‘阳光玫瑰’葡萄试管苗热处理结合茎尖和腋芽培养脱毒技术研究

为进一步优化葡萄试管苗脱毒体系,以携带葡萄蚕豆萎蔫病毒（GFabV）、沙地葡萄茎痘相关病毒（GRSPaV）、葡萄灰比诺病毒（GPGV）、葡萄卷叶相关病毒–3(GLRaV-3)和葡萄病毒E(GVE)共5种病毒的‘阳光玫瑰’葡萄试管苗为材料,研究了热处理方式和时间以及热处理后茎尖和腋芽培养对脱毒的影响。结果表明,热处理方式影响试管苗的存活率和脱毒效率,以38℃/光照8 h+32℃/黑暗8 h变温处理效果最佳,其次为38℃/光照16 h+32℃/黑暗8 h变温处理以及38℃恒温/（光照16 h+黑暗8 h）处理。取38℃/光照8 h+32℃/黑暗8 h热处理10、15、20、25、30和40 d的试管苗1.5 mm左右的茎尖和茎尖下第1、2腋芽接种培养,茎尖存活率高于腋芽,繁殖成苗后检测,均脱除了上述5种病毒,其中热处理10 d的平均脱毒率为52.38%,25和30 d的脱毒率均达100%;随热处理时间延长,接种茎尖和腋芽的存活率下降,故热处理时间以25 d为宜。     

葡萄病毒病研究进展

综述了近5年来国际葡萄病毒病最新确立的病毒属、鉴定的新种及几种重要葡萄病毒形态、基因组、病原、病毒检测技术及防治策略。葡萄病毒已由1999年的17个属,47种增加到2003年的20个属,55种。其中葡萄病毒属(Vitivirus),凹陷病毒属(Foveavirus)、葡萄斑点病毒属(Maculavirus)和葡萄卷叶病毒属(Ampelovirus)为新确定的4个属。已完成葡萄扇叶病毒(GFLV)和葡萄斑点病毒(GFkV)的全序列测序(2001年)。新发现葡萄卷叶相关病毒-9号(GLRaV-9)(2002年)。新增加GLRaV-8和葡萄D病毒(GVD)的单克隆抗体和沙地葡萄茎痘相关病毒(GRSPaV)的多克隆抗体。RT-PCR技术已成功地应用于GRLaV-1、GRLaV-2、GRLaV-3、GRLaV-4、GRLaV-5、GRLaV-6、GRLaV-7、GVB、GVA、GVD、GRSPaV、葡萄拟卷叶病毒(GFkV-likeviruses)、GFLV和南芥菜花叶病毒(ArMV)等病毒及葡萄病毒属(Vitivirus)和凹陷病毒属(Foveavirus)病毒的检测。GFLV、ArMV、GVA及GVB和GVA、GFLV、GLRaV-2、GLRaV-3外壳蛋白(CP)基因已分别导入到欧洲葡萄(Vitisvinifera)和沙地葡萄(Vitisrupestrsis)及其他砧木中,目前仍在检测阶段。     

‘阳光玫瑰’葡萄组培脱毒快繁技术研究

【目的】培育‘阳光玫瑰’葡萄组培脱毒苗木,初步建立‘阳光玫瑰’葡萄组培脱毒快繁技术体系。【方法】采用MS为基本培养基,以植物生长调节剂6-BA、NAA和IBA为变量,接种后‘阳光玫瑰’葡萄组培苗的生长状况为因变量;通过热处理结合茎尖培养技术,在32℃预热处理7 d,再逐渐升温至37℃热处理30 d后,剥取茎尖进行培养,待获得完整植株时,利用RT-PCR检测方法对‘阳光玫瑰’葡萄组培苗进行病毒检测。【结果】‘阳光玫瑰’葡萄嫩茎段外植体经75%乙醇30 s+0.1%氯化汞8 min处理,外植体的污染率和褐化率最低;经消毒灭菌的外植体接种到添加含有6-BA和NAA的MS培养基上诱导萌发,在1.5 mg·L~(-1)6-BA和0.2 mg·L~(-1)NAA的培养基上萌芽率最高;将启动培养获得的无菌新芽,接种到含有6-BA和NAA的MS培养基中进行继代培养,在1.0 mg·L~(-1)6-BA+0.1 mg·L~(-1)NAA的培养基中单芽增殖效果最明显;把继代培养中生长健壮的单芽切下,转入添加IBA和NAA的1/2 MS培养基中进行生根培养,在添加0.4 mg·L~(-1)IBA和0.2 mg·L~(-1)NAA的1/2 MS培养基上生根效果最佳;采用热处理结合茎尖培养进行‘阳光玫瑰’葡萄组培苗的脱毒处理,热处理植株的成活率为78%,茎尖成活率为60%,经检测,再生植株不带葡萄卷叶病毒1(GLRaV-1)、葡萄卷叶病毒3(GLRaV-3)、葡萄病毒A(GVA)、葡萄斑点病毒(GFkV)、葡萄扇叶病毒(GFLV)。【结论】初步建立了‘阳光玫瑰’葡萄组培脱毒快繁技术体系,为‘阳光玫瑰’葡萄组培脱毒苗的工厂化生产提供了技术支撑。     

