(0,0.02,0.10μmol/L)分别处理AFs,筛选出最佳处理浓度后联合处理AFs 24h。随后采用免疫荧光染色技术分析联合处理后细胞的DNA甲基化和组蛋白H3K18乙酰化变化情况,并使用实时荧光定量PCR(QPCR)技术对其甲基化和乙酰化相关基因的表达进行检测。结果发现,适宜浓度的Scriptaid(0.05μmol/L)和5-Aza-CdR(0.02μmol/L)对细胞正常的形态、生长无显著影响。与对照组相比,联合处理后AFs中DNA甲基化水平显著降低,而组蛋白H3K18位点的乙酰化水平显著上升(P0.05)。QPCR分析结果显示,联合处理后AFs中的DNA甲基化相关基因Dnmt1、TET1和TET2的表达水平均出现下调,其中Dnmt1的表达水平显著低于对照组(P0.05);组蛋白去乙酰化酶HDAC1和HDAC2的表达水平也出现下调,其中HDAC1下调显著(P0.05);而组蛋白乙酰化转移酶CBP,P300和HAT1的表达水平出现上升,其中P300和HAT1的表达水平显著高于对照组(P0.05)。结果表明,适宜浓度的Scriptaid(0.05μmol/L)和5-Aza-CdR(0.02μmol/L)联合处理AFs,对细胞形态和生长无显著影响,但可以有效降低细胞甲基化水平并提高组蛋白H3K18位点的乙酰化水平。     

不同浓度的组蛋白去乙酰化酶抑制剂Scriptaid对水牛胎儿成纤维细胞生长及其组蛋白乙酰化修饰的影响

研究旨在探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂Scriptaid对水牛胎儿成纤维细胞（BFF）生长特性、细胞毒性及其组蛋白H3K18乙酰化修饰的影响,为今后研究供体细胞的重编程及提高水牛核移植效率提供一定的理论依据。试验采用不同浓度（0、250、500、750 nmol/L）的Scriptaid分别处理BFF后观察细胞的生长形态,然后利用台盼蓝染色法检测细胞的存活率,同时通过细胞免疫组化技术分析细胞组蛋白H3K18乙酰化的表达情况。结果发现,BFF经不同浓度的Scriptaid处理后,细胞形态没有显著变化,为长梭形、立体感较强,生长曲线与对照组相似,均呈“S”型分布,且各处理组细胞的存活率与对照组之间差异不显著（P＞0.05）;此外,Scriptaid处理组的细胞组蛋白H3K18乙酰化的相对荧光强度显著高于对照组（P＜0.05）,其中500和750 nmol/L 2个处理组细胞组蛋白乙酰化水平显著高于250 nmol/L处理组（P＜0.05）,而500和750 nmol/L 2个处理组之间差异不显著（P＞0.05）。可见,适合浓度的Scriptaid对BFF细胞形态和存活率影响不大,且能显著提高BFF的组蛋白乙酰化水平。     

两种制备鸡胚成纤维细胞的方法比较

在伪狂犬病活疫苗和法氏囊病毒GT株生产上均需制备鸡胚成纤维细胞.在制备鸡胚成纤维细胞过程中,对用连续消化法与玻璃珠分散法两种方法进行比较,结果表明:用玻璃珠分散法制备细胞,易使死亡细胞数大幅增加,在生产中加大成本,并在旋转培养中,影响活细胞的贴壁及生长;而采用胰酶连续消化法制备的细胞,贴壁较好、成活率高,但比前者工作量大;结合两者优点,找出了制备鸡胚成纤维细胞最佳的方法.     

牦牛成纤维细胞敲低HO-1基因后对相关基因表达的影响

血红素加氧酶1(heme oxygenase1,HO-1),是血红素分解代谢过程中的限速酶,起到重要的抗氧化损伤作用,HO-1活性的改变直接影响抗氧化损伤能力的变化。为研究HO-1基因在牦牛高海拔低氧适应的氧化损伤功能,通过构建HO-1基因的siRNA序列,转染牦牛胎儿成纤维细胞,试验前期发现HO-1基因过表达后与CYGB(胞红蛋白)、eNOS(内皮型一氧化氮合酶)基因相关。通过qRT-PCR和蛋白免疫印记(Western blot)检测转染HO-1 siRNA序列的牦牛成纤维细胞在正常条件和低氧条件(5%氧气)下0,24,48,72 h相关基因和蛋白表达变化。结果显示:siRNA转染牦牛成纤维细胞后,试验组HO-1的表达量显著低于空白组和阴性组(P0.01),试验组CYGB表达量也低于空白组和阴性组(P0.01),且HO-1、CYGB蛋白表达量在72 h最低,试验组eNOS mRNA表达量显著低于空白组和阴性组,eNOS蛋白未见表达。结果揭示:牦牛成纤维细胞敲低HO-1基因后,HO-1基因和蛋白表达量明显下调,且对携氧蛋白CYGB及eNOS信号通路的表达具有相同的影响。该结果为牦牛HO-1的功能及其在牦牛缺氧保护机制的研究提供理论依据。     

不同方法制备鸡胚成纤维细胞的比较试验

采用传统法、半胚法和全胚法制备鸡胚成纤维细胞(CEF)单层。结果表明:在同等条件下,均以成纤维细胞为主,并伴有少量的上皮细胞,仅有全胚法含有极少量的肝细胞;培养时细胞贴壁和生长状况无明显差异,其产量稍有差异(全胚法>半胚法>传统法)。     

小鼠胚胎成纤维细胞饲养层制备条件的研究

为了建立活力稳定的小鼠胚胎成纤维细胞饲养层,本实验以13．5～14．5d的ICR小鼠胚胎为实验材料,以MTT法测定细胞活力,探讨了不同浓度的丝裂霉素C、丝裂霉素C不同处理时间及不同的成纤维细胞接种密度对MEF活力的影响。结果表明：10μg／ml的丝裂霉素C处理后的MEF活力比其他浓度（1μg／ml、5μg／ml、20μg／ml、30μg／ml）丝裂霉素C处理后的MEF活力稳定;用10μg／ml的丝裂霉素C处理2．5h,MEF活力比处理1．5h、3．5h、4．5h稳定;以2．5～35×10^5／ml密度接种于96孔板上,每孔200μl,MEF活力较接种密度为1．5×10^5／ml、4．5×10^5／ml、7．5×10^5／ml稳定。结论：用10μg／ml丝裂霉素C处理MEF 2．5h,2．5～3．5×10^5／m;密度接种于96孔板上,每孔200μl,以10％的胎牛血清培养液培养能得到活力稳定高效的小鼠胚胎成纤维细胞饲养层。     

体细胞核移植生产转ω-3脂肪酸去饱和酶基因(sFat-1)的猪胚胎

本研究通过脂质体介导的方法将来源于线虫C.Briggsae的ω-3脂肪酸去饱和酶基因（sFat-1）转染至大白猪胎儿成纤维细胞。采用600μg&#183;mL^-1G418药物浓度,经连续10 d筛选及PCR、RT-PCR鉴定,获得11个转基因阳性细胞克隆。以体外成熟42 h的猪卵母细胞与转基因细胞构建重构胚。经体外培养后观察,转基因克隆胚胎与非转基因胚胎的卵裂率（76.6%&#177;4.1%vs.81.6%&#177;3.1%）和囊胚率（10%&#177;1.97%vs.9.7%&#177;1.4%）均无显著差异（P〉0.05）。采用放线菌酮进行化学二次激活时,胚胎的囊胚率显著高于采用电二次激活胚胎（20.6%&#177;0.89%vs.10%&#177;1.97%,P〈0.05）,但二者的卵裂率并无显著差异（72.4%&#177;4.96%vs.76.6%&#177;4.1%,P〉0.05）。研究表明,通过脂质体介导的方法,可以获得转sFat-1基因大白猪胎儿成纤维细胞系;以该细胞系为核供体构建的转基因克隆胚胎与非转基因克隆胚胎的发育能力无显著差异;二次激活采用放线菌酮进行化学激活能够显著提高胚胎的囊胚发育率。     