基于RT-PCR检测对6个香味葡萄品种感染病毒状况的分析

为明确我国6个香味葡萄品种感染病毒的状况,2018—2019年采用RT-PCR方法,对来源于13个省(市、自治区)的212个样品进行了14种葡萄病毒的检测。结果显示:‘阳光玫瑰’‘玫瑰香’‘巨峰’‘夏黑’‘水晶葡萄’‘着色香’的带毒株率分别为93.22%、67.74%、82.98%、63.33%、27.27%、43.48%;以上各品种检出的病毒种类数分别为13、10、10、8、3、3种,其中分布较广的为沙地葡萄茎痘相关病毒(GRSPaV)、葡萄斑点病毒(GFkV)和葡萄卷叶相关病毒3(GLRaV-3)。     

胶东半岛地区葡萄病毒病田间调查和血清检测

2008年8—9月对胶东半岛葡萄主产区15个葡萄园的病毒病发生及危害情况进行了田间调查,采集了4个酿酒葡萄品种共计44份葡萄样品,采用双抗体夹心酶联免疫吸附法进行病毒血清学检测。从样品中分别检出葡萄斑点病毒(GFKV)、葡萄卷叶病毒1(GLRaV-1)和葡萄卷叶病毒3(GLRaV-3),检出率分别为6.82%、2.27%和40.91%。蛇龙珠样品中3种病毒均被检出,总检出率达60.71%;赤霞珠样品中检出了葡萄卷叶病毒3和葡萄斑点病毒,总检出率为36.46%。蓬莱地区葡萄样品中3种病毒均被检出,检出率达55.56%,龙口地区病毒检出率也达到了52.17%。     

红实美草莓脱毒技术研究

以感染病毒的红实美草莓为材料.时试管苗热处理脱毒和试管苗热处理后茎尖培养脱毒的成活率和脱毒率效果进行研究.试验结果表明,试管苗热处理后茎尖培养脱毒能显著提高脱毒效果,比试管苗热处理脱毒效果好;其中剥离0.5～0.6 mm的茎尖培养成苗,试管苗0.5～1.0 cm高时40℃(4 h)～250C(20 h)变温处理4周,再次剥离0.5～0.6 mm茎尖培养的脱毒效果最好,成活率85.6%,脱毒率98.8%.     

间接酶联免疫吸附试验检测葡萄扇叶病毒的研究和应用

采用蛋白A抗体夹心和异种动物抗体夹心两种间接酶联免疫吸附试验(ELISA)直接检测葡萄叶片和试管苗中的葡萄扇叶病毒,使试验程序简化,灵敏度与双抗体夹心ELISA直接法相当或较高。检测结果表明,经检测的103样品,其中田间品种扇叶病毒带毒率高达74.3%,热处理试管苗为5.6%,国外引进的脱毒品种(系)也有17.7%带毒。     

3种葡萄卷叶伴随病毒RT-PCR检测

2010—2011年我们对河北省涿鹿、怀来、昌黎、宣化等县(区)以及北京市葡萄卷叶病的发生情况进行了调查,并对采集的葡萄植株样品用RT-PCR方法检测病毒种类。在检测的82个样品中,葡萄卷叶伴随病毒3号(GLRaV-3)的检出率为100.0%,葡萄卷叶伴随病毒1号(GLRaV-1)的检出率为17.1%,葡萄卷叶伴随病毒2号(GLRaV-2)的检出率为11.0%;病毒混合侵染的样品占总检测样品数的28.1%,其中葡萄卷叶伴随病毒1号、3号混合侵染样品占总检测样品数的17.1%,葡萄卷叶伴随病毒2号、3号混合侵染的样品占总检测样品数的11.0%,且在这些被病毒混合侵染的样品中,有2个样品被葡萄卷叶伴随病毒1号、2号、3号三重侵染。     

宁夏贺兰山东麓酿酒葡萄病毒病田间自然发病率调查及检测

对宁夏贺兰山东麓8个酿酒葡萄种植地区8个葡萄品种的病毒病田间自然发病情况进行调查,采用RT-PCR方法,检测了40份样品中GLRaV-1~5这5种葡萄卷叶伴随病毒的感染率。结果表明:宁夏贺兰山东麓酿酒葡萄主要病毒病有葡萄卷叶病、扇叶病和栓皮病,其中葡萄卷叶病尤为严重;不同酿酒葡萄种植区和品种间葡萄卷叶病的感染存在着差异,老葡萄种植区中品种间葡萄卷叶病发病率明显高于新葡萄种植区的品种;"蛇龙珠"和"黑比诺"是感染葡萄卷叶病毒的主要品种,发病率高达85.1%和52.7%;利用5种葡萄卷叶伴随病毒引物进行RT-PCR检测,检出3种病毒类型,且GLRaV-3的检出率最高,为87.5%。     

草莓病毒脱除方法的比较与评价

以感染病毒的草莓品种宝交早生为试材,利用多重RT-PCR同时检测SMoV和SMYEV技术,对茎尖培养、热处理、抗病毒药剂处理3种脱毒方法进行了比较和评价,以期为草莓脱毒苗培育提供重要参考.结果表明,0.2mn茎尖和0.5 mm茎尖都能够有效地脱除SMoV和SMYEV;热处理能够脱除草莓试管苗中的SMoV,但不能脱除SMYEv,39℃恒温处理30 d,SMoV脱除率达到63.0%;利巴韦林不能清除草莓植株体内的SMov和SMYEV.综合脱毒率和茎尖分化成苗率2个指标,认为0.5 mm茎尖培养是适宜的草莓病毒脱除方法.     

贺兰山东麓酿酒葡萄病毒病田间发生状况调查

2007—2009年对宁夏贺兰山东麓主要酿酒葡萄产区病毒病的田间发生状况进行了调查。明确了葡萄扇叶病(GFLV)和葡萄卷叶病(GLRaV)是该地区主要病毒类型,疑似病毒类型是葡萄茎痘病和葡萄栓皮病;葡萄卷叶病毒感染的主要品种是蛇龙珠,主要发病区域是广夏二基地;葡萄扇叶病毒感染的主要品种是西拉,主要发病区域是玉泉营地区。     

梨树苹果茎沟病毒的脱毒技术研究

１９９３—１９９６年,采用热处理材料茎尖培养及试管苗热处理方法,对１３个梨品种及矮化砧材料进行苹果茎沟病毒脱毒试验的结果表明,二者对茎沟病毒的脱除率分别较单纯茎尖培养高５７．０％和６２．４％。脱毒苗生根率和移栽成活率分别达７０％和８０％。     

利用茎尖培养获得无病毒葡萄再生株

<正> 实验证明,茎尖切块培养可获得脱掉卷叶(GLR)、黄斑(GYS)、斑点(GF)和夏季斑驳(G SM)等嫁接传染性病毒的葡萄再生株。该技术结合热处理,还能脱除扇叶病毒(GFLV)。茎尖培养在27/20℃变温条件下进行处理,总能获得脱掉GYS的再生株,但35℃处理却不能。文中对已获成功的体外脱毒的可能途径也做了讨论。引言检测结果表明:几种病毒类病害在澳大利亚当地葡萄(Woodham,Taylor＆Krake,1973;Krake＆Woodham1978)、及从其他国家引入的葡萄上都有发生。在澳大利亚,GLR与GYS是分布最广的两种,其他病害如GFLD,则在欧洲与美国比较严重。多数植株感染一种以上的病毒病,GLR与GYS的复合发生最为常见(Woodham et al.1973)。     