影响制备小鼠胎儿成纤维细胞饲养层的因素

为了建立活力稳定高效的小鼠胎儿成纤维细胞饲养层,实验以13.5~14.5 d的ICR小鼠胚胎为实验材料,以MTT法测定细胞活力,探讨了用丝裂霉素C处理MEF后,含有不同浓度胎牛血清的培养基对MEF活力的影响,以及不同传代次数的MEF对其活力的影响。结果表明:用含10%的胎牛血清培养液培养丝裂霉素C处理后的MEF,其活力比含2%、5%、20%的FBS培养液稳定。对不同传代次数的MEF进行处理后,第1、3代的MEF活力比第5、7代的MEF活力稳定。结论:用丝裂霉素C处理第1到第3代的MEF,以10%的胎牛血清培养液培养能得到活力稳定高效的小鼠胎儿成纤维细胞饲养层。     

室温消化法制备鸡胚成纤维细胞的试验研究

鸡胚组织是组织培养最早被利用的对象。早年组织培养工作者，如Carrel等曾用鸡胚做过大量研究工作。目前，鸡胚成纤维细胞已被广泛应用于细胞和分子生物学研究的许多方面，这主要是由于成纤维细胞是最易培养的细胞，其良好的耐受性使之易于进行从基因转染到微注射等较多领域的研究。本试验经长期摸索、比较、找到一种制备鸡胚成纤维细胞的优化方法——室温消化法。     

丝裂霉素C对ICR小鼠胚胎成纤维细胞饲养层制备的影响

目的：探索不同浓度的丝裂霉素c（MMC）处理对ICR小鼠胚胎成纤维细胞饲养层制备的影响,用于分离和培养干细胞。方法：取13．5d胎龄ICR鼠胚分离原代成纤维细胞,利用不同浓度MMC处理胚胎成纤维细胞制备饲养层,比较观察MMC对细胞增殖的抑制作用,制作细胞生长曲线;取妊娠3．5d的ICR小鼠胚胎在不同浓度MMC处理的饲养层上培养,观察胚胎贴壁和增殖情况。结果与结论：胎儿成纤维细胞贴壁生长,增殖迅速,6代后细胞逐渐衰老;MMC能有效抑制胎儿成纤维细胞的增殖,最佳处理方法为20μg／ml、2h。妊娠3．5d的ICR小鼠胚胎在10、20μg／mlMMC处理的饲养层上孵出率和贴壁率显著高于5／Lg／mlMMC处理的饲养层,在5、10和20μg／m[MMC处理的饲养层上,内细胞团增殖率无显著差异。因此,ICR小鼠胚胎成纤维细胞最佳处理方法为20μg／mlMMC作用2h。     

IGF-1毛囊特异表达载体的构建以及转染绒山羊胎儿成纤维细胞的研究

本研究旨在构建绵羊胰岛素样生长因子1(IGF-1)毛囊特异表达载体pCDsR-KI,并转染绒山羊胎儿成纤维细胞,最终获得稳定表达红色荧光并可用于核移植的转基因细胞克隆.通过RT-PCR方法获得IGF-1 cDNA,其与KAP6-1基因启动子片段以及红色荧光蛋白表达元件连接构成IGF-1毛囊特异表达载体pCDsR-KI(大小7.4 kb).以组织块贴附法分离和培养绒山羊胎儿成纤维细胞,外源性表达载体以lipofectamineTM 2000介导转染所培养的第2代成纤维细胞,在DMEM/F12+10%FBS、37℃、5%CO2中培养,并添加G418筛选,获得了表达红色荧光蛋白的细胞克隆.经PCR法鉴定证实外源基因已经整合在细胞基因组中.通过分析转基因体细胞的生长曲线和染色体核型证明转基因细胞的生长状态良好、各项参数趋于正常.为下一步通过体细胞核移植技术获得转基因克隆绒山羊准备了核供体细胞.     

成纤维细胞生长因子-5在安哥拉鼠皮肤毛囊的作用研究进展

在鼠中,有70多种基因突变影响被毛形态,许多突变对被毛的长度无影响,有些使被毛变短,到目前为止只有一种突变即angora鼠(最初命名为go基因突变)引起被毛变长。这一突变现象引起了众多学者的兴趣,目前已研究证明安哥拉鼠是由成纤维细胞生长因子-5(FGF-5)突变引起的,一系列实验表明FGF-5是影响毛囊周期性活动及被毛生长的很重要的生长因子。现将FGF-5在鼠上的研究作一综述,为该基因在其它动物尤其是绵羊和山羊上的研究和应用提供参考。     

敖汉细毛羊Notch1基因真核表达载体的构建及在成纤维细胞中表达量的研究

本研究旨在构建敖汉细毛羊Notch1基因表达载体及转染成纤维细胞后基因表达量变化。试验以敖汉细毛羊40日龄胎儿为研究对象,提取RNA反转录并参照Gen Bank中Notch1基因序列信息设计1对引物,通过PCR反应扩增获得Notch1基因片段,将得到的Notch1基因片段连接至pGM-T载体,构建pGM-T-Notch1克隆载体并转化大肠杆菌(E.coli) DH5α感受态细胞,提取质粒进行酶切鉴定后构建pcDNA3.1-Notch1重组表达载体,转化大肠杆菌(E.coli) DH5α感受态细胞。将敖汉细毛羊的成纤维细胞进行分离培养,并将构建的pcDNA3.1-Notch1瞬时转染成纤维细胞,利用荧光定量PCR技术检测Notch1基因在成纤维细胞中表达量的变化。结果显示:经酶切、测序鉴定质粒pcDNA3.1-Notch1构建成功,并且转染成纤维细胞后Notch1基因的表达量升高,且转染组的表达量极显著地高于对照组(P0.01)。结论:成功构建了敖汉细毛羊Notch1基因的表达载体,并且成功转染成纤维细胞,基因表达量明显升高,结果可为进一步研究其功能奠定基础。     

牛胎儿皮肤成纤维细胞的分离培养及转染Ipr1基因

为了为核移植提供供体细胞,本研究构建了真核表达载体PEGFP-SRA-Ipr1,并研究了牛胎儿皮肤成纤维细胞的体外分离培养,进行了Ipr1基因转染.克隆Ipr1基因和SR-A启动子,并构建了巨噬细胞特异性真核表达载体.用组织块贴壁法分离培养牛胎儿皮肤成纤维细胞,在体外经传代、纯化后,用电穿孔法将真核表达载体PEGFP-SRA-Ipr1转染至经体外纯化的第4～10代牛胎儿成纤维细胞,24 h后观察荧光表达,48 h后加入600μg·mL-1 G418,筛选1周,300 p.g·mL-1持续筛选,然后挑选单克隆,继续扩大培养.对稳定转染的牛胎儿成纤维细胞进行PCR检测和核型分析.结果,转染24 h后有绿色荧光蛋白表达,并经G418筛选获得稳定转染PEGFP-SRA-Ipr1的牛胎儿成纤维细胞株,经PCR检测在大约1500 bp处有目的片段,经流式细胞仪分析转染细胞染色体倍型未发生变化,仍是二倍体.说明目的基因已经成功整合,同时保持了遗传稳定性.可以作为核移植进行转基因克隆牛研究.     

小鼠胚胎干细胞成纤维细胞饲养层的制备

胚胎干细胞(embryonic stem cells,ES)是动物体内最原始的细胞,它具有很强的再生、分化能力,在干细胞因子和多种白细胞介素的联合作用下可繁殖分化成各类细胞.为了获得能够稳定传代的干细胞,需要制备饲养层.笔者等以小白鼠胎儿成纤维细胞为材料,通过原代、继代培养,经丝裂霉素C处理,进行饲养层的制备.现报道如下.