中国葡萄卷叶相关病毒7检测及基因变异分析

葡萄卷叶相关病毒7(grapevine leafroll-associated virus 7,GLRaV-7)是与葡萄卷叶病相关的重要病原物之一。为明确中国GLRaV-7分离物的基因序列变异,采用RT-PCR方法对采自中国15个省(市)、自治区的188份葡萄样品进行检测,检出率为24.5%(44/188)。对来源于42个GLRaV-7分离物的外壳蛋白(coat protein,CP)和15个分离物的热休克蛋白70(heat-shock protein 70,HSP70)基因进行克隆、测序。序列分析结果显示,来源于国内外GLRaV-7分离物的CP和HSP70基因的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为89.12%~100.00%和88.94%~100.00%、85.33%~100.00%和88.97%~100.00%。基于CP和HSP70基因序列构建的进化树,分别将GLRaV-7分离物划分为6个和5个明显区分的组群。Gp3、Gp4和Gp5仅由中国分离物组成。本研究中初次分析国内外GLRaV-7分离物的CP和HSP70基因序列变异,可为进一步开展GLRaV-7分子检测的研发及不同变种的致病性研究提供依据。     

冬种马铃薯脱毒试管苗的培育技术研究

本研究针对惠州市冬种马铃薯出现卷叶病毒感染的现状,利用茎尖培养技术培养育脱毒的试管苗,并应用RT-PCR技术检测马铃薯试管苗的脱毒情况,为本地繁育种薯提供技术依据。     

茎尖培养等处理脱除梨病毒的技术研究

以梨茎尖培养、热处理＋茎尖培养、试管苗热处理＋茎尖培养３个处理，对适于北方栽培的３个梨矮化砧和７个梨品种进行脱除茎沟病毒和褪绿叶斑病毒试验。经１９９３—１９９５年对３个处理的试管苗用室内血清快速诊断法检测表明，茎沟病毒和褪绿叶斑病毒的平均脱除率，茎尖培养处理分别为７８．１％和９５．０％，热处理＋茎尖培养和试管苗热处理＋茎尖培养两个处理均为１００％。较详细叙述分析了茎尖培养技术及其效应。还讨论了３个脱除病毒处理的优缺点。     

酶联免疫检测在冰葡萄组培苗上的应用

葡萄是果树中感染病毒病最多的树种之一,种类多,分布广,危害大.现发现的葡萄病毒病20个属55种,我国鉴定明确的葡萄病毒总共有6种.北冰红冰葡萄发现有四种主要病毒,葡萄卷叶病毒(GLRaV)、葡萄花叶病(GCMV)、葡萄扇叶病毒(GFLV)、葡萄栓皮病毒(GCBD).本试验通过酶联免疫检测手段筛选无病毒种苗,进而达到扩繁和工厂化生产北冰红脱毒苗的目的.     

培养因子对葡萄茎尖丛生芽诱导的影响初探

葡萄茎尖培养无毒苗不仅加快优良品种的繁殖和推广速度,且为发展无病毒试管苗开辟了新途径.     

柑桔茎尖嫁接技术的改进

对常规柑桔茎尖嫁接脱毒技术作了改进,将原有5个步骤(砧木种子剥去种皮播于试管培养基—茎尖嫁接—嫁接苗试管培养—转接—转接苗培育)缩减为3个步骤(砧木种子不剥种皮播于培养土—茎尖嫁接—移栽),从而完全省去了试管培养过程。     

山东省葡萄几种主要病毒病调查及检测研究

对采自山东省不同葡萄园类别的葡萄样品,采用PTA-ELISA法和Dot-ELISA法对葡萄茎痘相关病毒(GRSPaV)进行了检测,采用DAS-ELISA法对葡萄卷叶病的3个毒原(GL-RaV-1-、2-、3)进行了检测。GRSPaV检测结果表明:检测的61个品种518个样品,阳性样品率33.6%,阳性品种率73.8%,其中资源圃样品阳性率32.7%,生产园样品阳性率34.0%。对检测到阳性样品辅以RT-PCR法验证,2对引物均扩增出了预期片段,分别为解旋酶基因340 bp片段、CP基因842 bp片段。GLRaV-1-、2-、3的检测结果表明:鲜食品种3种病原的阳性样品率分别为33.7%、7.1%、62.2%,酿酒品种阳性样品率分别为35.1%、16.2%、54.1%,综合3种病毒的阳性样品率为76.3%,品种感染率87.7%。通过该类研究对推动国内葡萄无毒化生产有重要意义。